專利名稱：：診斷原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌的方法專利說明診斷原發性惡性肝肝瘤肝細胞癌的方法交叉參考相關申請〖0002本申請要求2005年11月28日申請的U.S.臨時申請No.60〃40,223的利益，將其公開的內容引入本文作為參考。發明背景HCC的單個最重要的胂瘤標記物為a-胎兒球蛋白(AFP)。用血清AFP水平和超聲檢查法檢測的HCC已被推薦用于肝硬化的患者。盡管4艮好地建立起了在HCC的篩查和診斷過程中本全測血清AFP水平，但是其主要缺點是血清AFP對早期癌的檢測不靈敏。存在其它有希望的腫瘤標記物，例如脫-y凌基凝血素、乒豆凝集素活性AFP(lensculinarisagglutinin-reactiveAFP)、胰腺炎相關蛋白和胰島素樣生長因子-1，但是這些標記物中沒有一種被批準用于臨床應用。0006人類肝細胞生長因子(HGF)第一次描述為肝營養因子是在八十年代早期，發現于部分肝切除的大鼠血漿中，其在1986-1987從患有暴發性肝功能衰竭的患者和大鼠血小板中純化。已顯示HGF為與散射因子和肺瘤細胞毒素因子相同的蛋白，現在已知其為光鐠生長因子，其不僅剌激肝細胞生長，還刺激許多其它類型的上皮和內皮細胞生長。在人類中，在嚴重肝病例如暴發性肝功能衰竭期間，HGF的血漿水平增長至高于10ng/ml,當患者的疾病康復后，其快速降低至正常水平。在不特別嚴重的肝損傷例如急性肝炎中，血漿中HGF的水平增加至0.5-1ng/ml,其接近用于刺激培養基中人類肝細胞DNA合成的半數最大濃度。因此，認為HGF參與控制肝再生。也表明HGF與包括HCC的某些人類癌癥有關。白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-IO)為由一定范圍的細胞生成的多功能細胞因子，在宿主防御機制和調節免疫應答中起重要作用。最近，表明IL"6由表皮細胞和表皮樣癌細胞系以及其它上皮細胞瘤生成，所迷其它上皮腫瘤包括膀胱癌、腎細胞癌和卵巢癌。在患有多發性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、頭癌和頸部癌、卵巢癌和膽管癌的患者中發現血清IL-6水平增加。在患有晚期HCC的患者中觀察到高血清IL-6水平(Malaguarnera等人，"Rolede卩interleukine6danslecarcinomahepatocellulaire，"(1996)81///Cancer83:379-384)。根據本發明的另一個實施方案，提供鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的方法，包括測定患有肝病的患者血液中白細胞介素"6(IL《)的水平，其中高于正常水平的IL-6水平為HCC的診斷指示。0013]根據本發明的另一個實施方案，提供鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的方法，包括確定患有肝病的患者血液中白細胞介素-10(IL-10)的水平，其中高于正常水平的IL-10水平為HCC的診斷指示。發明詳述如本文使用的術語"高于正常水平的水平"指高于在正常個體中觀察到的標記物水平的標記物水平，所述正常個體即未患有HCC的個體。對某些標記物而言，通常在個體血液中不存在或存在很低水平的標記物。而對其它人而言，通常在血液中存在可檢測到的水平。因此，該術語指顯著高于在個體中發現的常規水平的水平。術語"顯著地(明顯地)"指統計學顯著性，通常指存在高于正常或更高標記物濃度的兩個標準偏差(SD)。0018用于測定本發明的腫瘤標記物即IL-6和IL-10水平的測定方法必須對能夠測定到的標記物水平非常靈敏，也必須是高度特異性的，所迷水平指高于能夠高于感興趣的濃度范圍的水平。適宜的方法為免疫測定技術，例如sandwich醉聯免疫測定(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、竟爭性結合測定、均質測定(homogeneousassays)和非均質測定(heterogeneousassays〉。可利用任意適宜的免疫測定法，包括市售的那些。本文不需要廣泛討論已知的免疫技術，因為這些技術是本領域人員已知的。〖0019在本發明一個優選的實施方案中，患者血液中IL"6或IL-10的7jc平可通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)確定。00201通常，sandwichELISA包括下述步驟1.制備表面，其與已知量的抗體結合；2.將包含靶向抗原的樣品應用于平皿；3.洗滌平皿，以便除去未結合的抗原；4.