專利名稱：一種β－興奮劑克侖特羅免疫親合柱及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于食品安全領域中違禁農獸藥檢測分析技術領域。具體而言，本發明涉及一種β-興奮劑-克侖特羅免疫親合層析柱其制備方法及其用途。
背景技術：
克侖特羅(Clenbuterol)俗名瘦肉精，屬于β2-受體興奮劑，曾經作為治療哮喘的藥物，目前被非法用于畜牧生產中，其不易在動物體內代謝，具有累積殘留毒性，曾在國內外引起多次中毒事件。
當人食用了殘留有“瘦肉精”畜產品，出現嚴重的中毒反應，癥狀表現為骨骼肌收縮增加，破壞快縮肌纖維與慢縮肌纖維之間的融合，引發肌肉震顫，四肢和肌肉尤為明顯，其他中毒癥狀包括心動過速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、惡心和暈眩等，嚴重危害人體健康。因此我國嚴禁此類藥物在飼料和動物飲用水中使用。但是由于利益驅使，在畜牧業生產中仍有非法使用。鑒于此，對動物性食品中“瘦肉精”殘留進行嚴格檢測是非常必要的。
但是，目前所用的確證方法對樣品要求高，前處理復雜，目前其提取方法均采用化學方法，不適應快速簡單的要求，限制了監測的效率。實際工作中，由于生物樣本的成分復雜，而且大多數取樣量很少，這對分析方法的特異性和靈敏度提出了很高的要求。因此，有必要建立一種操作快捷，且具有很高的特異性和靈敏度的方法。
免疫親和層析技術是一種將免疫反應和層析技術相結合的分析方法，在提純物質上是一項效率高、提純物質純度高、快速的技術，可以使免疫檢測技術(如ELISA等)和層析技術在特異性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補，避免了免疫分析法直接測定樣品的不足。
免疫親和柱是上個世紀90年代在分析領域中得到應用的技術，但用免疫親和柱提取樣品中的克侖特羅尚未見報道。因此，本發明人通過大量試驗，研制成功了一種具有高特異性和靈敏度且操作快捷的克侖特羅免疫親合柱。
發明內容
本發明目的是提供一種快速提取β2-興奮劑-克侖特羅的免疫親合柱及其制備方法和用途。
本發明的原理是根據抗原抗體的特異性反應和可解離的特性，用β2-受體興奮劑-克侖特羅抗體提取食品中的β2-受體興奮劑克侖特羅殘留。
一方面，本發明提供了一種制備克侖特羅免疫親合柱的方法，該方法包括下列步驟a)將克侖特羅特異性抗體與溴化氰活化的Sepherose 4B膠混合，轉鼓攪拌，偶聯過夜；燒結玻璃濾器抽濾偶聯膠，PBS洗脫未結合抗體，每次5毫升，洗4次；用1M乙醇胺封閉未結合位點，加過量乙醇胺孵育2.5小時，抽濾乙醇胺，用偶聯緩沖液抽洗，然后再用HAC，Tris-Hcl緩沖液交替洗滌共4次，每次5ml；b)將偶聯后的膠裝入親和層析塑料柱中，裝注1ml/柱，稍用力壓緊，即得所述的克侖特羅免疫親合柱。
在本發明的一個優選實施方案中，所述的克侖特羅免疫親合柱的制備方法具體操作為取Sepherose 4B(100-120目)濕重4g(6ml)，用0.1M pH9.5 Na2CO3溶液浸泡4小時。通風廚中稱取溴化氰0.8g溶于1.2ml Na2CO3(2g溶液3ml緩沖液)，電磁攪拌10分鐘。冰浴電磁攪拌下，將溴化氰溶液加入Sepherose4B中，2分鐘內完成，滴加2N NaOH，使pH值保持在11，冰浴反應10分鐘。
將反應后的Sepherose 4B倒入布氏漏斗中，用預冷的Na2CO3溶液4-10℃洗2-3分鐘內完成，抽洗25倍體積的液體準備交聯蛋白。
4℃下，將實施例1制備的抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)溶液與溴化氰活化的Sepherose4B膠混合，轉鼓攪拌，偶聯反應過夜。
燒結玻璃濾器抽濾偶聯膠，PBS洗脫未結合抗體，每次5毫升，洗4次。分別測定抗體含量。
用1M乙醇胺(ethanolamine)封閉未結合位點，加過量乙醇胺孵育2.5小時。抽濾乙醇胺，用偶聯緩沖液抽洗。然后再用交替的HAC，Tris-Hcl緩沖液洗4次，每次5ml。
