專利名稱：一種熒光納米微球制備技術及其應用的制作方法
技術領域：
熒光免疫檢測納米材料技術
背景技術：
熒光納米微球是近年來出現的一種新的納米材料，廣泛應用于探測和示 蹤細胞內PH值、離子濃度變化、單分子活動，以及體外定量檢測細胞因子、標志蛋 白和各種激素。目前熒光納米微球多采用熒光嵌合方法合成熒光納米微球，即在合 成制備納米微球的同時加入熒光物質，使熒光物質嵌入納米材料內部形成熒光納米 微球。這種方法合成的熒光納米微球容易產生熒光泄漏現象，使得熒光納米微球中 的熒光含量逐漸減少，本底熒光信號較高。為解決這一問題， 一般采用在熒光納米 微球外面包覆一個外殼，制備成核殼型熒光納米微球，來減少熒光物質的泄漏。目 前，核心納米材料主要有聚丙烯酰胺(PAG)、葡聚糖、硅膠等材料，熒光物質主要 有無機金屬螯合物〔聯吡啶釕、鑭系元素銪(Eu)、锝(Td)〕、有機熒光染料Cy5、 Cy3、異硫氰酸熒光素(FITC)、 Fura-2等。外殼多采用硅膠(Si02)材料，在合成 核心微球后再包覆Si02。 Si02包覆的核殼熒光納米微球比較適合于PH值或離子生 物傳感器的應用，但不便于與抗體、抗原或半抗原等物質交聯，不適合于采用均相 熒光分析法(homogeneous fluroimmunoassay, HFIA)均相免疫檢測法、雙抗體標 記免疫檢測法等時間分辨熒光免疫分析(time-resolued fluroimmunoassay, TRFIA) 技術生物分子進行定量檢測。
參考文獻
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發明內容
本發明專利涉及一種氨基化核殼型熒光納米微球制備技術及其應用。技 術方案是，先合成聚丙烯酰胺(PAG)與熒光物質嵌合的核心納米微球。然后再在核 心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，制備成氨基化核殼型熒光納米微球。這種方法制 備的熒光納米微球既有利于封閉和保護熒光物質，防止熒光泄漏，延長熒光衰減時 間，又使得納米微球外表面含有豐富的氨基基團，方便熒光納米微球與抗原、抗體 等蛋白質和多肽的交聯。并且，抗體與熒光納米顆之間通過一個化學臂連接，降低 抗體的空間位阻，可以保護抗體的免疫活性。直接用雙功能試劑一一戊二醛就能使 熒光納米顆有效地標記抗體等多肽物質。聚苯乙烯包覆的核殼型熒光納米微球可廣 泛應用于細胞因子、激素、各種標記蛋白的示蹤和定量檢測。也可作為微型生物傳 感器用于蛋白質相互作用、PH值及離子變化的檢測。
實現方式本發明的目的可以通過以下措施來達到(以制備Eu熒光納米微球并用于 檢測促血管生成素2 (angiopoietin-2， Ang-2 )為例)
1. 材料與試劑
l.l核心微球單體丙稀酰胺(AG);交聯劑二甲基丙稀酰胺(bis);氣溶膠琥 珀酸二辛酯磺酸鈉(A0T)和乳化劑Brij30;催化劑過硫酸銨(AP)、加速劑四 甲基乙二胺(TEMED);有機溶液正己烷；磷酸緩沖液(PBS), PH7.4;熒光材料 Eu螯合物TEKES-Eu
1.2外殼單體:苯乙烯(Styrene, St )、氨基官能團單體(Aminoethy lmethacry late hydrochloride, AEMH)、 乳化劑(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTAB)、 引發劑 (2,2' -azobisisobutyramidine dihydrochloride , AIBA 或 2,2' 一azobisdimethylenisobutyramidine dihydrochloride, ADIBA)、 終止劑(對苯.二 酴Hydroquinone)。
2. 氨基化核殼熒光納米微球制備配方見下表
表l聚丙烯酰胺核心微球(core)合成配方
組分PBSAGbis" 。正己垸AOT Brij30 —EuAPTEMED
劑量1ml8g0.3g 50 ug19ml 0.2g 0.3ml0. 01ml0. 2u 1
表2氨基化聚苯乙烯外殼合成配方組分H20PAG core StHDTAB AEMHADIBA
劑量500ml400g 20g 0.337ml 0.2g0. M
3.具體制備方法和操作步驟:
3.1銪(Eu)熒光納米微球的制備。釆用反相微乳液聚合法合成熒光納米核心微球。 在PH7.4的磷酸緩沖液中按照表l的配方和比例加入熒光物質、丙稀酰胺，交聯劑 雙叉丙稀酰胺。溶解后加入19ml正己烷，再加入氣溶膠琥珀酸二辛酯磺酸鈉A0T和 乳化劑Brij30,在通氮氣條件下慢慢噴入催化劑過硫酸銨、加速劑四甲基乙二胺
(TEMED),室溫反應2小時。反應完成后，旋轉蒸發除去正己烷，產物用乙醇洗滌， 最后可在30%乙醇中長期保存。
