一種診斷前列腺癌的試劑盒的制作方法

專利名稱：：一種診斷前列腺癌的試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及免疫學領域，具體涉及檢測血清中游離形式前列腺特異抗原的試劑盒及其用途。
背景技術：
：前列腺癌是中老年男性的常見多發病。據統計，在男性癌癥患者中，前列腺癌發病率最高，是除肺癌和大腸癌外的第三大死因。前列腺特異抗原PSA，分子量34KD的糖蛋白，具有高度的組織特異性，分布于正常的前列腺組織、前列腺增生組織、前列腺惡性組織和轉移癌及前列腺分泌液、精漿中。雖然近來發現其它癌組織如乳腺癌中存在少量PSA，但其目前仍是前列腺癌診斷中最為重要，應用最為廣泛的前列腺癌標志物。測量血清中的前列腺特異抗原PSA可以用于篩選和早期診斷前列腺癌。血清內PSA有多種存在形式，大部分具有酶活性的PSA與al-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)和a2巨球蛋白(a2M)以復合物的形式存在，少量的無酶活性的PSA以游離形式存在。一般對于正常健康和非前列腺癌病變的男性病人來說，血清的PSA含量低于4.0ng/ml。前列腺癌(PCa)、前列腺增生(BPH)、前列腺炎癥患者血清內PSA濃度會升高，大多數前列腺癌患者血清PSA升高顯著，高于IOng/ml。在4.0-lOng/ml的灰色區域，單獨檢測總PSA無法區分癌癥和良性增生，檢測血清中游離PSA與總PSA的比例可顯著提高前列腺癌和前列腺增生的辨別。比例越高，前列腺癌風險越低，分界比例通常認為是15%。游離的PSA可提供更好的生化指標，用于區分PSA4-10ng/ral的前列腺癌和良性增生。血清PSA在2.5-4ng/ml的男性中，仍有部分人患有前列腺癌，檢測血清內其它游離形式的PSA水平也可以幫助區分癌癥患者。目前用于血清PSA檢測的試劑盒有RIA、ELISA、化學發光等試劑盒，檢測游離PSA的試劑盒比較少，曾經有人制備過酶聯免疫ELISA試劑盒，但是現有技術中游離PSA的酶標試劑盒用于測定時，不僅測定步驟多、時間長、使用不便，而且靈敏度低，準確性參差不齊，這些因素大大限制了酶免試劑盒的推廣和應用。因此，本領域迫切需要開發更快速、更方便的游離PSA檢測試劑盒，以滿足臨床需求。
發明內容本發明的目的在于提供一種檢測游離PSA的試劑盒及其用途。所述的試劑盒靈敏度高、檢測時間短且使用方便。.本發明的另一目的在于提供一種體外檢測f-PSA方法。在本發明的第一方面，提供一種檢測f-PSA的試劑盒，所述的試劑盒含有一固相載體，所述的固相載體上包被有第一單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體選自由保藏號為CCTCC-C200620的雜交瘤產生的抗體，由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體，或由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；和容器a，所述的容器a中裝有第二單克隆抗體，所述的第二單克隆抗體選自由保藏號為CCTCC-C200620的雜交瘤產生的抗體，由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體，或由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標記物；其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體不相同，且可同時結合于f-PSA。在本發明的一個優選例中，所述的第一單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體。在本發明的另一優選例中，所述的標記物選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、/3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。在本發明的另一優選例中，所述的試劑盒中還包含(a)容器b，所述的容器b中裝有f-PSA的標準品；和域(b)容器c，所述的容器c中裝有f-PSA的質控品。在本發明的另一優選例中，所述的試劑盒中還包含(C)容器d，所述的容器d中裝有與標記物相對應的底物；(d)容器e，所述的容器e中裝有顯色劑；(e)容器f，所述的容器f中裝有洗滌液；和/或①容器g，所述的容器g中裝有終止液。6.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(h)容器h，所述的容器h中裝有增敏劑，所述的增敏劑的配方按照重量比為PEG60004%、甘油1%、蔗糖1%、明膠1%，余量為PBS。在本發明的另一優選例中，所述的容器b-容器h可以是一個容器；也可以是多個容器，多個容器中裝有不同濃度的所述的試劑。在本發明的另一優選例中，所述的固相載體選自微量滴定板、或微球。在本發明的另一優選例中，所述的試劑盒的線性范圍值為0.5-50ng/ml。在本發明的第二方面，提供一種體外檢測f-PSA方法，所述方法包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一單克隆抗體的固相載體，從而使待測樣品中的f-PSA與固相載體上的第一單克隆抗體結合，形成帶有"f-PSA-第一單克隆抗體"二元復合物的固相載體；(b)將第二單克隆抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二單克隆抗體-f-PSA-第一單克隆抗體"三元復合物的固相載體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標記物；(c)檢測三元復合物中的標記物，從而確定待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在的量。