最后，將偶聯后的膠裝入親和層析塑料柱中，裝注1ml/柱，稍用力壓緊，即得到本發明所述的克侖特羅免疫親合柱。
另一方面，本發明提供了一種克侖特羅免疫親合柱，該免疫親合柱包括偶聯有克侖特羅特異性抗體的Sepharose 4B與裝載該親和材料的塑料柱。
其中所述的克侖特羅特異性抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。本發明所述的克侖特羅特異性抗體通過下述方法制備1)按小分子半抗原的偶聯方法制備克侖特羅與載體蛋白偶聯物；以及，2)用該偶聯物作為免疫原免疫動物(例如，兔)，分離血清，純化得到多克隆抗體；或者3)免疫小鼠，通過雜交瘤技術獲得單克隆抗體；4)用不同載體蛋白的偶聯物為包被原用于檢測抗體質量。
其中所述的載體蛋白包括但不限于，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、卵清蛋白和鑰孔銅蘭蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)。所述的克侖特羅與載體蛋白的偶聯物采用重氮化法、戊二醛法、活性酯法或多元酸酐法與混合酸酐法聯合方法偶聯。
本發明所述免疫親和柱的保存條件為0.01％硫柳汞鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，4℃保存。
另外，為方便現場應用，本發明所述免疫親合柱還可以進一步包括上樣緩沖液、淋洗液及洗脫液。
在本發明的一個優選實施方案中，所述的上樣緩沖液為PBS(0.02MPB-0.05MNaCl，PH7.2)，所述的淋洗液為PBST(0.02MPB-0.05MNaCl-0.2％Tween20，PH7.2)；所述的親合柱洗脫液為甲醇/1M乙酸(V/V為97/3)。
另一方面，本發明提供了一種克侖特羅免疫親合柱的使用方法，該方法包括a)取出4℃保存的免疫親和柱及上樣緩沖液、淋洗液及洗脫液，回至室溫，用上樣緩沖液充分淋洗親和柱，除去儲存Buffer中含的蛋白和防腐劑；b)將處理好的待檢樣品用上樣緩沖液稀釋至所需體積，上樣，上樣液滴干后，淋洗液淋洗柱體，棄去，吸耳球吹干柱內溶液；c)用洗脫液洗脫特異性結合的克侖特羅，收集洗脫液，保存待檢。
本發明使用飼料、豬肉及生豬尿液進行了回收率實驗，結果表明克侖特羅免疫親合柱的回收率在80％-110％之間，回收率達到了分析方法的回收率要求。
因此，另一方面，本發明提供了所述克侖特羅免疫親合柱在提取飼料以及動物源性產品和動物代謝物中克侖特羅殘留的用途。
一個具體實施方案中，所述的動物源性產品為豬肉。
另一個具體實施方案中，所述的動物代謝物為豬尿。
提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，而決不對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。
實施例實施例1抗克侖特羅多克隆抗體的制備1.1抗克侖特羅多克隆抗體的制備參考現有技術中偶聯物合成方法(Itaru Yamamoto，Kohji Iwata Enzyme immunoassay forclenbuterol，an β2-adrenergic stimulant Journal of Immunoassay，3(2)，155-171(1982))，合成克侖特羅-載體蛋白偶聯物。具體操作如下，稱取鹽酸克侖特羅31.3mg(約0.1mmol)，溶解于4ml去離子水中，用1M鹽酸調pH值至1.5-2，4℃黑暗條件下逐滴加入0.1M的NaNO2，不停攪拌反應30分鐘，用KI淀粉試紙檢驗，直至試紙變灰藍色后停止反應，用氨基磺酸銨除去多余的NaNO2，得到重氮化的克侖特羅。
取適量重氮化的鹽酸克侖特羅溶液逐滴加入到10ml、0.1M pH 7.5冰冷載體蛋白PB溶液中，半小時內加完，反應過程中用1M的氫氧化鈉溶液使pH保持7.5，反應后4℃放置過夜。載體用量BSA100mg，KLH50g。偶聯物過SephadexG-25M層析柱提純。用紫外吸收法測定載體濃度作為偶聯物濃度。提純的偶聯物加等量甘油-20℃保存。
