專利名稱：食源性寄生蟲病快速酶免疫檢測方法及檢測盒的制作方法
食源性寄生蟲病快速酶免疫檢測 方法及檢瀾盒
技術壤域 本發明涉及一種食欐性寄生蟲病快速簾兔疫檢籌方法及檢糊盒。
背暴技術 眾所周知，食灑性寄生蟲病(FO(H)S(KME PARASITE DISEASES)是一組可以通過食物傳播的常見寄生蟲病，主要包括豬襄 蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、旋毛蟲四種寄生蟲病。它們可以感染人體以及 家畜，嚴重損害人類賴并造成畜牧業的經糊失，其中，豬囊蟲可 以引起癱癇、癱瘓、失明；肺吸蟲可以導致臃囊腫、肺膿腫肝吸蟲 可以引起膽道感染、膽結石、肝硬化；旋毛蟲則可以引起嚴重的過敏 反應及心臟損害。食源性寄生蟲流行廣泛，僅在中國廣東省肝吸蟲流 行區人口躭達到3000萬以上。更值得注濂的是，，性寄生蟲病的 起病隱匿,癥狀不典型，易與其它疾病泡淆，加之目前臨床缺乏可靠
目前，食源性寄生蟲病的檢測方法有兩大類一類是傳統檢測方 法，即査找病原體，由于這四種寄生蟲多寄生在深部組織內，如腦部、 眼球、肝臟膽道、肺部、骨骼肌、心肌等臟器，要通過外科手段采集 蟲體,不僅損傷甚大而且往往蟲體分布散在常難以檢獲。另外簾毛蟲、豬囊蟲不排蟲卵，臃吸蟲禪卵銀少甚至不捧卵；肝吸蟲雖可駄itll便 排卵，但卵體積徼小且摔卵不規律，難以檢出，臨床上常用的維涂
片旨感度一般低于50%。因此，無論查蟲卵或蟲體都不是診斷該組 寄生蟲病的有效手段；另外一類就是近年來出現的常規酶兔疫法等， 但這類方法普邋存在以下不足1、操作時間長時間多在長達2— 4小時以上，難以適應現場與臨床門診的快速診斷需要；2、試劑操 作煩瑣如簾結合物和底物液要臨時配制，抗康需要過夜包被，樣本 稀釋液體以及終止液,需要用戶自行配鑭,在應用中給用戶帶來了 諸多不便；3、不穩定所提供的試劑穩定性不佳，一旦配制必須在 l周內甚至l天內用完，造成經濟損失，也影響了檢獮的可靠性；4、 配套不完整迄今，在市場上尚未見到同時提供方法統一的四種食源 性寄生蟲成套試劑盒，所有試劑盒都只能瀾定一種寄生蟲病。目前， 所見到的供應單位供應品種不齊全，僅供應其中一種或兩種，如中國 某地一家公司僅提供襄蟲檢糖試摑，同地區另一研究所則^5lllfl旋毛 蟲檢測試劑。廠家的不同，方法的區別，性能的差異，不僅影響可操 作性，更影響到結果的一致性和有效性，容易造成誤診自診，成為 食潘性寄生蟲病防治中一大隱患；5安全晚患常規酶兔疫方法常使 用具有致崎性作用的(FD作為顯色擁,并用強腐鋃性的H截作為終止 液，對操作人員和環境構成威脅。綜上所述，現有的檢測技術不能有 效滿足食獮性寄生蟲病的診斷霱耍，不利于疾病的診斷治療和預防控 制。 發明內容本發明的目的在于,食欏性寄生蟲病梭建磨兔疫
檢測方法及與本方法配套用的成套檢鑭盒。
為了達到上述目的，本發明提供了如下的技術方案 一種食源性 寄生蟲病快速酶免疫檢瀾方法，用于,蟲、肺吸蟲、肝吸蟲和旎毛 蟲的籌免疫檢測，該方法的酶免疫檢獮用試劑包括抗康包被坂A、酶 結合物液B、洗滌液C、底物D、顯色劑E、樣品,液F、終止劑G、 陽性對照品H及陰性對照品I,檢測i^使用多孔檢獮盒，具體過程 包括(1)樣本稀釋:用樣本稀釋液F將待檢血洧按體積比1:50 稀釋，陰陽性對照血清同比例同步稀釋，然后(2)加樣反應 每孔加已稀釋血清lOOul,同時設陰性、陽性及空白對照各一孔， 空白對照孔加入100ul樣品稀釋液F， 371C靜置10分鐘，甩去， 每孔加洗滌液C一滴，立即用蒸镩水洗滌多次，甩去，拍千，再 (3)加酶反應加酶結合物B二滴，37"C反應10分鐘，甩去， 加洗滌液C一滴，立即用蒸餾水反復洗滌多次，甩去，拍干，最 后(4)顯色反應:加底物D和顯色劑E各一滴，混勻，室溫下放 置2-3分鐘，待陰性對照孔徵呈藍色時，加終止劑G—滴饞勻， 終止反應，肉眼觀察淺于近于陰性對照為陰性，呈明顯深于陰性 對照的藍色為陽性，用儀器判斷以空白對照鑭零于630nm讀取 O.D值，待檢孔0.D值大于陰性對照2.1倍者為陽性，當陰性對