應用也對靶向抗原有特異性的酶聯抗體；5.洗滌平皿，以便除去未結合的抗體；6.應用被酶轉化成熒光信號的化學藥品；和7.觀察結果焚光信號指樣品包含可檢測量的抗原。0021根據本發明，可重排用于EIJSA的測定裝置以提供半定量或定量結果。術語"半定量"指鑒別高于升高的標記蛋白值的水平和沒有高于閾值的水平。0022在本發明優選的實施方案中，用于IL"6或IL-10的ELISA為半定量的，靈敏度為3pg/mL。在另一方面，本申請提供鑒別HCC與其它肝病的方法，包括測定肝病患者血液中IL-6或IL-10水平，其中水平高于正常水平為HCC的診斷指示。0024與前述結果一致，下述實施例中描述的結果表明不僅在HCC患者中，而且在非HCC腫瘤或慢性肝炎患者中，血液HGF水平升高(即，血液HGF水平高于正常水平)。因此，測定HGF水平不能用于鑒別HCC與其它肝病。在本發明優選的一個實施方案中，疑為患有HCC的患者具有高血漿水平的HGF，優選高于1000pg/mL。本發明的方法特別用于診斷早期HCC,當患者仍舊具有低血清水平的AFP時。在本發明的一個優選的實施方案中，疑為患有HCC的患者具有低血清水平的AFP，優選低于20ng/mL。0026根據本發明的診斷方法可包括由醫學專業人員慎重確定IL-6、IL-10或兩者的水平。0027]本申請還可通過下述實施例來進一步闡述，提供這些實施例用于證實的目的，而不是限定。實施例受試者和方法受試者和診斷0028在2002年10月至2004年9月的2年期間，可能總共有128名成年人參與了這項研究。根據不同的臨床特征將這些受試者分為4組第1組包括29名具有正常肝功能的健康受試者；第2組包括50名具有已知慢性乙型肝炎或丙型肝炎史但沒有肝腫瘤的受試者；第3組包括15名良性肝血管瘤患者、6名肝轉移至結腸或卵巢的患者，和2名患有膽管癌的患者；第4組包括26名患有HCC的受試者。測定所有研究受試者的血清AFP和血漿IL"6、IL-10、HGF水平。根據Helsinki公告將該研究的性質完全解釋給受試者，該研究符合目前倫理準則。0029如果患者對乙型肝炎表面抗原(HBsAg，RIAkits,AbbottLaboratories,NorthChicago,IL，USA)血清反應陽性，則認為患者患慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，如果患者對抗KCV抗體(anti-HCV)血清反應陽性，則i人為患者患丙型肝炎病毒(HCV)感染，其通過二代酶免疫測定(AbbottLaboratories,IL)至少兩次且測定至少6個月。患有慢性乙型肝炎或丙型肝炎感染的患者血清中肝酶水平正常或輕微升高(增長小于正常上限的兩倍)。在超聲檢查法和造影劑強化的X線斷層攝影術掃描中，診斷肝血管瘤具有典型的特征。核磁共振成像用于確定可疑病例中是否存在肝血管瘤。所有診斷患膽管癌或單生的轉移性肝癌患者經過肝腫瘤外科切除和證實的組織學診斷。在26名HCC患者中，22名經過外科切除且有HCC的病理學證據；剩余的4名患者已在超聲波檢查、計算機體層4聶影掃描和肝血管造影中建立診斷有特征性診斷發現，伴有血清AFP水平升高，這些診斷符合EuropeanAssociation用于肝的研究的診斷標準，其也在臺灣應用(Bruix等人，EASLPanelofExpertsonHCC.Clinicalmanagementofhepatocellularcarcinoma:conclusionsoftheBarcelona-2000EASLconference.(2001)JHepato/35:421"430;andYeh等人，HepaticresectionforhepatocellularcarcinomainTaiwan.(2002)￡wrJSi/rgOnco/28:652-6)。測定IL-6、IL-10和HGF0030在診斷和外科切除時，采集所有研究受試者的血漿樣品。將樣品保存在-8crc下，在測定細胞因子水平前立即解凍。才艮據生產商的使用說明，使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定IL-10和IL>6水平(e-Biosc'舊nce，SanDiego,CA，USA),并使用ELISA試劑盒測定HGF水平(DuoSet，R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN，USA)。對所有細胞因子而言，每次反應使用一百毫升的血漿。對IL-6和IL-10而言，測定的靈敏度為3pg/mL,而對HGF而言，其為125pg/mL。認為低于這些水平下的血漿濃度不能檢測到。由沒有獲知臨床信息的實驗室人員獨立完成所有的測定。