選擇健康、無病、雄性、體重1.5kg純種新西蘭白兔5只。首免用注射器對抽法將弗氏完全佐劑與免疫原按1∶1混合成油包水的乳濁液，每只兔0.25mg免疫原，背部皮下多點注射，注射劑量多點平均分配。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑，劑量、方法同首免。從第三次免疫開始，免疫后10天，耳緣靜脈取血1ml，室溫凝固2h后4℃過夜，8000r/min分離血清，用以檢測抗體效價。效價不再升高時，不加佐劑末次免疫(第八次)后7天，頸動脈放血，分離出抗全血清，用40％的飽和硫酸銨溶液沉淀，得粗多克隆抗體，然后用DE-52離子交換層析分離除去其他血清蛋白，得純多克隆抗體。
通過間接ELISA和間接競爭ELISA測定，結果表明本發明制備的多克隆抗體具有很高的效價和良好的特異性。
1.2抗克侖特羅單克隆抗體的制備1.2.1克侖特羅的重氮化在一試管中，取鹽酸克侖特羅溶于去離子水中，以1M鹽酸將pH調至1.5，在黑暗4℃條件下緩慢滴加亞硝酸鈉的去離子水并時時攪拌。反應混合物放置30分鐘。
1.2.2重氮化的克侖特羅與HAS的偶聯將上述溶液中緩緩加入到BSA的0.1mol/L PB(pH7.5)中，反應過程中用1M的氫氧化鈉溶液使pH保持7.5，反應后4℃放置過夜。
SephadexG-25M凝膠進一步層析柱去除小分子1.2.3免疫動物及細胞融合 對8周齡雌性Balb/c小鼠(體重18～22g)，首次免疫用100μgCL-BSA與等量福氏完全佐劑混勻，腹腔注射。3周后第一批用10μgCL-BSA脾內注射，3天后取脾融合。第二批再用100μgCL-BSA與等量福氏不完全佐劑混勻后，腹腔注射追加免疫，3周后用10μg CL-BSA脾內注射，3天后按常規方法取脾融合。當鏡檢雜交瘤克隆生長達1/3～1/2視野時，取上清液進行篩選。
1.2.4雜交瘤篩選及抗體檢測 以CL-BSA為包被抗原，用間接非競爭性ELISA法篩選分泌抗CL抗體的細胞孔，用間接競爭抑制性ELISA法確證。以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細胞培養的上清液為陰性對照，陽性細胞孔的判定標準為(A試驗-A空白)/(A對照-A空白)≥2.1。
1.2.5雜交瘤細胞的克隆化 采用培養瓶內準確計數稀釋法，將陽性克隆細胞吹勻，取一微滴至培養瓶內，倒置顯微鏡下準確計數細胞個數，稀釋為70個/ml，再取1ml稀釋20倍，接種入96孔培養板中進行亞克隆。直至所有細胞孔的培養上清均呈陽性為止。
1.2.6單克隆抗體的生產 采用動物體內誘生單克隆抗體的方法。吹打培養的雜交瘤細胞，1000r/min離心10min，棄上清，用生理鹽水將雜交瘤細胞懸浮混勻，并將細胞數調至2×106/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml雜交瘤細胞，并同時于對側腹腔注射0.5ml降植烷和不完全福氏佐劑混合物(1∶1混合)，14天后收集腹水。
1.2.7單克隆抗體的純化 采用硫酸銨沉淀法對腹水進行純化或用離子交換法提純。
實施例2用Sepherose 4B作基質的克侖特羅免疫親合柱制備本實施例是用Sepherose 4B作基質的克侖特羅免疫親合柱的制備取Sepherose 4B(100-120目)濕重4g(6ml)，用0.1M pH9.5 Na2CO3溶液浸泡4小時。通風廚中稱取溴化氰0.8g溶于1.2ml Na2CO3(2g溶液3ml緩沖液)，電磁攪拌10分鐘。冰浴電磁攪拌下，將溴化氰溶液加入Sepherose 4B中，2分鐘內完成，滴加2N NaOH，使pH值保持在11，冰浴反應10分鐘。
將反應后的Sepherose 4B倒入布氏漏斗中，用預冷的Na2CO3溶液4-10℃洗2-3分鐘內完成，抽洗25倍體積的液體準備交聯蛋白。
4℃下，將實施例1制備的抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)溶液與溴化氰活化的Sepherose 4B膠混合，轉鼓攪拌，偶聯反應過夜。
