專利名稱：：癌癥檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于測癌癥和其他疾病的試劑盒。
背景技術：
：癌癥具有極高的致死率。提高癌癥存活率最重要的因素之一是早期檢測。然而，目前對癌癥進行的早期診斷和有效治療均存在一定的局限性。癌癥發生和發展與酶基因異常表達密切相關，在細胞癌變過程中，與細胞增殖有關的酶及其同工酶活性增加。芳香基硫酸酯酶(Arylsulphatase,ARS)及其同工酶能水解芳香族的硫酸酯類，與機體解毒功能有關。一般認為，血清ARS活性升高是炎癥過程；對區別腫瘤和非胂瘤有一定參考價值。血清中該酶濃度的測定，可以在臨床上對疾病的診斷、治療及預后判斷，提供極為有用的資料。有研究表明芳香基硫酸酯酶及其同工酶(ARS)為水解酶，能催化芳香基硫酸酯水解，它們已被證明在肺癌病人血清中比正常人血清中的活性高，治療以后活性顯著下降，包含ARS在內的溶酶體酶活性的提高可以被用來有效診斷和療效檢測(Wozniak,A.，etal.，2002)。而且ARSA和ARSB的活性在人初生和次生腫瘤組織的不同組織學類型中，在幾乎所有的初級肺癌中顯著升高(Gasa，S.,etal.,1980)。在乳腺癌患者中檢測出ARS活性是健康女性的2-5倍，經過手術或化療后，活性降至正常。酶活性跟腫瘤大小和轉移情況相關(Rozwodowska，M.，etal.,2004)。而且還發現乳腺癌組織約是正常組織中硫酸酯酶活性的兩倍(Chetrite，GS.,etal.，2005)。另外，利用非特異性底物進行實驗，發現ARS活性在胃癌、直腸癌、乳腺癌和皮膚癌中升高(Dzialoszynski，L.M.,etal.,1966)。4-甲基傘形酮硫酸鹽(4-methylumbelliferonesulfate,4-MUS)能作為一個合適的底物來檢測ARS的活性(George,G.G，etal.,1969)。而且4-MUS在Km和Vmax、-敏感性和穩定性方面比其他底物要好，其水解的產物4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone,4-MU)在堿性溶液中有較高的熒光，便于檢測。現有技術均在檢測ARS中的A或者B，而本發明是檢測ARSA和B這類酶，因為4-MUS不能分辨出A/B(William,R.S.，etal.,1967，Bostick，W.D.,etal.,1978.)。
發明內容我們通過ARS這類酶催化4-MUS底物這樣的生化反應，根據反應液中生成物4-MU反映酶活力的原理。利用特制的檢測儀器，經特定的激發和^r測波長^r測產物4-MU的熒光強度，并才艮據已知濃度的4-MU標準品繪制標準曲線，從而定量4全測樣品中的ARS的活性。以此來進行癌癥的初期篩查和療效監測。本發明涉及一種檢測癌癥的試劑盒，其包括4-MUS和4-MU。試劑盒中4-MUS的濃度為O.l-lOOmM，優選1-lOmM,4-MU的濃度為l-lOOOOnM，優選10-10000nM,更優選100-5000nM。本發明的試劑盒可用于檢測下列癌癥肺癌、胃癌、卯巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、腸癌、鼻咽癌、腎癌、膀胱癌、淋巴癌、膽嚢癌、壺腹癌、陰莖癌、睪丸癌、喉癌、曱狀腺癌、前列腺癌、宮頸癌、大腸癌、肝外膽管癌、軟組織肉瘤、精原細胞瘤、尤文氏肉瘤、白血病、骨肉瘤、腦瘤、惡性淋巴瘤。優選地，所述癌癥是肺癌。本發明的試劑盒使用的生物學樣本為人的全血、血清、尿液、唾液、痰液、淋巴液以及其他組織液。優選地，所述生物學樣本為血清。優選地，本發明的試劑盒還包括緩沖劑及終止液。所述緩沖劑優選醋酸鈉，其濃度范圍是l-10000mM，優選10-5000mM,更優選100-1000mM，其pH的范圍是l-14，優選4-6。所述終止液優選碳酸鈉/碳酸氬鈉，其濃度范圍是l-50000mM，優選10-5000mM,更優選100-1000mM,最優選400-600mM,其pH的范圍是l-14,優選9-11。本發明還涉及一種特制的、專門用于檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的檢測儀器，其基本構造見圖2。它可以在特定的波長激發和檢測焚光信號。所述激發波長的范圍是100-600nm,優選300-400nm。檢測波長的范圍是100-1000nm,優選400-500nm。這種檢測儀器能夠實現自動化，批量化的操作。本發明可用于篩查與療效監測正常人群篩選；有癥狀病人的診斷以及良性和惡性肺瘤的鑒別；病情嚴重程度，評估治療方案；監測腫瘤的治療效果；預測腫瘤的復發及預后。