專利名稱：煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法
技術領域：
本發明屬于檢測材料，尤其涉及一種煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙 條的制備方法。
技術背景煙草花葉病在1898年Beijerinck首次發現，是世界各產煙區的主要煙草病 害之一，20世紀40-60年代主要在美國、西歐等煙區流行，70年代以后，在我 國各煙區普遍發生，給煙草生產造成了巨大的經濟損失。煙草花葉病病原之一 煙草普通花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)的核酸是長度為6395 nt的正鏈 ssRNA，宿主范圍從三生煙、普通煙等煙類到新西蘭菠菜、天仙子、千日紅、蔓 陀蘿等蔬菜花卉不等，主要通過機械摩擦汁液和土壤中的病株殘體傳播，20 3(TC發病，溫度過高癥狀不顯著或不出現，溫度降低后又會重新出現癥狀。幼 苗和成株均可受害幼苗初侵染后，新葉的葉脈組織變淺綠色，呈半透明的"明 脈癥"，幾天后葉片形成黃綠相間的"花葉癥"；大田煙株受侵染后，首先在心葉 上發現"明脈"現象，爾后呈現花葉、泡斑、畸形、壞死等典型癥狀。目前煙草花葉病毒病的檢測方法有電鏡法和血清學法兩種。電鏡法是檢測 病毒最可靠最有效，主要有負染法和組織超薄切片法，可以直接觀察到病毒的 形態特征、內部結構及病毒混合感染的情況。血清學法需要制備完整病毒的抗 血清，用各種血清反應方法進行檢測。但這兩種方法都需要將樣品中病毒或核酸提取和純化，需要超高速離心機 以及電子顯微鏡等設備，雖然血清學法特異性比較強，但在病毒濃度較低時， 制備的抗血清效價不高,檢測效果不理想。因此需要有一個快速簡便、可靠性高 的檢測方法來進行檢測。發明內容本發明的目的是提供一種煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方 法，有這種試紙條可快速簡便地進行檢測，且可靠性高。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案 一種煙草普通花葉病毒田間 快速檢測試紙條的制備方法，包括制備抗體、制備膠體金、制備膠體金一抗體 結合物、制備硝酸纖維素膜和制備膠體金層析檢測試紙的步驟，在制備抗體的 步驟中，要制備兔多克隆抗體用無菌生理鹽水將煙草普通花葉病毒抗原稀釋為2mg/ml，然后加Freund's佐劑，第一次為完全佐劑，以后用不完全佐劑；抗
原注射量為0.1 0.2mg/kg，選用2~3Kg的兔子，采取靜脈注射方式，分三次完 成，每次注射抗原用量0.03 0.1mg,間隔時間為10d，末次注射10d后進行放血， 放血前動物禁食12h，采用耳靜脈放血40 60ml，收集后離心除去血細胞，純化 后零下20。C保存；并用同樣的方法制備羊抗兔抗體。在制備膠體金的步驟中，取1%氯金酸0.6ml在30ml超純水中加熱煮沸， 快速一次加入37-C預溫的1X檸檬酸鈉0.9ml，溶液由藍逐漸變為紫紅色，煮沸 3 5min，補水至30ml;冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀調pH至7.2~7.5, 然后用0.22pm濾膜進行過濾，制備20~30nm膠體金顆粒。在制備膠體金一抗體結合物的步驟中，取lmg純化的煙草普通花葉病毒抗 體，邊攪拌邊注入到50ml膠體金溶液中，室溫下攪拌lh，然后加10%牛血清 蛋白2ml，室溫下攪拌5min，再加10%聚乙二醇lml，室溫下攪拌5min, 12000-15000 rpm離心50min，沉淀溶于5ml保存液中，用0.45pm濾膜過濾，4°C 保存。在制備硝酸纖維素膜的過程中，將3ml膠體金-抗體結合物和3ml TBS緩沖 液混勻，放入硝酸纖維素膜(NC膜)浸泡10mln，取出在37。C烘箱中烤干，熱 合封口， 4'C保存備用；然后將煙草普通花葉病毒的兔多克隆抗體和羊抗兔抗體 分別用固相溶液稀釋成3mg/ml和lmg/ml，兩種抗體分別取lpl，依次點樣在 NC膜上，即檢測線和質控線，固相抗體NC膜在0.5。/。BSA封閉液中，37。C下 孵育lh后，洗滌液中洗2次，室溫下風干，4-8。C保存。在制備膠體金層析檢測試紙的步驟中，取一塊潔凈的PVC板，將包被的NC 膜固定在適當的位置上，將引水材料連接在NC膜的下端，吸水材料連接在NC 膜的上端，膠體金-抗體結合物硝酸纖維素膜置于引水材料下與NC膜銜接，用 切割機將組裝后的PVC板縱向切成6mm寬的測試條，將其裝入板殼即可。采用上述技術方案制備的煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條，檢測適 溫15 35。C，檢樣量0.1 0.3g的樣品，相當于葉面積大約3~5cm2;將煙葉在裝 有緩沖液的塑料袋中研磨后，將試紙條浸入，30min出結果；假陽性率低于1%。 可見本發明使用方便，特別適用于田間快速檢測，并且可靠性很高。