燒結玻璃濾器抽濾偶聯膠，PBS洗脫未結合抗體，每次5毫升，洗4次。分別測定抗體含量。
用1M乙醇胺(ethanolamine)封閉未結合位點，加過量乙醇胺孵育2.5小時。抽濾乙醇胺，用偶聯緩沖液抽洗。然后再用交替的HAC，Tris-Hcl緩沖液洗4次，每次5ml。
最后，將偶聯后的膠裝入親和層析塑料柱中，裝柱，1ml/柱，稍用力壓緊，即得所述的克侖特羅免疫親合柱。
保存條件0.01％硫柳汞鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，4℃保存。
實施例3用葡聚糖作基質的克侖特羅免疫親合柱的制備本實施例是用葡聚糖作基質的克侖特羅免疫親合柱的制備取葡聚糖(100-120目)濕重4g(6ml)，用0.1M pH9.5 Na2CO3溶液浸泡4小時。通風廚中稱取過碘酸鈉0.8g溶于1.2ml Na2CO3(2g溶液3ml緩沖液)，電磁攪拌10分鐘。冰浴電磁攪拌下，將過碘酸鈉溶液加入葡聚糖中，2分鐘內完成，滴加2N NaOH，使pH值保持在11，冰浴反應10分鐘。
將反應后的葡聚糖倒入布氏漏斗中，用預冷的Na2CO3溶液4-10℃洗2-3分鐘內完成，抽洗25倍體積的液體準備交聯蛋白。
4℃下，將實施例1制備的抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)溶液與過碘酸鈉活化的葡聚糖膠混合，轉鼓攪拌，偶聯反應過夜。
燒結玻璃濾器抽濾偶聯膠，PBS洗脫未結合抗體，每次5毫升，洗4次。分別測定抗體含量。
用1M乙醇胺(ethanolamine)封閉未結合位點，加過量乙醇胺孵育2.5小時。抽濾乙醇胺，用偶聯緩沖液抽洗。然后再用交替的HAC，Tris-Hcl緩沖液洗4次，每次5ml。
最后，將偶聯后的膠裝入親和層析塑料柱中，裝柱，1ml/柱，稍用力壓緊，即得所述的克侖特羅免疫親合柱。
保存條件0.01％硫柳汞鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，4℃保存。
實施例4用實施例2或3所述方法制備的克侖特羅免疫親合柱提取飼料中克侖特羅殘留。
取空白(事先經檢測確定為克侖特羅陰性)飼料6份，每份5g；取3份，每份加入克侖特羅，使其添加濃度為20mg/kg，另外3份作為空白對照。
將上述飼料樣本用80％甲醇抽提，取一定量的抽提液氮氣吹干后用上樣緩沖液溶解，準備上親合柱。
將從4℃冰箱中取出的免疫親和柱及所有試劑室溫放置1小時，用上樣緩沖液充分淋洗親和柱5ml×6次，除去儲存Buffer中含的蛋白和防腐劑。
將待檢飼料的空白和添加樣品各5ml，循環上樣5次，(接取上樣流出液再次上此親和柱)。上樣液滴干后，用淋洗液淋洗5次，每次1ml，吸耳球吹干柱內溶液。
先加1ml洗脫液浸泡親合柱10分鐘，然后用吸耳球吹干柱內溶液；再加1ml洗脫液浸泡3分鐘，最后用2ml洗脫液分4次洗脫，即每次0.5ml。整個洗脫過程共用洗脫液4ml。
GC/MS(NY/XQ421-2003)標準方法檢測克侖特羅洗脫液含量。
測定飼料添加樣品的克侖特羅含量為90-110ng之間，因為此親合柱的柱容量為110ng，結果表明該親合柱滿足提取要求。
實施例5取陰性(事先經檢測確定為克侖特羅陰性)豬肉12份，每5份5g；先將豬肉勻漿后，取9份，分3組，每組添加克侖特羅濃度分別為50ug/kg、80ug/kg、100ug/kg作為陽性樣品，另外3份作為陰性對照。
將上述豬肉樣本用10ml80％甲醇溶解，離心取上清，氮氣吹干后用上樣緩沖液溶解，準備上親合柱。
將從4℃冰箱中取出的免疫親和柱及所有試劑室溫放置1小時，用上樣緩沖液充分淋洗親和柱5ml×6次，除去儲存Buffer中含的蛋白和防腐劑。
將待檢陰性豬肉提取液和添加樣品提取液各5ml，循環上樣5次，(接取上樣流出液再次上此親和柱)。上樣液滴干后，用淋洗液淋洗5次，每次1ml，吸耳球吹干柱內溶液。
先加1ml洗脫液浸泡親合柱10分鐘，然后用吸耳球吹干柱內溶液；再加1ml洗脫液浸泡3分鐘，最后用2ml洗脫液分4次洗脫，即每次0.5ml。整個洗脫過程共用洗脫液4ml。