照0. D值低于0. 07時按0. 07計算，
在具體檢獮過程中，必須注意如下問題1、試翻盒在2-8
TC下保存，每次取出時先平衡至窒祖后使用，糖瓶每次用后一定 要將齄擰緊，各瓶麁之間切不可棍用2、洗滌時將蒸鑣水加滿 孔內，每次停放三十秒鐘，甩去孔內液體，禁用自來水籌其它水
姬 源o
本發明較好的技術方案可以是擾康包被拔A采用自包被工
藝，預先在通用聚苯乙烯傲孔板上包被抗原，包被液為含it:lil原的
據酸鹽緩沖液(由機酸煞鈉與接黢鈉組成，冊9.60, 0.0511),室濂靜 止12小時，用1%牛血清白蛋白封閉2小時，冷凍真空干燥，真空裝 袋封口。采用快逮包被工藝可以提裔工作效率#||裔檢鼸鈞準確率。 本發明較好的技術方案也可以是酵結合物B液磷鶄l^i沖液 (由雜酸二氨鈉與磷酸煞二鈉組成，PH7.0, 0.05M),添,定劑分 子量Mr為20000的聚乙二醇重量0.5%-5%,同時添加加速獺分子量 Mr為6000的聚乙二酵重Jt 0. ,5%,加萬分之一琉桷汞以及四種寄 生蟲病統一的抗人兔疫球蛋白G辣根過載化物酶標記結合物。
在實施本發明的雌中,其它mi用的試撫的成粉或醒置旅如
下洗滌液C:采用0.5%吐溫的礴酸鹽緩沖液(由磷酸二鶬鏞與磷酸 氨二鈉組成，PH7.0, 0.05M),加萬分之一瑰楝汞；底物液D及顯色 劑E:底物液為過氣化氣瘠液，顯色劑為對人體無害的TOB港液樣 本稀釋液F:磷酸鹽緩沖液(由礴酸二氟鈉與IWM二鈉組成，PH7.0, 0.1M),含吐溫0. 5%;終止液G: W十二嫁,酸鈉(S蹈)陽性 對照H與陰性對照I:陽性對瓶系將國種陽性病AA清滅滴處理，棍 合，加萬分之一癘拂榮條，成為可以通用翁櫬合,性對瓶陰性對 照系若干正常AJWIHi合后，加萬分之一1! 1^#^1##,以上組分
包括了檢獮折儺賽的^試擁(蒸w求酴外)，其中液體綴分均已調
整到工作濃度并裝入鼴料滿瓶內，無須驊雜可以直,用；陰陽對照 放入帶塞的塑料管內，可以直接使用；包被拔拆封后也可直接使用。 本發明較好的技術方案還可以是:多孔檢H盒是一種可以扣合的 四合一化的試劑盒，盒內分為兩個區，一個區放置多種寄生蟲抗原預 包被板，共多塊紫鄰樣體試劑瓶，另一區設置一個開孔紙托或塑料基 托立式并行放置多種通用的液體試劑瓶，試劑盒上方有開口，內側 蓋上各有一個孔，分別插放明性和陽性對麗血溏，實際使用中，用于 協調四種抗原包被條件使包括,緒合物在內的其它液體組分可以成
為四種寄生蟲檢瀾均可直g^用的mi試剜,因此僅一套液體試劑就
可以滿足四種寄生蟲病的檢測要求盒內分為兩個區， 一個區放置四 種寄生蟲抗原預包被板,共四塊緊都液體試割瓶,互相平行站立禪列； 另一區設置一個開孔紙托或繮llii托立式^放置6種通用的液體
試劑瓶。試劑盒開口設在上面，內倒兼上分別設計一個孔，分別插 放陰性和陽性對照血滴。
與現有技術相比，本發明具有以下明顯的優點1、提離了反應 速度，整個反應時閥不翹過幼4HNu比常規,兔疫方法提離了4倍 以上2、方便實用試劑盒不僅配備了檢擁所必須的試劑組分，而 且均為即開即用型，用戶不必另行配制,^, ^t作簡單暴行。不 僅可以用儀器定量判斷結果，也可以肉展直接判斷，尤適合于條件受 限的驟場M和門診檢ih 3、提寓了四fN^I檢鼸的可拿性由于 統一了操作方法和饞體試撫,使得用戶可以在同一時間和方法下進行 操作，使糊果具有爽度的—致性和可比性豕4、安全環保；采用了 無害的Tlffi試劑，避兔了常規方法所帶來的危害和污染a終止液采用