具體實施方式
實施例1:抗體的制備制備煙草普通花葉病毒兔多克隆抗體用無菌生理鹽水將抗 原即純化的TMV稀釋為2mg/ml，然后加Freimd's佐劑，第一次為完全佐劑， 以后用不完全佐劑。抗原注射量為0.1 0.2mg/kg，選用2 3Kg的兔子，采取靜 脈注射方式，分三次完成，每次注射抗原用量0.03 0.1mg，間隔時間為10d。末
次注射10d后進行放血。放血前動物禁食12h，采用耳靜脈放血40 60ml。收集 后離心除去血細胞，純化后零下2(TC保存。羊抗兔抗體同樣制備。膠體金顆粒的制備取l冗氯金酸0.6ml在30ml超純水中加熱煮沸。快速 -次加入37。C預溫的1%檸檬酸鈉0.9ml,溶液由藍逐漸變為紫紅色，煮沸5tnin， 補水至30ml。冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀調pH至7.2。用0.22pm濾 膜進行過濾，制備20 30nm膠體金顆粒。膠體金一抗體結合物的制備取lmg純化的煙草普通花葉病毒抗體，邊攪 拌邊注入到50ml膠體金溶液中，室溫下攪拌lh。加10X牛血清蛋白2ml，終濃 度為0.4%,室溫下攪拌5min。加10%聚乙二醇lml，終濃度為0.2%,室溫下攪 拌5min。然后12000~15000 rpm離心50min，沉淀溶于5ml保存液中。用0.45nm 濾膜過濾，4"C冰箱保存。膠體金-抗體結合物硝酸纖維素膜的制備將3ml膠體金-抗體結合物和3ml TBS緩沖液混勻，放入硝酸纖維素膜浸泡10mln，取出在37'C烘箱中烤干，熱 合封口， 4-C保存備用。煙草普通花葉病毒的兔多克隆抗體和羊抗兔抗體分別用 固相溶液稀釋成3mg/ml和lmg/ml。兩種抗體分別取1^1,依次點樣在NC膜上， 加羊抗兔抗體的為檢測線，加煙草普通花葉病毒的兔多克隆抗體的為質控線。 固相抗體NC膜在0.5y。BSA封閉液中，37-C下孵育lh后，洗滌液中洗2次，室 溫下風干，4 8"C保存備用。膠體金層析檢測(GICA)試紙的制備取一塊潔凈的PVC板，將包被的 NC膜固定在適當的位置上。將引水材料連接在NC膜的下端即進樣端，吸水材 料連接在NC膜的上端，膠體金-抗體結合物硝酸纖維素膜置于引水材料下與NC 膜銜接。用切割機將組裝后的PVC板縱向切成6mm寬的測試條，將其裝入板 殼，即為TMV膠體金免疫層析檢測試紙，加干燥劑密封保存。試紙條總長度大 約為8cm，引水部位即與樣品接觸的部位長約4cm， NC這段大約長1.5cm，吸 水部位長2.5cm。試紙條的使用步驟取0.1 0.3g的煙葉樣品，葉面積大約3 5cm2，在裝有 緩沖液的塑料袋中研磨后，將試紙條引水端插入檢測樣中，樣品向試紙的另一 端爬行。若試紙條上只有質控線出現紅色而檢測線未顯色，結果為陰性；若試 紙條上質控線和檢測線均出現紅色，結果為陽性；若試紙條上質控線和檢測線 均未顯色，則說明次試紙條已經失效，結果無效。實施例2:在本實施例中，制備膠體金顆粒時取l^氯金酸0.6ml在30ml 超純水中加熱煮沸。快速一次加入37"C預溫的lM檸檬酸鈉0.9ml，溶液由藍逐 漸變為紫紅色，煮沸3min，補水至30ml。冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀 調pH至7.5。其它與實施例l相同。實施例3:在本實施例中，制備膠體金顆粒時取l^氯金酸0.6ml在30ml 超純水中加熱煮沸。快速一次加入37°。預溫的1X檸檬酸鈉0.9ml，溶液由藍逐 漸變為紫紅色，煮沸4min，補水至30ml。冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀 調pH至7.4。其它與實施例l相同。實施例4:在本實施例中，制備膠體金顆粒時取1X氯金酸0.6ml在30ml 超純水中加熱煮沸。快速一次加入37。C預溫的1X擰檬酸鈉0.9ml，溶液由藍逐 漸變為紫紅色，煮沸3min，補水至30ml。冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀 調pH至7.2。其它與實施例l相同。實施例5:在本實施例中，制備膠體金顆粒時取l^氯金酸0.6ml在30ml 超純水中加熱煮沸。快速一次加入37。C預溫的1X擰檬酸鈉0.9ml，溶液由藍逐 漸變為紫紅色，煮沸4min，補水至30ml。冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀 調pH至7.3。其它與實施例l相同。