附加條件是，步驟(a)和步驟(b)可依次進行或同時進行。在本發明的另一優選例中，所述的第一單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖l顯示了f-PSA標準品濃度參考曲線。圖2顯示了f-PSA標準品溶在陰性血清內的標準曲線。圖3顯示了f-PSA診斷試劑線性范圍及靈敏度測定。圖4顯示了本發明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結果比對。圖5顯示了本發明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結果相關分析。圖6顯示了f-PSA單抗配對效果比較試驗的結果。具體實施方式本發明人經過長期的研究和試驗，找到了針對游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)不同表位的三種高特異性單克隆抗體，選擇所述三種抗體中的任意兩種，根據雙抗夾心法原理，可制備出方便、快速且準確地診斷早期前列腺癌以及區分前列腺癌和良性增生的試劑盒。本發明的試劑盒解決的技術問題一靈敏檢測血清內游離前列腺特異抗原，準確鑒別前列腺癌和非癌患者；本發明的試劑盒解決的技術問題二快速檢測，大大縮短檢測時間，方便快捷。在此基礎上完成了本發明。本領域技術人員均了解，一種抗原可能含有多個表位(抗原決定簇)，因此，針對同一個抗原可以獲得不止一個抗體，這些抗體對抗原的結合特性(如特異性等)均可能是不同的。因此，針對同一個抗原，本領域人員還需要進行比較和篩選，才能找到適合于特異性結合的單抗。本發明人作了大量的工作，同時開發了多種針對f-PSA的單克隆抗體(參見CN200610026505.0)，從中挑選出對f-PSA特異性高的單克隆抗體用于本發明。前列腺特異抗原(PSA)有總前列腺特異抗原(t-PSA)、結合前列腺特異抗原(c-PSA)、游離前列腺特異抗原(f-PSA)之分，且t-PSA=c-PSA+f-PSA。由于需要檢測的是f-PSA抗原，一般的抗f-PSA抗體在用于檢測時易于受到同時結合c-PSA的干擾，導致特異性差，結果偏差大。通常情況下，若是采用一種抗體來結合f-PSA，可能在測定過程中不可避免地發生非特異性結合；而本發明基于雙抗夾心法原理來制備所述的試劑盒，采用的是結合于f-PSA抗原不同表位的雙抗體，這種情況下出現非特異性結合的幾率是非常低的，因此結果的準確性和精密度會大大提高。并且，采用兩種特異性非常高的抗體來將目標抗原f-PSA吸附及定位，其定位和放大效果更好，從而使得特異性和精密度更高。且測定時僅需要很少的樣品量即可。此外，由于所述的單克隆抗體對于f-PSA具有極其優異的結合特性，因此，待測樣品與第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的混合可同時進行(更優選地，可采用增敏劑改進抗原抗體動力學過程)。這就大大降低檢測所需的時間，所需時間由約數個小時減少到約30分鐘；且大大簡化了操作步驟。如本文所用，所述的"捕獲抗體"、"包被抗體"、"第一單克隆抗體"、"第一抗體"、與"一抗"可互換使用，都是指用于固定于固相載體上的、特異性抗f-PSA的抗體。如本文所用，所述的"檢測抗體"、"第二單克隆抗體"、"第二抗體"、"酶標(記)抗體"與"二抗"可互換使用，都是指特異性地抗f-PSA且對應于所述試劑盒中相應的第一抗體的抗體。對于抗原f-PSA而言，相應的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時結合于所述的f-PSA的不同表位(抗原決定簇)。如本文所用，所述的"標記物"是指位于第二單克隆抗體上的，用于確定待檢測樣品中游離PSA的存在與否以及存在的量的標志物。優選的，所述的標記物選自辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、/3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。如本文所用，所述的"與標記物相對應的底物"是指可被第二單克隆抗體的標記物所催化顯色，用于顯示第二抗體與f-PSA發生結合的識別信號。所述的底物比如用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)、ABTS;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP);等等。基本原理本發明的基本原理是雙抗夾心法。常規的做法是將一抗固定于載體，然后一抗與抗原反應，洗滌后再與帶標記的二抗反應，洗滌，最后進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。雙抗夾心法特別適用于具有兩個或兩個以上表位的抗原的檢測。游離的前列腺特異抗原PSA游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)是一種已知的蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本領域已知的。例如，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。生產f-PSA的方法也是已知的。例如，通過常規的重組DNA技術(Science，1984;224:1431)，可利用f-PSA的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的f-PSA蛋白。一般來說有以下步驟(1).用編碼人f-PSA蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；和(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。上述獲得的重組f-PSA蛋白可被加工成具有一定純度的蛋白，用于配制標準品。