無腐餓性的SDS,消除了因ftffl欲黢終止a^f帶來的安全瞎患；5、 檢測效果好(l)敏感性:用本快速試劑盒檢獮經過確診的肝吸蟲 病人血淸453份，檢籌出陽性病例417例，敏感度達到92.10%
(417/453); (2)特異性用本快速試劑盒檢淵356例非流行區 健康人血清，檢籌為陰性標本350例，特異性達到98.30%
(350/356); (3) 真實性(約登指數，Youder， s Index):約 登指數為0.904,顯示了檢測盒寓度的真實性；(4)重復性同 一操作者重復檢測陽性血清56份和陰性血清50份，重復性達到 96.2Cm; (5)穩定性將檢獮盒放置在41C下，動態觀察六個月， 前后結果無顯著性差異。
附圉說明以下是本發明的檢測盒國面說明
圖1是檢淵盒的結構示意圖中1是四種寄生蟲抗原包被板，2Ji)t照血清，3是放置試 劑瓶的基托，4是試劑瓶；參照圖1,多孔檢獮盒是一種可以扣合的 四合一化的試劑盒，盒內分為兩個區， 一個區放置多種寄生蟲抗原預 包被板，共多塊緊鄰液體試劑瓶，另一區設置一個開孔紙托或塑料基 托立式并行放置多種通用的液體試擁瓶，試劑盒上方有開口，內倒 麄上各有一個孔，分翻插放鵬性和蹈性對履血淸a 異體實饞方式以下通過具體的實idr式對本發明嫌行更加詳
細的維述
實施例l肝吸蟲病快速瞎兔瘐檢钃方法
選用肝吸蟲可溶性粗制抗黡，分歩鵬辛黢法和DEAI52離子層 析柱層析純化制得耱制抗原,采用紫外法瀾定蛋白含量;進ff^試驗， 與其它三種抗原對比實驗，測定并選擇肝吸蟲耱制抗簾的包被濃度-, 用磯脧鹽緩沖液(由碳酸無鈉與截黢鈉組成，冊9.60， O.O騮)稀釋 抗原，包被96孔聚苯乙烯鐓孔板，100徵升/孔，室溫過夜，甩去孔 內液體，用同樣劑 含l免的牛血清白蛋白的礴^it緩沖液(由磷酸 二煞鈉與磷酸貧二鈉組成，PH7.0, 0.05M)窒溫封閉2小時，冷凍真 空干燥，真空條件下裝入塑料袋，袋上貼相應標示。包被鈑拆封后也 可直接使用。
配制通用液體試劑，包括酶結合物液B、洗滌液C、底物D、顯 色劑E、樣品稀釋液F、終止劑G、陽性對瓶品H及陰性對颺品I,酶 結合物B液磷黢鹽緩沖液(由磷酸二氨鈉與轔酸塞二鈉組成，PH7.0, 0.0驟)，添加氌定劑分子量Mr為20000的聚乙二酵重量0.5*-5%， 同時添加加速劑分子量Mr為6000的聚乙二醇重量0. 5%-5%,加萬分 之一瑰桷滎以及四種寄生蟲病統一的抗人兔疫球蛋白G辣根過諷化 物酶標記結合物。其它檢濂用的試荊的成份或配置方法如下洗滌液 C:采用0. 8%吐溫饞《|黢^^液(由確酸二鲺鈉與磷酸氨二鈉組成, PH7.0, 0.05M)，加萬分之一琉棟榮；底物液D及顯色劑E:底物液 為逑氣化無溶液，顯色劑為對人體無害的llffi溶液樣本稀釋液F:磷醮鹽緩沖液(由確酸二氣鈉與f^無二鈉組成，PH7.0， 0.11O,含 吐溫0.5%:終止液G: 1*十二^ , (SDS):陽性對照H與陰 性對照I:陽ttXt照系將四種陽性病人血清滅活處理，混合，加萬分 之一硫柳榮分裝，成為可以通用的棍合陽性對照；陰性對照系若干正 常人血清浪合后，加萬分之一瑰櫥榮4^1 ^存-以上組^&括了檢糊 所耱要的全部試劑(蒸餾水需要另行準備)，其中液體組分均已調整 到工作濃度并裝入塑料滴瓶內，無須稀釋可以直接使用；陰陽對照放 入帶兼的鼴料管內，可以直接使用；