本發明的優勢(與ELISA的比較)由于酶與底物的反應是高效和專一的，因此酶活性測定優于抗原-抗體反應技術，即基本上不存在假陽性情況。同時，酶活性測定更能直接的反映腫瘤發生過程中酶生物學功能，即實驗結杲更加真實可信。而且檢測產物具有特異的激發和檢測波長，使得整個實驗可操作性強。圖1顯示實-驗原理。圖2顯示檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的檢測儀器的基本構造。圖3顯示抗凝劑對人血清芳香基硫酸酯酶活性的影響。圖4顯示保存狀態對人血清芳香基硫酸酯酶活性的影響。圖5是4-MU與熒光讀數值的標準曲線。圖6是用3份血清樣本確定反應時間的[4-MU]-時間曲線。圖7是血清樣本不同的稀釋條件下的[4-MU]-時間曲線。圖8是芳香基硫酸酯酶在正常人血清和肺癌等癌癥患者血清中的活性的對照。圖9是芳香基硫酸酯酶在正常人全血和肺癌等癌癥患者全血中的活性的對照。圖10顯示芳香基硫酸酯酶在正常人血清和肺癌等癌癥患者血清中的活性相對應的靈敏度-特異性關系。具體實施方式(1)反應參數的確定1.反應參數1.1抗凝劑對活性的影響(圖3)從圖中可以看出，隨著抗凝劑濃度的增加EDTA對活性影響不明顯肝素鈉和檸檬酸鈉對活性影響較明顯，隨劑量增加，活性下降為了保證酶的活性，我們選擇不帶抗凝劑的血清作為實驗樣本。1.2保存狀態對活性的影響(圖4)乂人圖4可以看出室溫保存條件下，血清酶活性隨存放時間增長而下降，且比較明顯，從第2日起，每日下降10%左右4度保存條件下，血清酶活性隨存放時間增長變化不明顯反復凍融10次，活性下降20%左右為了保證酶的活性不受影響，我們選擇保存條件為-20°C。1.3基礎酶學性質實驗確定的反應參數OD-[P]呈直線[P]-time在前期呈直線反應初速度v-[E]呈直線(i[S][E]0)1.3.1OD-[4-MU]標準曲線的確定為了保證熒光讀數值跟4-MU濃度成線性關系，作圖5(重復實驗中結果一致性較好)1.3.2[4-MU]-時間曲線的確定選用3份血清樣本來確定反應時間，結果顯示(圖6):[4-MU]的讀數值在圖5范圍內，認為36h內呈線性；為保證測量的時間選取在線性范圍內，同時與背景(對照)數值有明顯差異，確定反應時間為24h。1.3.3血清樣本不同的稀釋條件下的[4-MU]-時間曲線(圖7)為保證血清樣本稀釋的倍數的選取在線性范圍內，確定采取1:8稀釋，再加入20pL于反應體系中。2.反應參數的確定血清稀釋至1/8，取20pl進行酶活反應，24h后測定熒光讀數，同時測定OD-[4-MU]標準曲線，再將(OD樣本-OD對照.(水))換算為W-MU](2)實驗步驟采血5mL左右，加入真空、帶分離膠且不含抗凝血劑的試管，室溫靜置30min左右，水平離心機，3000轉/分鐘，離心10min,將最上層血清吸出/傾倒出，轉至1.5mLEP管/或其他類型未用過的小管，冷凍(-20攝氏度)至使用。測定活性時，取50jxl血清加入350^1的100mM醋酸鈉緩沖液(pH5.4)中。取20nl上述已稀釋過的血清，加入180^1反應體系(含100mM醋酸鈉，pH6，8mM4-MUS)。置溫箱(37。C)反應24小時后，加入lml終止緩沖液(500mM碳酸鈉/碳酸氬鈉緩沖液，pH12)，進行熒光測定。利用標準樣品4-MU(純產物)作OD-[4-MU]標準曲線，再將血清反應讀數按照此標準曲線進行換算，得到每個反應的[4-MU]。根據上述[4-MU]，得到該血清ARS的活力，即每分鐘每升酶蛋白能轉化的底物摩爾數，或者得到該血清ARS的比活力，即每分鐘每毫克酶蛋白能轉化的底物摩爾數。數據處理方式I:測定緩沖液(含等濃度的醋酸鈉和終止液成分)中標準樣品即4-MU(0.003mM)的OD,^己為ODs測定對照反應(以20ji1醋酸鈉緩沖液替代血清的反應)的OD,記為OD0(ODn-OD0)/[4-MU]n=ODs/[4-MU]s[4-MU]n=(ODn-OD0)*0.003mM/ODs可以算得樣品n反應得到的產物4-MU的量，即參與反應的底物4-MUS的量可以得到樣品n的活性，即每分鐘每升酶蛋白能轉化的底物摩爾數公式為[4-MU]n/(L*24*60)單位換算成nmol/min/L數據處理方式II:測定緩沖液(含等濃度的醋酸鈉和終止液成分)中標準樣品即4-MU(0.003mM)的OD,i己為ODs測定對照反應(以20pl醋酸鈉纟爰沖液替代血清的反應)的OD,記為ODO(ODn-OD0)/[4-MU]n=ODs/[4-MU]s[4-MU]n=(ODn-OD0)*0.003mM/ODs可以算得樣品n反應得到的產物4-MU的量，即參與反應的底物4-MUS的量.測定樣品n的酶蛋白量用牛血清蛋白(BSA)作對照，紫外分光光度計入=280nm來纟全測，得到樣品n的酶蛋白濃度，記為Mn,可以算得樣品n的酶蛋白量，記為Mgn.