統計方法0031對分類數據使用卡方檢驗(Chi-squaredtest)或Fisher^準確測試(兩側(two-tailed))來。當適宜用于連續數據時，使用曼-懷二氏分類總數檢驗(Mann-Whitneyrankedsumtest)或克(魯斯卡爾)-瓦(利斯)二氏單向ANOVA檢驗(Kmskal-Wallisone-wayANOVA)。Pearson's相關分析用于評價AFP和細胞因子水平之間的關系，或腫瘤大小和細J包因子水平之間的關系。結果患HCC、非-HCC腫瘤、慢性肝炎患者和正常受試者中IL-6、IL-10和HGF的比較0032比較四組患者的細節顯示在表1中。僅在0-3%的正常受試者中觀察到IL"6或IL-103pg/mL)或高水平的HGF(>1000pg/mL)或AFP(>20ng/mL)的表達。在患HCC的患者中，分別為46%、50%和62%的他們具有可檢測到的IL"6、IL-10和AFP〉20ng/mL，相比的其他三組有0-16%的患者具有可檢測到的IL-6、IL-10和AFP(p值都小于《0.05)。對于HGF的表達而言，盡管60%的HCC患者具有的HGF水平>1000pg/mL，52%的慢性肝炎患者*=0.809)和35%的非一HCC肺瘤患者(p-0.154)也具有高HGF水平。對IL-6和IL-10而言，與正常受試者、患慢性肝炎和非HCC腫瘤患者相比，HCC組的患者具有顯著較高水平的HGF(p值都《0.05)。與正常受試者相比，HCC患者具有顯著較高的HGF水平；然而，在HCC和慢性肝炎組之間，或HCC和非HCC腫瘤組之間，HGF水平沒有顯著性差異(p值都>0.05)。表1.健康受試者、慢性肝炎患者、非HCC腫瘤患者和HCC腫瘤患者中IL-6、IL-10和HGF的檢測比較健康受試者慢性肝炎非-HCC腫瘤患者數量29502326年齡(歲)a41±1060±1556±1459±13男性45%72%70%69%IL-6b可檢測到的3%4%9%46%不可檢測到的967%96%91%54%IL-10C可檢測到的02%9%50%不可檢測到的100%■91%50%AFPd>20ng/mL016%4%62%<20ng/mL100%84%96%38%HGFe>1000pg/mL3%52%35%58%<1000pg/mL97%48%65%42%a:p-0.001;b:p<0.001;c:p<0.001;d:p<0.001;e:p<0.001.P值表示4組受試者之間的統計學差異。0033在99名慢性肝炎(第2組)患者、非HCC腫瘤患者(第3組)和HCC患者(第4組)中測定這些細胞因子對檢測HCC的靈敏度和特異性。IL-6、IL-10、HGF(>1000pg/mL)和AFP(〉20ng/mL)的靈敏度分別為46%、50%、58%和62%，特異性分別為95%、96%、530/。和88%。根據血清AFP進一步細化分析，顯示在表2中。具有低(〈20ng/mL)AFP水平的患者中，40。/o的10名HCC患者具有可檢測到的IL-6或IL-10,IL"6或IL-10的表達與存在的HCC明顯相關(分別地，p-0.005和0.001)。然而，HGF和HCC的表達之間沒有顯著性差異。相反，具有高^20ng/mL)AFP水平的患者中，所有細胞因子和HCC的表達之間沒有顯著性差異。表2.根據血清水平檢測99名HCC、慢性肝炎或非-HCC患者中的IL-6、IL-10和HGFYesNoAFP<20ng/mL(n=74)"L-6可檢測到的不可檢測到的blL-10可檢測到的不可檢測到的eHGF>1000pg/mL4366141663327737<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>我們以前的研究表明，與正常對照組相比，HCC患者中IL-6和IL-10水平升高，在外科手術后，該高水平通常降低。而且，高IL-10水平預示著經過外科手術治療后差的無瘤生存率(Chau等人，"Seruminterleukin-10butnotinterleukin—6isrelatedtoclinicaloutcomeinpatientswithresectablehepatocellularcarcinoma,"(2000)細S呵231:552-558)。在這項研究中，我們發現，與其它疾病范疇的患者相比，HCC患者中lU6和IL-10表達通常更高。令人感興趣地是，在具有低(<20ng/mL)AFP水平和不同肝病范疇的患者中，我們的數據表明IL-6和IL-10的表達，但不是HGF的表達，與HCC的存在密切相關。據估計，達75%的小HCC患者和20%的大HCC患者可能具有正常的血清AFP水平，其可能避開HCC檢測。在目前的研究中，39%(10/26)的HCC患者具有的血清AFP水平〈20ng/mL。