將抗簾包被板和液體試艦瓶依次裝入多孔檢糖盒,多孔檢獮盒是 一種可以扣合的四合一化的試劑盒，盒內分為兩個區， 一個區放置四 種寄生蟲抗原預包被板，共四.塊緊鄰液體試摑瓶，另一區設置一個開 孔基托立式并行放置多種通用的液體試劑瓶，試劑盒上方有開口， 內偶蓋上各有一個孔，分別插放鼸性和陽性對照血滴，檢剿盒需要在 4"C下保存，不得冷凍，在此IH^下有效期可以達到6個月。
檢濂過程使用多孔檢鑭盒，具體過程包括(1)樣本稀釋用 樣本稀釋液F將待檢血槺按體積比l:50稀釋，陰陽性對照血清 同比例同步稀釋，然后(2)加樣反應'.每孔加已稀釋血清lOOul, 同時設陰性、陽性及空白對照各一孔，空白對照孔加入100ul 樣品稀釋液F, 371C靜置10分鐘，甩去，每孔加洗滌液C一滴， 立即用蒸館水洗滌多次，甩去，拍干，再(3)加賺反應:加酶結 合物B二鏑，371C反應10分鐘，甩去，加洗滌液C—滴，立即 用蒸鐨水反復洗滌多次，甩去，拍干，最后(4〉顯色反應:加底 物D和顯色劑E各一滴，混勻，室溫下放置2-3分鐘，待明性對 照孔櫬呈堇色時，加終止劑G—滴棍勻，終止反應，肉眼觀察淺 于近于陰性對照為陰性，呈明顯深于陰性對照的藍色為陽性，用 儀器判斷以空白對照調零于630nm讀取0.D值，待檢孔O.D值
大于陰性對照2.1倍者為陽性，當陰性對照0.D值低于0.07時 按0.07計算。
在具體檢籌過程中，必須注紫如下問扈1、試劑盒在2-8 t:下保存，每次取出時先平衡至室溫后使用。滴瓶每次用后一定 要將蓋擰緊，各瓶兼之間切不可混用；2、洗滌時將蒸慵水加滿 孔內，每次停放三十秒鐘，甩去孔內液體，禁用自來水等其它水 源。
實施例2肺吸蟲病快速酶兔疫檢淵方法
選用臃吸蟲可瘠性粗制抗原，分步通過辛酸法和DEAE52離子層 析ttM析純化制得精制抗原,采用紫外法U定蛋白含Jt: ^試驗， 與其它三種抗原對比實驗，測定并選擇肺吸蟲精制抗原包被濃度；用
碳酸鹽緩沖液(成分如上述，p冊.60, o.oao稀釋抗原，包被恥
孔聚苯乙煉徼孔板，100微升/孔，室溫過夜，甩去孔內液體，用同 樣劑量含1%的牛血清白蛋白的稱酸鹽鍰沖液(成分如上述，PH7.0, o. oao室溫封閉2小時，冷凍真空干燥，真空^#下裝袋，板袋上 貼相應標示。包被板拆封后也可直接使用。
其它試劑配制方法、組裝成盒方式及檢籌方案同實據例ln
實施例3豬囊蟲病快逮酶兔痠檢淵方法
選用豬囊蟲囊液可溶性粗制抗原，分步通過辛酸法和IEAE52離 子層析柱展析純化制得精制抗原，采用紫外法測定蛋白含量進行預 試驗，與其它三種抗原對比實驗，測定并選摔抗尿包被濃度；用磯酸 鹽緩沖液(成分如上述，PH9.60, 0.051O稀釋抗原，包被96孔聚 苯乙烯徵孔板，100微升/孔，室溫過夜，甩去孔內液體，用閼樣劑 l:含1%的牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(成分如上述,PH7.0,0. 05M) 室溢封閉2小時，冷凍真空，，真空條件下裝袋，板袋上貼相應標 示。包被板拆封后也可直接使用，
其它試劑配制方法、組裝成盒方式及檢測方案同實旌例1。
實施例4旋毛蟲病快速酶免疫檢測方法
選用旋毛蟲肌肉期幼蟲可瘠性粗制抗原，分步通過辛酸法和 DEAE52離子層析柱層析純化制得精制抗原，采用紫外法剿定蛋白含 量；進行預試驗，與其它三種抗原對比實驗，瀾定并選擇抗原包被濃 度用碳酸鹽緩沖液(成分如上述，PH9.60, 0.05M)稀釋抗原，包 被96孔聚苯乙烯徵孔板，100微升/孔，室溫過夜，甩去孔內液體， 用同樣劑i含1%的牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(成分如上述， PH7.0, 0.05M)室溫封閉2小時，冷凍真空干燥，真空條件下裝袋, 板袋上貼相應標示。包被板拆封后也可直接使用。