GC/MS(NY/XQ421-2003)標準方法檢測克侖特羅洗脫液含量。
測定豬肉添加樣品的平均回收率為90-110％之間，表明該方法滿足分析方法要求。
實施例6用實施例2或3所述方法制備的克侖特羅免疫親合柱提取生豬尿樣中克侖特羅免疫殘留。
將已知空白(事先經檢測確定為克侖特羅陰性)尿樣12份，每5份10ml，取其中9份，分3組，每組添加克侖特羅濃度分別為1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg作為陽性樣品，另外3份作為陰性對照。將上述樣品4000rpm離心20分鐘，每個樣品取3ml上清，用1M NaOH調pH致7.1～7.3備用。用上樣緩沖液將上述處理后的尿樣稀釋10倍，從中各取5ml，準備過柱。
將從4℃冰箱中取出的免疫親和柱及所有試劑室溫放置1小時，用上樣緩沖液充分淋洗親和柱5ml×6次，除去儲存Buffer中含的蛋白和防腐劑。
將處理好的尿樣各5ml，循環上樣5次，(接取上樣流出液再次上此親和柱)。上樣液滴干后，淋洗液洗5次，每次1ml，吸耳球吹干柱內溶液。
先加1ml洗脫液浸泡親合柱10分鐘，然后用吸耳球吹干柱內溶液；再加1ml洗脫液浸泡3分鐘，最后用2ml洗脫液分4次洗脫，即每次0.5ml。整個洗脫過程共用洗脫液4ml。
GC/MS(NY/XQ421-2003)標準方法檢測克侖特羅洗脫液含量。
測定陽性添加尿樣的平均回收率為克侖特羅80-110％之間，表明該方法滿足分析方法要求。
權利要求
1.一種制備克侖特羅免疫親合柱的方法，該方法包括下列步驟a)將克侖特羅特異性抗體與溴化氰活化的Sepherose4B膠混合，用轉鼓攪拌，偶聯過夜；燒結玻璃濾器抽濾偶聯膠，PBS洗脫未結合抗體，每次5毫升，洗4次；用1M乙醇胺封閉未結合位點，加過量乙醇胺孵育2.5小時，抽濾乙醇胺，用偶聯緩沖液抽洗，然后再用HAC，Tris-Hcl緩沖液交替洗滌共4次，每次5ml；b)將偶聯后的膠裝入親和層析塑料柱中，裝注1ml/柱，稍用力壓緊，即得所述的克侖特羅免疫親合柱。
2.根據權利要求1所述方法制備的克侖特羅免疫親合柱，該免疫親合柱包括偶聯有克侖特羅特異性抗體的Sepharose4B與裝載該親和材料的塑料柱。
3.權利要求2所述的克侖特羅免疫親合柱，其中所述的克侖特羅特異性抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
4.權利要求2或3所述的克侖特羅免疫親合柱，其進一步還包括上樣緩沖液、淋洗液及洗脫液。
5.權利要求4所述的克侖特羅免疫親合柱，其中所述的上樣緩沖液為PBS，所述淋洗液為PBST，所述的洗脫液為體積比為97∶3的甲醇/1M乙酸混合物。
6.權利要求2所述的克侖特羅免疫親合柱的使用方法，該方法包括a)取出4℃保存的免疫親和柱及上樣緩沖液、淋洗液及洗脫液，回至室溫，用上樣緩沖液充分淋洗親和柱，除去儲存Buffer中含的蛋白和防腐劑；b)將處理好的待檢樣品用上樣緩沖液稀釋至所需體積，上樣，上樣液滴干后，淋洗液淋洗柱體，棄去，吸耳球吹干柱內溶液；c)用洗脫液洗脫特異性結合的克侖特羅，收集洗脫液，保存待檢。
7.權利要求2所述的克侖特羅免疫親合柱在提取飼料以及動物源性產品和動物代謝物中克侖特羅殘留的用途。
8.權利要求7所述的用途，其中所述的動物代謝物為尿液。
全文摘要
本發明公開了一種提取β2一興奮劑(克侖特羅)免疫親合柱。本發明所提供的免疫親合柱用來提取飼料和畜產品中的違禁藥物β2－興奮劑(克侖特羅)，包括β2－興奮劑(克侖特羅)特異性抗體、偶聯有β2－興奮劑(克侖特羅)特異性抗體Sepharose4B、裝載親和材料的塑料柱、上樣緩沖液、淋洗液及洗脫液。本發明的β2－興奮劑(克侖特羅)免疫親合柱使用方便，具有高特異性、可快速提取飼料及畜產品中殘留的β2－興奮劑(克侖特羅)。
文檔編號G01N33/558GK1979158SQ200610164979
公開日2007年6月13日 申請日期2006年12月11日 優先權日2006年12月11日
發明者熊勇華, 張波, 王迪, 楊曉慧, 楊曙明, 于洪俠 申請人:北京中德大地食品安全技術開發有限責任公司