3.2納米微球的氨基化包覆以ADIBA為引發劑、以HDTAB為乳化劑，按照表2的配 方和比例，依次加入各種試劑，與氨基化單體AEMH交聯，制備成氨基化熒光納米微 球。制備出的納米微球直徑在20-100nm之間，大部分為30nm左右。(注在包覆聚 苯乙烯的過程中不加入氨基化單體AEMH,可制備成非氨基化納米微球)
3.3掃描電子顯微鏡測量熒光納米微球的直徑。純化的納米徵球用正己烷稀釋至0. 1 %的濃度，移到銅網上噴涂電子染料，掃描電子顯微鏡觀測熒光納米微球直徑及大 小，計算納米微球平均直徑及標準差。
4.核殼熒光納米微球的應用。核殼納米微球有多方面的應用，可作為生化傳感器用 于測定PH值和各種金屬離子濃度，標記抗體可用于示蹤和檢測目的抗原。它的用途 主要取決于納米微球包覆的熒光材料及標記的物質。比如，包覆對PH值敏感的FITC 可以作為PH傳感器；包覆對鈣離子敏感的Fura-2可作為Ca—傳感器。氨基化熒光 納米微球特別適合標記抗體。以下以熒光納米微球標記促血管生成素Ung-2)抗體, 并用于定量檢測Ang-2為例說明氨基化熒光納米微球的應用
4. 1 Ang-2單克隆抗體用磷酸緩沖液(PBS， PH7. 0)稀釋成2mg/ml，分別與濃度為 1%的熒光納米微球混合，在終濃度為1.25%的戊二醛的幫助下進行微球與抗體的 交聯，交聯完成后，用液相層析分離標記抗體。
4.2標記抗體的純化。采用液相層析法純化標記抗體。在內徑為1.5-2.0cm的層析 管內先填充S印harose 6B 40ml,然后填充SephadexG50 20ml形成混裝柱，加入標 記好的熒光納米微球，以磷酸緩沖液為流動相，分離純化標記抗體。
4.3測定標記抗體的比活度。用反應液對熒光標記抗體進行遞度稀釋，與相應標準 熒光作對照，熒光檢測儀測定標記熒光的熒光信號強度，推算出抗體懸液中的熒光 物質含量。然后在280rnn處測定純化標記抗體的吸光度值(OD值)，計算出抗體的 濃度IgGmg/ml= OD280 - (0. 008 x熒光M mol/L) + 1. 34,標記抗體的比活度為熒 光,1/L與IgGmg/ml的比值。
4.4血清Ang-2含量均相免疫熒光檢測實驗。常規方法抽取外周血2ml,室溫靜置 30分鐘使血液凝固，2500轉/分鐘(rpm)離心，吸取清亮血清，-18。C凍存備用。 取15p 1緩沖液(Rl ) (5%聚乙二醇6000， 20mM Tris-HCl緩沖液，PH6. 0)和15 U 1處理液(R2 )( 600mM甘氨酸、0.2% Towen-20, PH2. 5 )加入到酶標板的微孔中， 30秒鐘內立即測定340nm激發光，615nm熒光強度值Al。然后37'C再反應20min, 30 秒鐘內在730nm處測定反應液的熒光亮度值A2。熒光強度值AA = A2-Al。以遞度稀 釋的已知濃度的Ang-2蛋白溶液作為定量標準品繪制標準曲線，并計算目的蛋白含 量。
權利要求
1.一種熒光納米微球制備技術。其特征是納米微球為核殼結構，核心為聚丙烯酰胺(PAG)嵌合熒光物質，核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，富含氨基基團。
2. 權利要求1中提到的熒光納米微球其特征是核心微球為聚丙烯酰胺(PAG)嵌 合各種熒光物質，包括無機金屬螯合物(聯吡啶釕、鑭系元素銪(Eu)、锝(Td))、 有機熒光染料Cy5、 Cy3、異硫氰酸熒光素(FITC )、 Fura-2等許多熒光染料。
3. 權利要求1中提到的熒光納米微球其特征是表面富含氨基基團，在雙功能交 聯劑(如戊二醛等化學物質)作用下，可以與富含氨基的抗原、抗體等各種 蛋白質和多肽、半抗原及其他化學分子交聯，用于臨床上采用免疫熒光法對 各種體液蛋白、激素、細胞因子、標志蛋白和半抗原進行定量檢測。
4. 權利要求1中提到的熒光納米微球其特征是不加入氨基官能單體制備成非氨 基化熒光納米微球，可以作為微型生物傳感器，用于蛋白質相互作用研究， PH值、鈣、鈉、鉀等離子的測定。
全文摘要
本發明涉及一種氨基化核殼型熒光納米微球制備技術及其應用。技術方案是，先合成聚丙烯酰胺(PAG)與熒光物質嵌合的核心納米微球。然后再在核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，制備成氨基化核殼型熒光納米微球。這種方法制備的熒光納米微球既有利于封閉和保護熒光物質，防止熒光泄漏，延長熒光衰減時間，又使得納米微球外表面含有豐富的氨基基團，方便熒光納米微球與抗原、抗體等蛋白質和多肽的交聯。直接用雙功能試劑——戊二醛就能使熒光納米顆有效地標記抗體。氨基化核殼型熒光納米微球可廣泛應用于細胞因子、激素、各種標記蛋白的示蹤和定量檢測。也可作為微型生物傳感器用于蛋白質相互作用、pH值及離子變化的檢測。
文檔編號G01N33/546GK101191797SQ20061014902
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月21日 優先權日2006年11月21日
發明者王珊珊 申請人:王珊珊