其它試劑配制方法、組裝成盒方式及檢籌方案同實施例1。
權利要求
1. 一種食源性寄生蟲病快速酶免疫檢測方法，用于豬囊蟲、肺吸蟲、肝吸蟲和旋毛蟲病的酶免疫檢測，其特征在于酶免疫檢測用試劑包括抗原包被板A、酶結合物液B、洗滌液C、底物D、顯色劑E、樣品稀釋液F、終止劑G、陽性對照品H及陰性對照品I，檢測過程使用多孔檢測盒，具體過程包括(1)樣本稀釋用樣本稀釋液F將待檢血清按體積比1∶50稀釋，陰陽性對照血清同比例同步稀釋，然后(2)加樣反應每孔加已稀釋血清100ul，同時設陰性、陽性及空白對照各一孔，空白對照孔加入100ul樣品稀釋液F，37℃靜置10分鐘，甩去，每孔加洗滌液C一滴，立即用蒸餾水洗滌多次，甩去，拍干，再(3)加酶反應加酶結合物B二滴，37℃反應10分鐘，甩去，加洗滌液C一滴，立即用蒸餾水反復洗滌多次，甩去，拍干，最后(4)顯色反應加底物D和顯色劑E各一滴，混勻，室溫下放置2-3分鐘，待陰性對照孔微呈藍色時，加終止劑G一滴混勻，終止反應，肉眼觀察淺于近于陰性對照為陰性，呈明顯深于陰性對照的藍色為陽性，用儀器判斷以空白對照調零于630nm讀取0.D值，待檢孔0.D值大于陰性對照2.1倍者為陽性，當陰性對照0.D值低于0.07時按0.07計算。
2、 根據權利要求1自的ltlH方法，,征在于擾累包被板 A采用快速包被工藝，預先在通用聚苯乙烯轍孔板上包被抗原，包被 液為含抗簾的機酸鹽緩沖液(由硪酸無鈉與親,組成，PH9.60, O.OaO,窒溫靜止12小時，用1免牛血鳙白蛋白封閉2小時，冷凍真 空干燥，真空裝袋封口。
3、 根據權利要求1所述的檢鑭方法，其特征在于酶結，B 液S^鹽緩沖液(由稱酸二無鈉與磷酸煞二鈉組成，PH7.0, 0.05M), 添加癱定摑分子量Mr為20000的聚乙二酵重量0.5%-5%,同時添加 加速劑分子量Mr為6000的聚乙二酵重量0.5%-5%,加萬分之一琉柳 汞以及四種寄生蟲病統一的抗人免疫球蛋白G辣根過氧化物,記 結合物。
4、 權利要求1的檢糖:^所使用的多孔檢獮盒，其特征在于多孔檢測盒是一種可以扣合的四合一化的試劑盒，盒內分為兩個區， —個區放置多種寄生蟲抗原預包被板，共多塊紫鄰液體^ 瓶，另一 區設置一個開孔紙托或塑料基托立式并行放置多種通用的液體試劑 瓶，試劑盒上方有開口，內镅蓋上各有一個孔，分別插放陰性和陽 性對瓶血清。
全文摘要
本發明公開了一種食源性寄生蟲病快速酶免疫檢測方法及多孔檢測盒，酶免疫檢測用試劑包括抗原包被板A、酶結合物液B、洗滌液C、底物D、顯色劑E、樣品稀釋液F、終止劑G、陽性對照品H及陰性對照品I，檢測過程使用多孔檢測盒，檢測過程包括樣本稀釋、加樣反應、加酶反應和顯色反應，抗原包被板A采用快速包被工藝，預先在通用聚苯乙烯微孔板上包被抗原，酶結合物B液添加分子量Mr為20000、6000的兩種聚乙二醇，解決了現有檢測方法操作時間長、操作煩瑣、試劑不穩定和配套不完整等問題，具有速度快、操作方便、可靠性高和檢測效果好等優點，用于豬囊蟲、肺吸蟲、肝吸蟲和旋毛蟲病的酶免疫檢測。
文檔編號G01N33/543GK101206222SQ20061015765
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月18日 優先權日2006年12月18日
發明者杜宜峰 申請人:深圳市康百得生物科技有限公司