專利名稱：：一種新穎酶聯-環介導等溫基因擴增技術(e-lamp)的建立與應用的制作方法
技術領域：
：本發明是酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)用于HCVRNA病毒檢測。用于RNA病毒在各種生物制品、獻血者、病人血液標本等的監測。應用范圍包括人用、獸用及其他生物^用。
背景技術：
：1、病毒基因檢測技術的現狀自核酸的體外擴增變為現實以來，各種核酸擴增酶與核酸擴增方法層出不窮，基因診斷技術也被愈加廣泛地用于疾病監控、基因突變和基因特征的分析等研究中。迄今，建立的靶基因擴增放大方法主要有最廣泛使用的PCR、bDNA、SDA、3SR、NASBA等。盡管這些方法都具有很強的核酸放大能力，但在儀器需求和實驗的可操作性方面存在很多弊端。臂如PCR需要對雙鏈進行熱變性過程才能啟動下一輪的擴增反應；在NASBA和3SR技術中通過--些特殊的轉錄和反轉錄過程才能進行核酸的擴增，雖然省去了核酸的變復性過程，但在引物設計時還要加入轉錄酵的特異性結合位點；SDA和bDNA檢測技術則通過特殊內切酶的使用在等溫條件下進行核酸擴增和信號放大。相形之下，兩種近年發展起來的環介導等溫基因擴增檢測技術，即環介導等溫擴增技術(LAMP)與滾環復制放大技術(RCA)，具有更高的靈敏度和特異性，而且在擴增時間和可操作性方面顯^出強大優勢。在這兩種技術中分別使用了特異對應于靶序列的引物或探針，在連接酶(或反轉錄酶)和BstDNA聚合酶的作用下對靶序列進行等溫核酸擴增。整個擴增反應并不需要核酸的變復性過程和特殊儀器，在1.5-3小時內即可完成。這兩種檢測技術在可操作性、靈敏度以及特異性方面表現出來的優越性使其倍受研究者的青睞，并已成功應用于各種基因的檢測。2、丙型肝炎病毒全世界有1.7億HCV的慢性感染者，每年新增IO萬人以上的肝癌患者。眾所周知，肝癌與慢性肝炎是密不可分的。根據WHO在2002年發布的一項報告顯示，在2001年由于慢性肝炎引起的死亡人數達到140萬，其中至少20%(28萬人以上)是因丙型肝炎引起的。盡管在丙型肝炎的診斷和治療方面的研究已經有了長足的進展，但在發展中國家，由于丙型肝炎不能得到及時的診斷和治療而引起的病死率還在不斷增加。HCV感染的診斷主要依賴于血清抗體的ELISA檢測和病毒基因的檢測，但由于感染初期抗體水平很低，抗體的檢測總會使-些窗口期傳染源漏檢，尤其在免疫抑制型患者(如合并HIV感染的患者)中更易表現為假陰性，而利用抗體檢測核心抗原的技術一直是一個很難突破的瓶頸。基于PCR的基因檢測技術(NAT)具有更高的靈敏度，尤其在轉氨酶為正常水平，抗體尚未出現時，此技術便成為—種可信賴的丙型肝炎實驗室診斷方法。因此，歐洲藥管局已將HCV-RNA的檢測列為HCV病毒檢測的強制執行項目。在丙型肝炎的傳播中輸血也是一個最重要的途徑之一，這為丙型肝炎的預防工作帶來很大壓力。雖然通過對獻血員嚴格的監測和篩査使這種危險已大幅度減弱，但在輸血過程中丙肝病毒傳播"零危險"的目標也很難達到。隨著NAT技術的日趨完善，一些發達國家已將此技術用于血庫的常規篩査項目，這使窗口期病人的漏檢率有了顯著的降低。據報道，較免疫學檢測，NAT技術可將HCV的平均窗口期提前25天以上，使獻血員傳播HCV的概率降低72%左右。因此，現階段在世界范圍內開展大規模血液篩査也多采用NAT技術。目前HCV的NAT檢測中，PCR和熒光PCR(TaqMan)最為常見。雖然這兩種技術檢測靈敏度高，但因其費用昂貴、操作復雜，在發展中國家很難作為血庫的常規檢測推廣。因此，簡化操作手段和縮短檢測時間成為發展和改造基因檢測方法的重點，本發明中所研究和建立的方法正是迎合這兩個重點進行的。3、逆轉錄環介導，核酸擴場技術(RT-LAMP)逆轉錄環介導等溫核酸擴增技術(RT-LAMP)最初由Notomi等人設計并應用于病毒檢測。在檢測過程中核酸鏈通過等溫環境中的循環置換擴增實現對靶序列的放大。由于反應中使用了三對特異性引物，只有在三對引物均與特異的靶序列結合時擴增反應才能進行，因此這種檢測方法的特異性很高。