由于在高危患者中HCC的診斷可能非常困難，其中這些患者具有低AFP水平或腫瘤模仿性HCC(tumorsmimickingHCC),我們的結果提出IL-6和IL-10有助于鑒別具有低AFP水平的HCC亞型患者，其可起補充性腫瘤標記物作用，并有助于這些患者的鑒別診斷。IL-6、IL-10和AFP與腫瘤大小的關系0038我們的結果也表明在HCC患者中IL-6、IL-10和AFP的表達密切相關。進一步支持IL"6和IL-10作為HCC的肺瘤標記物起作用的證據為大量的HCC患者顯著地更常見具有可檢測到的lU6和IL-10,然而腫瘤大小械j人為是與經過切除和肝移植的患者中AFP生成和總存活數有關的最主要因素。而且，在檢測HCC方面，IL-6、IL-10和AFP具有相當類似的診斷敏感性和特異性特征。縱而言之，我們的數據表明IL《和IL-10,以及AFP，也可用于HCC的腫瘤標記物。[0039應當理解，本領域那些技術人員在不背離其廣泛的發明概念下可以對上述實施方案進行改變。因此，可以理解，本發明并不限于公開的具體實施方案，而是意味著覆蓋如附加的權利要求定義的本申請的精神和范圍。[0040將上述提及的引證公開的內容4^P引入本文作為參考。權利要求1.一種確診疑為患有原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的患者中原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)存在的檢驗試劑，包括測定所述患者血液中白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組(ASSAYKIT)，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)的水平高于正常水平診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。2.根據權利要求l的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(IL-6)水平等于或高于3pg/mL診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)。3.根據權利要求l的檢驗試劑，其中所述患者具有低血清水平的a-胎兒球蛋白(AFP)。4.根據權利要求3的檢驗試劑，其中所述a-胎兒球蛋白(AFP)的血清水平低于20ng/mL之測定值。5.根據權利要求1的檢驗試劑，其中所述患者具有高血清水平的肝細胞生長因子(HGF)。6.根據權利要求5的檢驗試劑，其中所述肝細胞生長因子(HGF)的血漿水平為高于IOOOpg/mL之測定值。7.根據權利要求l的檢驗試劑，進一步包含測定所述患者血液中白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-10(IL-10)的水平高于正常水平診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。8.才艮據權利要求7的檢驗試劑，其中白細胞介素-10(IL-10)水平等于或高于3pg/mL診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-10(IL-IO)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)。9.確診疑為患有原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的患者中原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)存在的檢驗試劑，包括測定所述患者血液中白細胞介素-10(IL-10)的水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-l0(IL-10)的水平高于正常水平診斷為原發性惡性肝腫痼肝細胞癌(HCC)。10.根據權利要求9的檢驗試劑，其中白細胞介素-10(IL-IO)的水平等于或高于3pg/m診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組為利用得自所迷患者的血樣通過酶聯免疫吸附測定(BLISA)。11.根據權利要求9的檢驗試劑，其中所述患者具有低水平的a-胎兒球蛋白(AFP)。12.根據權利要求11的檢驗試劑，其中所述a-胎兒球蛋白(AFP)的血清水平低于20ng/mL之測定值。13.根據權利要求9的檢驗試劑，其中所述患者具有高水平的肝細胞生長因子(HGF)。14.