此外，所述的f-PSA蛋白也可分離自人體。例如，可從人精液內提取和純化f-PSA。抗f-PSA蛋白的單克隆抗體制備抗f-PSA蛋白的抗體的技術是本領域中眾所周知的。用于本發明的抗體是對人f-PSA具有特異性的單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結合于人f-PSA蛋白或其片段。更特別地，指那些能與人f-PSA蛋白或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明利用針對游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)不同表位的高特異性單克隆抗體，根據雙抗夾心法原理，制備了可方便、快速且準確地診斷早期前列腺癌以及區分前列腺癌和良性增生的試劑盒。本發明中涉及的三種高特異性單克隆抗體的獲得及其優異特性在本申請人的在先申請CN200610026505.0中進行了詳細的描述。三種抗體的代號以及保藏號對應如下雜交瘤細胞系S-115-8，保藏號為CCTCC-C200620;雜交瘤細胞系S-191-5，保藏號為CCTCC-C200621;雜交瘤細胞系S-44-10，保藏號為CCTCC-C200622。上述的單克隆抗體的抗體亞型均為IgGl，K。本發明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256;495,1975;Kohler等人，Eur丄Imm畫l.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Hammerling等人,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981)。本發明的單克隆抗體可以利用人f-PSA基因產物或片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。此外，還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。本領域人員均了解，在得到了所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系或通過測序等手段得知所述的單克隆抗體后，本領域人員可以采用多種方法方便地獲得所述的抗體。在本發明的一個實例中，所述的單克隆抗體可以由下列制備方法所制備，所述方法包括步驟(1)提供佐劑預處理的小鼠；(2)在小鼠腹腔內接種所述的雜交瘤細胞并分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。作為一種優選方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是收集腹水，用經硫酸銨、辛酸沉淀，接著用ProteinG預裝層析柱純化，獲得高純度的PSA單克隆抗體。此外，也可按照常規的動物細胞培養方法，體外培養擴增所述的雜交瘤細胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。試劑盒本發明提供一種檢測f-PSA的試劑盒，所述的試劑盒可用于前列腺癌和良性增生的鑒別診斷，特別是早期病人的篩查，也可用于前列腺癌術后化療的監測及預后評估等。所述的試劑盒含有一固相載體，所述的固相載體上包被有第一單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體選自由保藏號為CCTCC-C200620的雜交瘤產生的抗體，由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體，或由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；容器a，該容器a中裝有第二單克隆抗體，所述的第二單克隆抗體選自由保藏號為CCTCC-C200620的雜交瘤產生的抗體，由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體，或由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標記物；作為一個必要的條件，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體不相同，且可同時結合于f-PSA。作為本發明的一個最佳的方式，所述的第一單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C^00622的雜交瘤(S-44-10)產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200621(S-191-5的雜交瘤產生的抗體。本發明人出乎意料地發現，將由CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體作為包被抗體，而將由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體作為檢測抗體，這樣的一種組合能夠產生最好的f-PSA檢測效果，其檢測靈敏度約為0.5ng/ml。在確定了本發明的試劑盒所釆用的包被抗體和檢測抗體后，可以采用本領域常規可用于與檢測抗體結合來進行檢測的各種標記物。本發明對所采用的標記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結合，且在適當處理后能夠準確地指示待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在量的標記物均是可用的。例如，所述的標記物可以選自(但不限于)辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、/3-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。