其中一對引物的5'端含有一段與下游擴增產物互補的序列，因此，這對引物的單鏈產物就可形成一個類似啞鈴狀回文結構，這種結構正好為下一步等溫置換擴增反應提供了一個可被周而復始利用的模板，從而保證了擴增的持續進行。相對于其他傳統擴增方法，尤其對RNA的擴增，這種擴增很大程度上提高了檢測的靈敏度并節省了反應時間。因為其中的-—對引物專門用于增加擴增模板減少反應時間，加之反轉錄和擴增反應在等溫統一環境中一步完成，省去了反轉錄步驟和改變溫度所需的時間。整個檢測過程在65"C等溫條件下只需l-2小時就可完成。最終的擴增產物在核酸電泳的凝膠上呈現出典型的階梯狀條帶。值得一提的是RT-LAMP的擴增反應中可以形成可視的焦磷酸鎂沉淀，因此肉眼也可觀察到陽性反應管中的白色混濁物。4、LAMP在病毒基因檢潿方面的應用基因診斷技術被廣泛地用于疾病監控，基因突變和基因特征的分析等研究中。迄今，建立的靶基因擴增放大的方法主要有最廣泛使用的PCR，支鏈DNA擴增技術(bDNA)，向主復制系統(3SR)，基于核酸序列的放大系統(NASBA)，這些技術在基因檢測方面都有各自的擴增特點和優劣性。臂如，PCR需要對雙鏈進行升溫變性過程后才能啟動下一輪的擴增反應。在NASBA和3SR技術中雖然省去了核酸的變復性過程，但也需要通過一些特殊的轉錄和反轉錄過程進行核酸的擴增；SDA和bDNA檢測技術則通過特殊的內切酶等的使用在等溫條件下進行核酸擴增和信號放大。文中表l總結和比較了近年來發展起來的一些擴增技術的基本特征。表l.不同核酸擴增技術的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>盡管這些方法都具有很強的放大能力，但在儀器需求和可操作性方面都存在不同的弊端。而LAMP檢測技術無論在可操作性、靈敏度以及特異性方面表現出來的優越性使其越來越受到研究者們的青睞。近年來已有許多在基因檢測方面成功應用的報道。在病毒基因檢測方面，Parida等人利用RT-LAMP技術檢測了西尼羅病毒的RNA,并與普通RT-PCR進行了靈敏度比較，發現RT-LAMP的靈敏度髙于RT-PCR方法10倍以上。在SARS病毒的檢測中Thai等人也將常規RT-PCR與RT-LAMP作了比較，它們的樣本檢出率分別為87%和100%，而且他們的實驗結果證明了RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍。與此同時，其他研究者利用該技術進行了麻疹、新城疫和口蹄疫等病毒的檢測。LAMP也被成功用于檢測過不同的植物病毒，如Fukuta等人利用該技術成功的檢測了菊花中的番茄斑枯病毒和繁殖體中的山藥嵌紋病毒。LAMP技術在病毒基因檢測方面的優勢已毋庸置疑，因其具有獨特的核酸擴增機制，使該技術在其它檢測領域也擁有廣泛的應用前景。最近巳有不少學者在這方面作了許多有益的嘗試。Fukuta等人在檢測菊花中的番茄斑枯病毒就將免疫捕捉技術與RT-LAMP有機結合并獲得了成功。還有人分別報道了利用該技術檢測虹鱒魚造血組織壞死病毒、出血性敗血癥病毒和犬瘟病毒的實例。為了發展可供臨床上使用且簡便易行的基因檢測技術，Notomi的研究小組預先將可與LAMP中產物雜交的探針進行熒光標記，并在LAMP反應體系中加入了陽離子聚合物聚乙烯胺(PEI),最終可與擴增產物形成復合物沉淀，而雜交至擴增產物上的熒光標記物使該沉淀在紫外光下呈現出不同的顏色，進一步方便了LAMP技術在臨床監測中的應用。由于LAMP擴增可在短時間內產生大于500jig/ml的DNA，因此這個研究組還使用特異寡核苷酸引物和T印Rl內切酶以LAMP的特異性產物為模板擴增出特異性的單鏈DNA,這種方法的成功也為LAMP與微陣列等技術的結合提供了可行性依據。另外，還有該技術被用于寄生蟲、細菌以及病原基因分型檢測(如登革熱病毒的分型)、胚胎性別檢測和SNP研究的報道。如Oriel等人就時，還有肺炎鏈球菌lytA基因和愛德華氏菌被成功檢測的報道。該技術也可對移植牛胚的性別作出快速鑒定。從上述LAMP的原理和特點不難看出，這種擴增技術在檢測特異性以及便捷性和靈敏度方面都具有很強的優勢，這種優勢是其它擴增技術無法比擬的。