可以得到樣品n的酶比活性，即每分鐘每毫克酶蛋白能轉化的底物摩爾數。公式為[4-MU]n/(Mgn*24*60)單位換算成nmol/min/mg實驗所用儀器水平離心機HeraeusLabofuge400R檢測儀器(i)基本構造如圖2所示的用于檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的檢測儀器，它可以在特定的波長激發和檢測菱光信號。其中激發波長的范圍是100-600nm，檢測波長的范圍是100-1000nm。這種檢測儀器能夠實現自動化，批量化的操作；或者(ii)焚光分光光度計HITACHIF-2500FluorescenceSpectrophotometer電熱恒溫培養箱天津市中環實驗電路有限公司蝸旋振蕩器IKAMS2Minishaker移液器吉爾森lmL，200^1,20}il(3)實驗數據1.正常人(15例)和癌癥患者(肺癌7例、胃癌1例、卵巢癌3例、胰腺癌1例、乳腺癌1例)每種血清標本重復三次實驗。全部測量數據見圖8。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.正常人和癌癥患者相對應的血清標本的活力均值表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將正常人血清(共15樣本)與癌癥患者血清(共13樣本)進行T檢測，得到p=0.005415<0,01。-特異性關系見圖10。4.標準的確定根據靈敏度-特異性的關系，我們選擇靈敏度和特異性相對數值都高的實驗數據作為標準。參考文獻1.Wozniak，A"etal"Neoplasma，2002.49(1):p.10-5.2.Gasa，S.，etal"CancerRes,1980.40(10):p.3804-9.3.Rozwodowska,M.,etal"PolMerkuriuszLek,2004.17(99):p.252-4.4.Chetrite,G.S.，etal"AnticancerRes，2005.25(4):p.2827-30.5.Dzialoszynski,L.M.，etal"ClinChimActa,1966.14(4):p.450-3.6.George,G.G,etal.，AnalChem，1969.41(14):p.2006-9.7.Sherman,W.R.,etal"Biochem.J.1967.102:p.905-9.8.Bostick,W.D.，etal"ClinChem，1978.24(8):p.1305-16.權利要求1.一種檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的試劑盒，包括4-甲基傘形酮硫酸鹽和4-甲基傘形酮。2.權利要求l的試劑盒，它用于檢測癌癥和其他疾病，以及相應的療效監測。3.權利要求l的試劑盒，其中癌癥是肺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、腸癌、鼻咽癌、腎癌、膀胱癌、淋巴癌、膽囊癌、壺腹癌、陰莖癌、睪丸癌、喉癌、甲狀腺癌、前列腺癌、宮頸癌、大腸癌、肝外膽管癌、軟組織肉瘤、精原細胞瘤、尤文氏肉瘤、白血病、骨肉瘤、腦瘤、惡性淋巴瘤。4.權利要求l的試劑盒，使用的生物學樣本為人的全血、血清、尿液、唾液、痰液、淋巴液以及其他組織液。5.權利要求l的試劑盒，其中4-MUS的濃度范圍是0.1-100mM。6.權利要求l的試劑盒，其中4-MU的濃度范圍是l-10000nM。7.權利要求l的試劑盒，其中還包括緩沖劑及終止液。8.權利要求7的試劑盒，其中緩沖劑是醋酸鈉。9.權利要求8的試劑盒，其中醋酸鈉的濃度范圍是l-10000mM,pH的范圍是1-14。10.權利要求7的試劑盒，其中終止液是碳酸鈉/碳酸氫鈉。11.權利要求10的試劑盒，其中碳酸鈉/碳酸氬鈉的濃度范圍是l-50000mM,pH的范圍是l-14。12.—種特制的、專門用于檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的檢測儀器，它可以在特定的波長激發和4全測焚光信號。13.權力要求12的檢測儀器，其中激發波長的范圍是100-600nm。14.權力要求12的檢測儀器，其中檢測波長的范圍是100-1000nm。全文摘要本發明涉及一種檢測芳香基硫酸酯酶或其同工酶活性的試劑盒，所述試劑盒包括4-MUS及4-MU。所述試劑盒可用于檢測癌癥等以進行癌癥的初期篩查和療效監測。文檔編號G01N21/64GK101183075SQ200610138429公開日2008年5月21日申請日期2006年11月14日優先權日2006年11月14日發明者杰代,飚何,周海夢,許軍普,釗陳申請人:北京雅康博生物科技有限公司