當采用如上所示的一些酶標記物時，還需要采用一些與相應的酶結合的底物，從而可通過顯色等方式來報導標記物的存在情況或者存在量。所述的底物例如(但不限于)用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)、ABTS;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)。為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測過程中設置質控(對照)。在本發明的一個實例中，所述的質控品采用f-PSA標準品、正常女性血清經稀釋而制備。此外，為了獲得定量結果，可以在檢測過程中設置含已知濃度的多個f-PSA的標準品。對于標準品的設置方法可采用常規的方法。在本發明的優選方式中，標準品的設置如下標準品I:0ng/ml純化的f-PSA;標準品II:lng/ml純化的f-PSA;標準品III:2.5ng/ml純化的f-PSA;標準品IV:5ng/ml純化的f-PSA;標準品V:10ng/ml純化的f-PSA;和標準品VI:25ng/ml純化的f-PSA。利用所述的標準品，標準曲線如下設置用標準品的OD值檢測結果為縱坐標(Y軸)，標準品濃度為橫坐標(X軸)繪制成f-PSA試劑盒的定量標準曲線。從而，根據待測樣品檢測獲得的OD值，利用標準曲線可計算出待測樣品中f-PSA的濃度。在本發明的一個實例中，用于制備所述的標準品的f-PSA純品是從人精漿里純化獲取的。按照常規的純化方法，制備出f-PSA，SDS-PAGE驗證純度，溶在PBS中，加入50%甘油，即得到成品。此外，為了使本發明的試劑盒在檢測時更方便，所述的試劑盒中優選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是雙抗夾心法中常規使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領域技術人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于)顯色劑、洗滌液、終止液，增敏稀釋液。作為本發明的一種特別優選的方式，所述的試劑盒中還包含一種增敏劑，所述的增敏劑的配方為(按照重量比)PEG60004%、甘油1%、蔗糖1%、明膠1%，余量為PBS。在采用所述的增敏劑后，本發明的試劑盒中的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體對于f-PSA的識別和結合將更加敏感，并且本發明的試劑盒的檢測時間進一步縮短。所述的第一單克隆抗體被包被在固相載體上。本發明對所采用的固相載體沒有特別的限制，只要其能夠與第一單克隆抗體相偶聯(連接)即可。例如，所述的固相載體選自微量滴定板、或微球。在本發明的一個實例中，采用的固相載體是微量滴定板(酶標板)，所述的微量滴定板是一種聚苯乙烯板，規格是12X8可拆卸條板。作為本發明的一種優選方式，所述試劑盒中一些組分的制備方法如下(1)制備包被有包被抗體的固相載體a)制備單克隆抗體利用專利(參見專利CN200610026505.0)中制備篩選到的單克隆抗體細胞株，將上述雜交瘤細胞株按照常規動物細胞培養方法進行體外培養擴增或者注射小鼠腹腔制備腹水，收集腹水經硫酸銨、辛酸沉淀、ProteinG預裝層析柱純化后，即獲得高純度的PSA單克隆抗體。b)包被將上述的單克隆抗體用50mM、pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋后加入酶標板各孔，100uL/孔，4'C包被過夜。用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板。c)封閉用封閉液封閉后，冼滌，甩干，干燥低溫保存。(2)制備酶標的檢測抗體所述酶標的檢測抗體釆用辣根過氧化物酶(HRP)標記檢測抗體而制備。抗體標記的方法在本領域是公知的，例如用簡易過碘酸鈉法或者戊二醛二步法進行HRP標記抗體。(3)制備質控品采用混合人血清，按照標準曲線范圍要求進行稀釋而制備的。一種質控品制備方法步驟如下a)收集正常女性血清，-2(T(〕保存；b)將累積的各份血清混合，加入f-PSA標準品用ELISA方法測定濃度，并按標準曲線要求進行適當的調整，制備f-PSA的濃度范圍分別在2±0.5ng/ml(低值)和10±lng/ml的兩種血清(高值)；c)將步驟b)所獲得的兩種血清按試劑盒需要量分裝，即制備成低、高值質控品。(4)制備其它輔助試劑所述的輔助試劑包括底物液，顯色液，反應終止液，20X洗滌液。一種配制輔助試劑的方法如下a)底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3%過氧化氫溶液；b)顯色液四甲基聯苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為O.lmg/ml;C)反應終止液2M硫酸；d)洗滌液(20X):PB(pH7.4)配制的0.05，土溫20溶液。檢測游離PSA方法本發明提供一種體外檢測f-PSA的方法，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一單克隆抗體的固相載體，從而使待測樣品中的f-PSA固相載體上的第一單克隆抗體結合，形成帶有"f-PSA-第一單克隆抗體"二元復合物的固相載體；(b)將第二單克隆抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二單克隆抗體-f-PSA-第一單克隆抗體"三元復合物的固相載體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標記物；(c)檢測三元復合物中的標記物，從而確定待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在的量。