不過它在結果判定方面仍然不能避免核酸電泳帶來的麻煩和安全性方面的威脅，而且這種方法很難界定一些微量模板檢測結果的判斷。目前，為了克服這些弊端，完善此項技術，該技術最初的研究者又開發了一種濁度監控儀，可以通過判斷擴增過程中形成焦磷酸鎂沉淀的濁度來對反應實施監控和進行結果判斷。但這種儀器類似于Real-timePCR儀，操作比較復雜而且價格也比較昂貴，很難作為一種常規檢測技術進行推廣。S、酶聯-環介導等溫基因擴増技術(E-LAMP)本發明將普通的酶聯免疫技術與RT-LAMP有機結合，也一并引入了固相載體技術，通過對一條引物進行生物素標記，將RT-LAMP的中產物固相到包被有鏈霉親和素的微孔反應板上，再通過辣根過氧化物酶(HRP)標記抗地高辛(Digoxin)抗體與標記在另一條引物上的地高辛特異性結合而最終呈現顏色反應，實現了在單管中完成從擴增到結果呈現的全部檢測過程。它的檢測時間可以縮短到兩小時以內，靈敏度可達到檢測十個拷貝以上的病毒核酸分子。除了應用一些常用聚合酶外，對硬件設備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項檢測工作。在試驗實施中只需一步就可完成實驗操作，減少了污染機會并方便了實驗過程中的質控工作。基于酶聯-環介導等溫擴增技術的這一檢測系統在靈敏度和和特異性方面與普通RT-PCR相同，但其與酶聯免疫技術的巧妙結合，使對實驗硬件設備的要求大大降低，只需一個恒溫水浴箱和一臺酶標儀即可滿足整個實驗需求。與普通RT-PCR或RT-LAMP相比，在可操作性上顯示出更大的優勢，更易于推廣。
發明內容1、一種新顢,聯-環介導等溫基BT堆技術(E-LAMP)的建立本發明旨在克服當前在病毒基因檢測過程中存在的操作復雜、RNA酶和核酸擴增污染嚴重、實驗硬件設備要求高、價格昂貴等缺點而設計的一種新穎酶聯-環介導等溫基因擴增技術(E-LAMP)。l.l.如
發明內容1.所述的一種新頼雜聯-環介導等溫基因擴增技術(E-LAMP)，其特征在于，將普通的酶聯免疫技術與RT-LAMP有機結合，也一并引入了固相載體技術。1.2.如
發明內容1.1所述的新穎鷹聯-環介導等溫基因擴增技術(E-LAMP)將普通的酶聯免疫技術與RT-LAMP有機結合，其特征在于，將RT-LAMP的中產物固相到包被有鏈霉親和素的微孔板上，再通過嗨標二抗而最終呈現顏色反應。1.3.如
發明內容1.2所述的通過酶標二抗呈現顏色反應，是指通過辣根過氧化物酶(HRP)標記抗地髙辛(Digoxb)抗體與標記在引物上的地高辛特異性結合而呈現顏色反應，實現了在單管中完成從擴增到結果呈現的全部檢測過程。2、引物設計通過Bkst、AlignX和Prim汰5.0程序、選擇丙型肝炎病毒HCV的5'UTR區，對保守區分別設計了六條引物，其中包括兩條外引物(F3、B3)、兩條內引物(FIP、BIP)和兩條環結合引物(Loopl、Loop2)。所有引物的具體序列見表2。表2.E-LAMP檢測HCV的引物序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>2.1.如
發明內容2.所述的引物，其特征在于反應中使用了三對特異性引物，只有在三對引物均與特異的靶序列結合時擴増反應才能進行，因此這種檢測方法的特異性很高。2.2.如
發明內容2.所述的引物，其特征在于其中一對引物的5'端含有一段與下游擴增產物互補的序列，因此，這對引物的單鏈產物就可形成一個類似啞鈴狀回文結構，這種結構正好為下一步等溫置換擴增反應提供了一個可被周而復始利用的模板，從而保證了擴增的持續進行。2.3.如
發明內容2.所述的引物，其特征還在于對其中一條內引物(FIP)在5'端進行生物素標記。2.4.如