根據權利要求3的檢驗試劑，其中所iilf細胞生長因子(HGF)的血漿水平高于1000pg/mL之測定值'15.根據權利要求9的檢驗試劑，還包括測定所述患者血液中白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)的水平高于正常水平診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。16.根據權利要求15的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(IL-6)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)。17.鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的檢驗試劑，包括測定患有肝病的患者血液中白細胞介素-6(IL-6)的的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)的水平高于正常水平診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。18.根據權利要求17的檢驗試劑，其中不同于原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的肝病選自慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝血管瘤、膽管癌和轉移性肝癌。19.根據權利要求17的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(IL-6)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發性慈性肝胖瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)。20.根據權利要求17的檢驗試劑，還包括測定所述患者血液中白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-10(IL-l0)的水平高于正常水平診斷為原發性惡性肝肺瘤肝細胞癌(HCC)。21.根據權利要求17的檢驗試劑，其中白細胞介素-IO(IL-IO)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定IL-10水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)。22.鑒別肝細胞癌(HCC)與其它肝病的檢驗試劑，包括測定患有肝病的患者血液中白細胞介素-10(IL-10)水平的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-10(IL-10)的水平高于正常水平診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。23.根據權利要求22的檢驗試劑，其中不同于原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)的其它肝病選自慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝血管瘤、膽管癌和轉移性肝癌。24.根據權利要求22的檢驗試劑，其中白細胞介素-10(IL-10)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-10(IL-(ELISA)。25.根據權利要求22的檢驗試劑，進一步包括測定所述患者血液中白細胞介素-6(IL-6)的測定套組，其中當所檢測出白細胞介素-6(IL-6)高于正常水平診斷為原發性惡性肝腫瘤肝細胞癌(HCC)。26.根據權利要求25的檢驗試劑，其中白細胞介素-6(1卜6)的水平等于或高于3pg/mL診斷為原發性惡性肝肺瘤肝細胞癌(HCC)，測定白細胞介素-6(IL-6)水平的測定套組為利用得自所述患者的血樣通過酴聯免疫吸附測定(ELISA)。全文摘要提供用于肝細胞癌(HCC)診斷的方法。該方法通過測定得自患者血漿樣品中的IL-6或IL-10的水平確診疑為患有HCC的患者中HCC的存在。也提供通過測定得自患有肝病的患者血漿樣品中的IL-6或IL-10的水平來鑒別HCC與其它肝病的方法。文檔編號G01N33/574GK101221178SQ20061016344公開日2008年7月16日申請日期2006年11月28日優先權日2006年11月28日發明者呂銘峰,蔣淑嬡申請人:創盛科技股份有限公司