由于本發明的試劑盒采用的單克隆抗體對于f-PSA具有極其優異的結合特性(高特異性)，因此，步驟(a)和(b)可同時進行(S卩同時進行待測樣品與第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的混合)。將步驟(a)和步驟(b)同時操作，將大大降低檢測所需的時間(由約數個小時減少到約30分鐘)。當然，步驟(a)和(b)也可分別進行。作為本發明的一種優選方式，定量檢測f-PSA的方法具體如下(i)抗原抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔內分別加入IOO"L不同濃度的標準品、質控品，或待測血清樣品；(ii)酶聯反應同時將服P-單克隆抗體溶液加入各孔，100uL/孔，再加入100uL增敏劑，放入溫控搖床內，37。C振蕩、孵育30min。洗滌液(1X)重復洗板3次；(iii)顯色反應每孔加入底物溶液、顯色液各50iiL，37"孵育15min，每孔加入100uL反應終止液，結束反應；(iv)比色以空白對照孔的吸光值調零，酶標儀在450nra測定0D值并打印結果。(V)結果計算A)制作標準曲線以標準品濃度為橫坐標，標準品測定0D值為縱坐標，作出標準曲線；計算曲線回歸系數R2，當R2〉0.98時本次測驗有效；B)評判質控品濃度根據質控品的OD值，從標準曲線上讀出相應的濃度值；質控品測定濃度值處于給定范圍時，該次測定有效；C)計算待測血清樣品濃度當標準曲線和質控品均被判定有效時，根據待測樣本的OD值從標準曲線計算出待測血清樣品的f-PSA濃度。本發明的主要優點在于(1)由于本發明的試劑盒采用對f-PSA具有高親和力，且高特異性識別f-PSA不同表位的單克隆抗體，靈敏度和準確性非常高。其線性范圍值為0.5-50ng/ml，準確性為94.0%。(2)由于采用的單克隆抗體對于f-PSA具有極其優異的結合特性，因此本發明的試劑盒可以極其快速地檢測出血液中f-PSA，將現有技術中需數小時才能獲得檢測結果縮短到30分鐘左右，比普通的同類ELISA試劑盒更為快速。這對于臨床快速且準確地診斷早期前列腺癌以及區分前列腺癌和良性增生而言具有極其重大的意義。(3)本發明試劑盒還具有簡便、穩定等特點。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例lf-PSA酶免試劑盒的制作一、從人精液內提取純化f-PSA收集人的精液，10OOOXg離心20min，上清PBS透析，再次離心一次，0.22nm濾膜過濾，收集濾液。將上述獲得的濾液上疏水層析柱(77A^'/h7icge7c力r咖atograp力y)，峰內收集到的目的產物。將目的產物上凝膠過濾層析柱(分離范圍5-70KD)，收集f-PSA所在的峰，得到f-PSA純品。采用SDS-PAGE驗證純度，WesternBlot、ELISA驗證特異性，獲得經檢測合格的純化f-PSA。二、制備純化包被抗體使用經典的單克隆抗體生產方法獲得S-44-10、S-191-5或S-115-8陽性雜交瘤細胞株(參見專利CN200610026505.0):在經過佐劑預處理的小鼠腹腔內接種所述的雜交瘤細胞，使之分泌單克隆抗體；抽取腹水；經常規的硫酸銨、辛酸沉淀，ProteinG親和層析，收集抗體峰，PBS透析得單克隆抗體純品。SDS-PAGE驗證純度>98%，效價12萬。三、酶標記抗體制備采用常規的過碘酸鈉法，在酸性條件下，將抗f-PSA抗體S-191-5、S-115-8或S-44-10與辣根過氧化物酶偶聯，用PBS充分透析，加等體積甘油，-2(TC保存。經測定，效價>10000。四、f-PSA標準品制備將前述"一"制備獲得的純化f-PSA溶解在PBS中，加入適量的50%甘油，分裝成f-PSA濃度分別是0、1、2.5、5、10、25ng/ml的溶液共6支，作為f-PSA標準品。上述制備的f-PSA標準品的濃度參考曲線如圖1所示。五、包被抗體和酶標記抗體工作濃度選定采用常規的方陣滴定法，選擇對應的抗體包被濃度和酶標記抗體濃度。包被抗體從5ug/ml倍增稀釋，包被酶標板，加梯度稀釋的酶標抗體測定，以確定應用濃度。經過反復驗證，選擇的較佳工作濃度為10ug/ml-l:10000。六、預包被抗體板的制備(1)包被包被液——0.05MPH9.6碳酸鹽緩沖液500ml;Na2C:030.6g;Na線1.58g;將上述溶液調整PH9.6，定容至500ml;接著，加入適量的包被單抗，稀釋至10yg/ml，加入微孔板各孔中，封口膜加蓋，4'C過夜甩干。(2)洗滌洗滌液——1M/LTris20ml;Hcl16.8ml;Tween200.5ml;調整ra至7.2，用仏0定容至1L。洗滌液加入各孔內，靜置3min后甩干，上述操作重復3次，以除去游離抗體。(3)封閉BSA3g;明膠l.lg;0.15MPBS定容100ral!=[>水浴加溫至呈透明溶液，冷卻至室溫i〉注入酶標板各孔中，封口加蓋，37'C溫育2小時i>吸水紙拍干，重復一次，待干燥后放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4°C，備用。七、質控血清制備收集正常女性血清，-2(TC保存。將累積的各份血清混合，加入f-PSA標準品用ELISA方法測定濃度，并按標準曲線要求，將兩份混合血清濃度調至2±0.5ng/ml、10土2ng/ml范圍。f-PSA標準品溶在血清內的標準曲線如圖2所示。將所獲得的兩份血清按試劑盒需要量分裝，即制備成低、高值質控品。八、酶標單抗稀釋液BSA0.5g;Tween-201%;0.15MPBS調PH7.2，定容至lOOml。將抗體標記物按工作濃度稀釋，-2(TC凍存備用。Na2HP0412H20檸檬酸H203%H202ddH201.7g;0.5g;200u1;100ml;調節PH至5.0<十、顯色液Na2HP0412H20檸檬酸H20ddH20調整PH至5.O后1.7g;0.5g;100ml;力卩入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25u1。