發明內容2.所述的引物，其特征還在于對其中另一條內引物(BIP)在5'端進行地高辛標記。3、建立了如下的檢J8過程3.1.合成探針使用大連寶生物生物技術公司合成儀合成。3.2.將待測標本按Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒步驟處理，獲得樣本的RNA。3.3.進行酶聯-環介導等溫擴增(E-LAMP)反應。3.4.酶標儀中讀值。本發明特點這種新穎酶聯-環介導等溫基因擴增技術(E-LAMP)將檢測時間縮短到兩小時以內，靈敏度可達到檢測十個拷貝以上的病毒核酸分子，除了應用一些常用聚合酶外，對硬件設備基本無特殊要求，在普通的生物實驗室就可完成這項檢測工作。在試驗實施中只需一步就可完成實驗操作，減少了污染楓會并方便了實驗過程中的質控工作。這種改進后的LAMP檢測技術可以自酸檢測樣品進行半定量。本發明是目前對RNA病毒檢測技術手段的改進和補充，它具有安全、特異、靈敏、便捷的優勢，這主要體現在以下幾個方面第-，擴增反應只有在六條引物完全與識別的靶序列中八個結合區匹配的情況下才能順利進行，從而使檢測特異性得到改善。第二，該技術省略了單獨的逆轉錄和巢式PCR的二次擴增步驟，只需一步就可完成實驗操作，沒有核酸的變復性過程，減少了RNA酶和擴增核酸的污染機會，提髙了檢測的敏感性和安全性。第三，所有的擴增過程都可在65"同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。第四，通過酶標技術可將檢溯的陽性結果用顏色反應呈現出來。第五，在結果判斷方面，借鑒酶聯免疫技術的結果判斷方法，通過實驗驗證并建立了可靠的結果判斷系統。第六，通過普通酶標儀對反應顏色的檢測可以對樣品進行半定量的測定。第七，較RT-PCR縮短了檢測所需的時間。具體實施例方式實施方案1:丙型肝炎病毒基因(HCV)的E-LAMP檢測(1)以5ng/ml的包被濃度在酶標板或微孔反應板上包被鏈酶親和素，每孔加入lOOfil，4"過夜，拍干酶標板，待用。(2)以PBS洗板，再用lW的BSA37"C封閉lh,洗板，-20匸貯存備用。(3)加入帶有標記引物的E"LAMP反應體系，63r擴增1.5h。E-LAMP的反應體系如下F3與B3，5pmol:BIP與FIP,40pmol:Loop-l與Loop-2，20pmol;其它反應組分終濃度為1.0mMdNTP，lmMbetaine，6mMMgS04，2.5ullOXBst-DNAPolymeraseBuffer,8UBst-DNApolymerase，lUAMV反轉錄酶，5ulHCVRNA樣品，補水至25ul，混勻，63"C，水浴1.5h。(4)移去孔中反應液，洗板。(5)加入HRP標記抗Digoxin抗體(1:10000),37X:繼續放置40min。(6)移去孔中反應液，用洗液洗3-5次。(7)加入顯色液A+B，37X:避光放置2-3min，顯色。(8)顯色完成后加入終止液(1N硫酸)終止反應。在酶標儀中讀值(雙波長405nm，630nm)。實施方案2:對E-LAMP方案進行靈敏度試為了驗證E-LAMP的半定量效果和作為常規基因檢測的可行性，對一份定量后的HCVRNA樣品進行10倍系列稀釋，利用稀釋的樣品測試E-LAMP方案的靈敏度，具體操作程序按HCV-E-LAMP的檢測步驟進行。測試結果表明該方法的靈敏度理論上可達到檢測10個拷貝的HCVcDNA分子，此靈敏度水平與普通RT-LAMP相同，證明該技術經過改造后，其靈敏度并沒受到影響。實施方案3:E-LAMP檢潿HCV病毒的特異性方法與丙型肝炎病毒基因(HCV)的E-LAMP檢測相同，使用的RNA樣品改為HIV、HBV。實驗結果表明HIV和HBV的OD值均趨于陰性，證明這種檢測方法的特異性較高。實施方案4:用HCV臨床血淸樣品進行E-LAMP檢測方法的驗證對收集于甘肅省臨床檢驗中心和湖北省干細胞研究中心的60份丙型肝炎病人的血清進行檢測,E-LAMP檢測HCV病毒的陽性檢測結果與常規RT-PCR方法或Realtime-PCR方法完全一致，說明檢測的特異性和靈敏度是滿意的。權利要求1、一種用于RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)，其特征是將普通的酶聯免疫技術與RT-LAMP有機結合，通過標記引物、包被微孔板和RT-LAMP中產物三者之間的特異性結合而最終呈現顏色反應。