權利要求
1. 一種煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法，包括制備抗體、制備膠體金、制備膠體金-抗體結合物、制備硝酸纖維素膜和制備膠體金層析檢測試紙的步驟，其特征在于在制備抗體的步驟中，要制備兔多克隆抗體用無菌生理鹽水將煙草普通花葉病毒抗原稀釋為2mg/ml，然后加Freund’s佐劑，第一次為完全佐劑，以后用不完全佐劑；抗原注射量為0.1～0.2mg/kg，選用2～3Kg的兔子，采取靜脈注射方式，分三次完成，每次注射抗原用量0.03～0.1mg，間隔時間為10d，末次注射10d后進行放血，放血前動物禁食12h，采用耳靜脈放血40～60ml，收集后離心除去血細胞，純化后零下20℃保存；并用同樣的方法制備羊抗兔抗體。
2、 如權利要求1所述的煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法， 其特征在于在制備膠體金的步驟中，取1X氯金酸0.6ml在30ml超純水中加 熱煮沸，快速一次加入37"C預溫的l^檸檬酸鈉0.9ml，溶液由藍逐漸變為紫紅 色，煮沸3 5min，補水至30ml;冷卻到室溫后，用0.2mol/L的碳酸鉀調pH至 7.2~7.5，然后用0.22拜濾膜進行過濾，制備20 30nm膠體金顆粒。
3、 如權利要求1或2所述的煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備 方法，其特征在于；在制備膠體金一抗體結合物的步驟中，取lmg純化的煙草 ^通花葉病Til抗體，邊攪拌邊注入到50ml膠體金溶液中，室溫下攪拌lh，然后 加10X牛血清蛋白2ml，室溫下攪拌5mhi，再加10%聚乙二醇lml，室溫下攪拌 5min， 12000-15000 rpm離心50min，沉淀溶于5ml保存液中，用0.45,濾膜 過濾，4"保存。
4、 如權利要求3所述的煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法， 其特征在于在制備硝酸纖維素膜的過程中，將3ml膠體金-抗體結合物和3ml TBS緩沖液混勻，放入硝酸纖維素膜(NC膜)浸泡10mln，取出在37t:烘箱中烤十，熱合封u， 4t:保存備川；然后將煙呰通花葉病毒的兔多克降抗體和羊抗兔抗體分別用固相溶液稀釋成3mg/ml和lmg/ml，兩種抗體分別取1^1，依次 點樣在NC膜上，即檢測線和質控線，問相抗休NC膜在0.5%BSA封閉液屮， 37t下孵育lh后，洗滌液屮洗2次，室溫下風P， 4 8'C保存。
5、如權利要求1所述的煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法， 其特征在于在制備膠體金層析檢測試紙的步驟中，取一塊潔凈的PVC板，將 包被的NC膜固定在適當的位置上，將引水材料連接在NC膜的下端，吸水材料 連接在NC膜的上端，膠體僉-抗休結合物硝酸纖維素膜置于引水材料下與NC 膜銜接，用切割機將組裝后的PVC板縱向切成6mm寬的測試條，將其裝入板 殼即可。
全文摘要
本發明公開了一種煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條的制備方法，包括制備抗體、制備膠體金、制備膠體金-抗體結合物、制備硝酸纖維素膜和制備膠體金層析檢測試紙的步驟。采用上述技術方案制備的煙草普通花葉病毒田間快速檢測試紙條，檢測適溫15～35℃，檢樣量0.1～0.3g的樣品，相當于葉面積大約3～5cm<sup>2</sup>；將煙葉在裝有緩沖液的塑料袋中研磨后，將試紙條浸入，30min出結果；假陽性率低于1％。可見本發明使用方便，特別適用于田間快速檢測，并且可靠性很高。
文檔編號G01N33/544GK101210925SQ20061016002
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月30日 優先權日2006年12月30日
發明者戚元成, 梁振普, 邱立友, 高玉千 申請人:河南農業大學