十一、反應終止液濃硫酸10ml;ddH2080ml。十二、洗滌液(IOX)1M/LTris200ml;Hcl168ml;Tween205ml;調整PH至7.2，仏0定容至ILc十三、增敏劑PEG60004g;甘油lg;蔗糖lg;明膠lg;PBSlOOml。十四、半成品及成品的組裝將前述所得試劑分別裝入容器(如小瓶或離心管)中，將容器裝入試劑盒中，將獲得的預包被抗體板也裝入盒內，備用。此外，也可在試劑盒中裝入所述的試劑盒的使用說明書。實施例2f-PSA酶免試劑盒的操作1.抗原抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔內分別加入100uL不同濃度的標準品、質控品，或待測血清樣品。2.酶聯反應同時將HRP-單克隆抗體溶液加入各孔，100uL/L，再加入100uL增敏劑，放入溫控搖床內，37X:振蕩、孵育30min。采用洗滌液(1X)重復洗板3次。3.顯色反應每孔加入底物溶液、顯色液各50uL，37'C孵育15min，每孔加入100"L反應終止液，結束反應。4.比色以空白對照孔的吸光值調零，酶標儀在450nm測定0D值并打印結果。5.結果計算A)制作標準曲線以標準品濃度為橫坐標，標準品測定OD值為縱坐標，作出標準曲線；計算曲線回歸系數R2，當R2>0.98時本次測驗有效。B)評判質控品濃度根據質控品的0D值，從標準曲線上讀出相應的濃度值；質控品測定濃度值處于給定范圍時，此次測定有效。C)計算待測血清樣品濃度當標準曲線和質控品均被判定有效時，根據待測樣本的0D值從標準曲線計算出待測血清樣品的f-PSA濃度。實施例3f-PSA酶免試劑盒的質量檢測以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。對該試劑盒進行質量檢測如下1)線性范圍將實施例1中制備的f-PSA純品稀釋成梯度濃度100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、Ong/ml。按照前述實施例2操作步驟進行測定。以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制曲線。所獲得的曲線見圖3。結果顯示，線性范圍內最高檢測上限值為50ng/ml，最低檢測下限值為0.5ng/ml。試劑盒線性范圍為0.5-50ng/ml。2)檢測靈敏度根據上述線性范圍測定結果(圖3)，本發明上述制備的試劑盒的檢測靈敏度為0.5ng/ml。3)準確性取三份待測正常女性血清，混合后分為三份混合血清標本，分別加入f-PSA純品，配成濃度為O、2、10ng/m:L，制成回收試驗血清標本l共、2tt、3tt。按前述實施例2操作步驟進行測定并計算結果。然后計算回收率。結果，2#、3tt標本的回收率分別為104.9%和107.2%，平均回收率106.0%，即試劑盒的比例偏差為6.0%，準確性為94.0%。4)精密度抽取IO份前述制備的相同類型的試劑盒，用同一份待測樣本前述實施例2操作步驟進行重復測定。計算本次測定結果，求出均值、SD和變異系數CV。精密度試驗結果顯示，"變異系數(^=5.09%";批間CV〈15%。5)穩定性為了驗證試劑盒的穩定性，本發明人將試劑盒各組分置37t:，保存1周，然后用于檢測，結果發現檢測的準確性及精密度沒有顯著變化。實施例4f-PSA酶免試劑盒測定國家參照品f-PSA以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。用于測定國家參照品f-PSA。將國家參照品(購自中國藥品生物制品檢定所)稀釋成一系列濃度梯度25、10、5、2.5、1、Ong/ml。使用本發明的試劑盒，按照前述的操作步驟，測定其吸光度值(0D450)，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制曲線。結果發現，國家參照品和對應濃度吸光度值成線性關系，相關系數R2=0.998。說明本發明試劑盒具有極其優異的準確性。表l檢測國家f-PSA參考品<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例5f-PSA酶免試劑盒測定正常人血清f-PSA含量一、臨床血清的獲得從臨床取得健康體檢者血清ll份，其中6份女性血清，5份男性血清。血清的制備釆用臨床檢驗科常規方法，肘靜脈取血，血液置于室溫下lh，凝固后，置4。C，過夜(切勿冰凍)析出血清，離心，4000rpm，10min。在無菌條件，吸出血清，分裝(0.050.2ml)，貯于低溫冰箱。二、使用實本發明的試劑盒測定正常血清以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。用于測定正常血清。按照前述實施例2操作步驟，測得各血清吸光度值，參照標準曲線，計算出血清內f-PSA的含量。結果顯示，5份正常男性血清樣本中有一份的f-PSA含量為0.52ng/inl，其余均在檢測限下，男性平均水平為0.27ng/ml;而6份女性血清f-PSA水平均在檢測限下。表2用本發明的試劑盒檢測正常人血清f-PSA含量<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例6定量法f-PSA酶免試劑盒測定臨床陽性血清f-PSA含量一、臨床血清的獲得從長征醫院獲得8份臨床陽性血清。血清的制備方法同實施例4中所述方法。經Abbott化學法光法自動檢測儀檢測T-PSA均〉4ng/ml。二、使用本發明的試劑盒測定臨床陽性血清以前述的單克隆抗體S-44-l()作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-19卜5作為檢測抗體，其它試劑同實施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。用于測定臨床陽性血清。按照前述實施例2操作步驟，測得各血清吸光度值，參照標準曲線，計算出血清內f-PSA的含量。