2、權利要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)的標記引物包括對其中一條內引物(FIP)進行生物素標記，對另一條內引物進(BIP)行地高辛標記。3、權利要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)，其包被微孔板是指以5jig/ml的包被濃度在酶標板或微孔反應板上包被鏈酶親和素。4、權利要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)的最終顏色反應是通過預包被于固相載體上的鏈霉親和素與生物素之間的連接將反應產物固化到載體上，再使用辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗地高辛抗體使固相載體中的擴增結果呈現出顏色反應。5、權力要求1所述的KNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)的引物包括表2所列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。6、權力要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)的檢測程序，包括合成引物探針、提取樣本的RNA、包被酶標板、酶聯-環介導等溫擴增(E-LAMP)反應、顯色、酶標儀讀值。7、權力要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)的反應體系如下F3與B3，5pmol;BIP與FIP,40pmol;Loop-l與Loop-2，20pmol;其它反應組分終濃度為l.OmMdNTP,lmMbetaine，6mMMgS04，2.5y110XBst-DNAPolymeraseBuffer,8UBst-DNApolymerase,1UAMV反轉錄酶，5u1HCVRNA樣品，補水至25n1。8、權利要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)的反應溫度為63X:。9、權利要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)的反應時間為1.5h。10、權力要求1所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)包括如下病毒及其變異株丙型肝炎病毒(H印atitisCvirus,HCV)。11、權力要求l所述的RNA病毒檢測的酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)應用范圍包括HCV和其它RNA病毒。12、權力要求ll所述的本發明的應用范圍包括人用，獸用及其它生物防御用。全文摘要本發明屬于生物技術應用領域，涉及人類醫學及獸醫，包括RNA病毒在各種生物制品、獻血員、病人血液標本等的檢測。具體是應用酶聯-環介導等溫擴增技術(E-LAMP)，通過計算機軟件分析HCVRNA病毒保守和病毒特異性基因序列，設計出六條引物完全與識別的靶序列中八個結合區匹配，只需一步就可完成在等溫環境中的循環置換擴增反應，同時將普通的酶聯免疫技術與RT-LAMP有機結合，通過對不同引物進行生物素標記將RT-LAMP的中產物固相到包被有鏈酶親和素的微孔反應板上，再通過HRP酶標抗Digoxin抗體與標記在另一條引物上的Digoxin特異性結合而最終呈現顏色反應。實現了在單管中完成從擴增到結果呈現的全部檢測過程。與傳統的RT-PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優勢。文檔編號G01N21/78GK101178362SQ20061013834公開日2008年5月14日申請日期2006年11月8日優先權日2006年11月8日發明者侯云德,孫梅生,李啟明,馬學軍,高寒春申請人:北京金迪克生物技術研究所