本次檢測中參考曲線中f-PSA參考品濃度和吸光度值0D450成線性關系，R2=0.9859。計算得到的臨床血清f-PSA濃度值占T-PSA的比例，6#在15%以上，提示前列腺癌的可能性較小，其它血清的比例均在15%以下，提示前列腺癌的可能性較大。表3檢測臨床陽性血清f-PSA含量標準參照品濃度(ng/ml)0D450臨床陽性血清編號0D450游離PSA含量(ng/ml)總PSA含量(ng/ml)游離PSA比例00.0874#0.2820.715.1613.7%10.3145tt0.3511.078.1513.1%2.50.6656#0.3771.205.7420.9%51.2517tt0.341.018.6911.6%101.9849#0.5071.8716.7911.2%253.146畫0.3030.826.3512.9%11H0.2410.5011.034.5%12tt1.33812.34135.79.1%實施例7定量法f-PSA酶免試劑盒和商品化試劑盒的比對一.臨床血清來源從健康體檢者處獲得5份正常血清；從長征醫院獲得6份臨床陽性血清。血清的制備方法同實施例4中所述方法。經Abbott化學發光法自動檢測儀檢測T-PSA均〉4ng/ml。二.本發明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清結果比對以前述的單克隆抗體S-44-10作為包被抗體，以前述的單克隆抗體S-191-5作為檢測抗體，其它試劑同實施例1，制備f-PSA酶免試劑盒。按照前述實施例2操作，檢測血清f-PSA含量。購買BioCheckf-PSA檢測試劑盒(BioCheck公司，LotNO:RN-25907)按照其附帶說明書操作，所得結果分別用各自的標準曲線計算F-PSA的濃度，比對兩份結果，進行統計學處理。表4血清f-PSA含量檢測結果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>本發明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結果比對見圖4和表4。本發明試劑盒和商品化試劑盒檢測血清f-PSA結果相關分析-線性回歸結果見圖5。結果表明，兩種檢測方法的檢測結果具有非常顯著的相關性，從而證明本發明的試劑盒的檢測結果是非常可信的。三.靈敏度和耗時的比較為了進一步地比較前述的試劑盒和商品化試劑盒，本發明人檢測了兩者在0-1ng/ml范圍內，對于f-PSA標準品測定的吸光度。將純化制備的f-PSA標準品用樣品稀釋液，稀釋成25、10、5、2.5、l、0ng/ral，分別按照本試劑盒和BioCheck試劑盒的說明書操作，測定在450nm的吸光度，并比較兩種試劑盒的測定結果。表5測定f-PSA的吸光度的比較本發明試劑盒；,&商品化試劑盒；吸光度f國PSA濃度(ng/ml)f-PSA濃度(ng/ml)00.054024吸光度0.05310.22610.1102.50.5222.50.19850.91650.453101.556100.816252.985251.958靈敏度由表5可見在0-lng/ml范圍內，本發明的試劑盒lng吸光度是陰性值的4.2倍。而商品化試劑盒lng的吸光度是陰性值的2.1倍，這就顯示本試劑盒信噪比顯著更優。此外，以"CUToff值=平均值+3乂標準差"公式計算所的的結果也顯示，本發明的試劑盒的靈敏度顯著高于對照商品化試劑盒。反應時間上述商品化試劑盒在操作上要求樣品孵育和酶標物孵育時間分別為60分鐘，顯色時間為15分鐘，加上其它洗滌操作的時間共150分鐘。本發明的試劑盒可采取樣品孵育和酶免反應同時進行的操作，操作時間共30分鐘，顯色為10分鐘，完全可在50分鐘內可以完成實驗測定。實施例8f-PSA單抗配對效果比較將所述的單克隆抗體分成兩組來制備檢測試劑盒組I:包被抗體S-44-10抗體，檢測抗體S-191-5，采用的其它試劑如實施例l所制備；組II:包被抗體S-191-5抗體，檢測抗體S-44-10，采用的其它試劑如實施例l所制備。配對檢測時，將f-PSA標準品用稀釋液稀釋成1000、100、10、1、Ong/ml，用上述組I和組II制備而成的兩種試劑盒，按照實施例2中的操作步驟，分別檢測這五種1000、100、10、1、Ong/ml稀釋度的f-PSA標準品，將比較組I和組II的試劑盒的檢測效果。結果見圖6，組II的檢測配對檢測容易出現HD-HOOK效應，即在f-PSA的濃度增加時，吸光度值反而下降的現象，主要由于抗原抗體反應的動力學決定，和抗體特性相關，且f-PSA在10-l()0ng/ml其吸光度值小于組I配對的檢測結果。在檢測更多的f-PSA稀釋度(100-0ng/ml)時，組II配對的檢測結果也小于組頂己對的檢測結果。可見，組I的兩種抗體配對檢測f-PSA效果更優于組II的兩種抗體配對檢測效果。所以最優選的情況是選擇S-44-10抗體作為包被抗體、S-191-5作為檢測抗體這一配對組合。菌種保藏雜交瘤細胞系S-115-8、雜交瘤細胞系S-191-5和雜交瘤細胞系S-44-10保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國武漢)，保藏號分別為CCTCC-C200620、CCTCC-C200621和CCTCC-C200622，保藏日均為2006年4月29日。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學院上海生命科學研究院<120>—種診斷前列腺癌的試劑盒<130>067628<160〉1<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉261<212>PRT〈213〉智人(Homosapiens)<400>1MetTrpValProValValPheLeuThrL.euSerValThrT卬lieGly151015AlaAlaProLeulieLeuSerArglieValGlyGlyTrpGluCysGlu202530LysHisSerGinProTrpGinValLeuValAlaSerArgGlyArgAla354045ValCysGlyGlyValUuValHisProGinTrpValLeuThrAlaAla505560HisCyslieArgAsnLysSerVallieLeuLeuGlyArgHisSerLeu65707580PheHisProGluAspThrGlyGinValPheGinValSerHisSerPhe859095ProHisProLeuTyrAspMetSerLeuL,euLysAsnArgPheLeuArg100105110ProGlyAspAspSerSerHisAspLeuMetLeuLeuArgLeuSerGlu115120125ProAlaGluLeuThrAspAlaValLysValMetAspLeuProThrGin130135140GluProAlaLeuGlyThrThrCysTyrAlaSerGlyTrpGlySerlie145150155160GluProGluGluPheLeuThrProLysL,ysLeuGinCysValAspLeu165170175<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>權利要求1.一種檢測f-PSA的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一固相載體，所述的固相載體上包被有第一單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體選自由保藏號為CCTCC-C200620的雜交瘤產生的抗體，由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體，或由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；和容器a，所述的容器a中裝有第二單克隆抗體，所述的第二單克隆抗體選自由保藏號為CCTCC-C200620的雜交瘤產生的抗體，由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體，或由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標記物；其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體不相同，且可同時結合于f-PSA。2.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的第一單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體。3.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。4.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(a)容器b，所述的容器b中裝有f-PSA的標準品；和/或(b)容器c，所述的容器c中裝有f-PSA的質控品。5.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(C)容器d，所述的容器d中裝有與標記物相對應的底物；(d)容器e，所述的容器e中裝有顯色劑；(e)容器f，所述的容器f中裝有洗滌液；和/或(f)容器g，所述的容器g中裝有終止液。6.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包含(h)容器h，所述的容器h中裝有增敏劑，所述的增敏劑的配方按照重量比為PEG60004%、甘油1%、蔗糖1%、明膠1%，余量為PBS。7.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的固相載體選自微量滴定板、或微球。8.如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的線性范圍值為0.5-50ng/ml。9.一種體外檢測f-PSA方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將待測樣品加樣于包被有第一單克隆抗體的固相載體，從而使待測樣品中的f-PSA與固相載體上的第一單克隆抗體結合，形成帶有"f-PSA-第一單克隆抗體"二元復合物的固相載體；(b)將第二單克隆抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有"第二單克隆抗體-f-PSA-第一單克隆抗體"三元復合物的固相載體；且所述的第二單克隆抗體攜帶一標記物；(c)檢測三元復合物中的標記物，從而確定待檢測樣品中f-PSA的存在與否以及存在的量。附加條件是，步驟(a)和步驟(b)可依次進行或同時進行。10.如權利要求9所述的方法，，其特征在于，所述的第一單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200622的雜交瘤產生的抗體；且所述的第二單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200621的雜交瘤產生的抗體。全文摘要本發明公開了一種檢測f-PSA的試劑盒，所述的試劑盒選用針對游離的前列腺特異抗原PSA(f-PSA)不同表位的高特異性單克隆抗體分別作為包被抗體和檢測抗體。本發明的試劑盒靈敏度和準確性非常高。且可以極其快速地檢測出血液中的f-PSA，對于臨床快速且準確地診斷早期前列腺癌以及區分前列腺癌和良性增生具有重要意義。文檔編號G01N33/577GK101210927SQ20061014873公開日2008年7月2日申請日期2006年12月30日優先權日2006年12月30日發明者兵孫,季永庸,朱靜燕,蔡興鋒,黃超鋒申請人:中國科學院上海生命科學研究院