專利名稱：微流量液相色譜在線大體積進樣的方法和專用裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及微分離系統的進樣方法，具體地說是一種微流量液相色譜(HPLC) 在線大體積進樣的方法和專用裝置。
背景技術：
進入90年代以來，隨著科學技術的發展和加工工藝的進步,HPLC技術有了新 的進展,除常規分離方式外,^1展出了微柱HPLC、毛細管HPLC和微流控芯片 HPLC等微流量液相色譜分離技術。和常規HPLC比較,這些微型分離技術具有更 低的流速(通常在微升級甚至納升級范圍內)、更小的溶劑消耗量和更高的分離效 率。此外，還可與更多類型的檢測器，如質譜等聯用。適用于復雜樣品的分析。
由于在微流量HPLC使用的分離柱內徑較小，柱體積在納升或微升范圍內。在 〈錢管路連接分離柱時，如果管路的尺寸選擇不恰當，容易引入柱前死體積。在 進行梯度分離時，會產生嚴重的梯度延遲效應。另外，在流路中的進樣閥和進樣 器也是引入柱前死體積的原因之一。通常需要使用微型進樣閥或者納升級進樣閥。 但在使用微型進樣閥或者納升級進樣閥時，由于尺寸的限制，又無法對樣品進行 大體積進樣。
微流量HPLC—般在微升甚至納升級的流速下工作。為了獲得低流速，目前 主要通過使用低流速的泵和對流動相進行分流來實現。但是現在大部分低流速泵 的穩定性和適用性都還達不到要求，所以常用的是對流動相進行分流。主要有兩 種模式， 一種是先進樣后分流的模式樣品被進樣閥切入流路后，會經過一個分 流器，然后和流動相一起進行分流。由于只有少量樣品能夠進入分離柱，這種進 樣方式樣品損失大、進樣重復性差。另一種是先分流后進樣的模式流動相的流 速首先通過分流降到微流量，然后再攜帶樣品進入分離柱。但是這種方法只能使 用微型進樣閥或者納升級進樣閥。這樣會限制樣品的進樣量，無法實現大體積進 樣。
發明內容
本發明的目的在于提供一種微流量液相色譜在線大體積進樣的方法和專用裝
置。可以實現〗敫流量HPLC中樣品的在線大體積進樣和富集的自動化。采用該方 法可以使用高流量的流體輸送裝置。利用兩個以上分流裝置，可實現微流量分離 系統中大體積樣品的上樣。克服了微流量系統中大體積進樣時帶來的梯度延遲效 應、特別適合于梯度分離。此外，不僅具有死體積小、柱前效應小、分離重復性 好等特點，而且系統結構簡單、操作方便。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
在線大體積進樣的方法在微流量液相色譜分離系統的流路中，添加多個流 路分流切換裝置。使得在系統進樣和分離時，流動相從不同流路分流。利用樣品 在固定相上的保留，實現色譜系統的大體積進樣。
具體為流動相由分流器分流后進入進樣裝置，再經另一分流器進入分離柱。 在低流速下樣品于由進樣裝置引入分離柱。樣品利用在固定相上的保留而停留在 分離柱的柱頭，達到大體積進樣的目的。
上述微流量液相色譜(HPLC )分離系統的流量在10nL/min至250uL/min范 圍內；所述微流量HPLC可為微柱HPLC、毛細管HPLC或微流控芯片HPLC。
上述多個流M流切換裝置包括各種規格的切換閥、限壓閥、溫控切換閥、 分流閥和分流器；分流切換裝置至少需要有一個接在進樣裝置前，至少需要有一 個接在進樣裝置后。
所述微流量HPLC在線大體積進樣的專用裝置，包括泵、進樣裝置、分離柱 等。泵通過第一分流器與進樣裝置相連；進樣裝置的另--端與第二分流器相連； 第二分流器與分離柱相連；在分離柱上設有檢測器；兩個分流器分別與切換裝置
和壓力控制裝置與廢液接收裝置相連。
所述進樣裝置可為進樣閥或者自動進樣器。
上述分離柱采用的固定相可以是各種規格的聚合物材料及顆粒、硅膠以及原 位聚合的整#^才料，包括反相填料、正相填料、離子交換樹脂填料、體積排阻 填料、變性體積排阻填料、整1^i真料、硅膠以及各類衍生化填料(如固定化親和 填料、親和填料、模擬色譜填料)。
本發明的有益效果是
1 、本發明通過多次分流消除了系統中由連接管路和進樣裝置所引入的死體
積；在不增加系統死體積的同時，利用樣品在液相色譜柱上的保留，增加微流量
液相色譜的進樣量。從而實現微流量HPLC系統的大體積進樣。
2、 方法簡單，容易實現。本發明使用常規HPLC泵，通過多次分流，可使
系統中的流量達到微流量HPLC的要求；使用常規進樣裝置更換進樣環，利用色 譜柱對樣品的保留，實現樣品的大量進樣。
3、 采用進樣裝置在線大體積進樣，進樣的精度高、重復性好；方法穩定、容 易控制。
4、 具有良好的通用性，具有較高的推廣價值。本發明可應用于多種可以與質 譜匹配的分離模式的微流量HPLC的大體積進樣，包括反相色譜、正相色譜、疏 水色譜、親和色譜、固定化金屬親和色譜、體積排阻色譜等；還可與多種檢測器 相連(包括質譜)，提高檢測的靈敏度。
5、 應用范圍廣。本發明可被用在二維或者多維色譜分離中，通過不同模式色 譜分離或不同流量色譜分離模式的連接，實現蛋白質組、中藥提取物、環境樣品 等復雜樣品的分離分析。此外，系統非常容易實現自動化。
圖1為本發明實施例1裝置連接結構示意圖； 圖2為本發明實施例2裝置連接結構示意圖； 圖3為本發明實施例3裝置連接結構示意圖4為本發明對微升級低濃度蛋白質酶解產物樣品進行除鹽、富集和分離后 得到的色譜圖。
具體實施方式
實施例1:
如圖l所示， 一種微流量HPLC在線大體積進樣的方法和裝置，由泵l、第 一分流器2、進樣裝置3、第二分流器4、切換裝置5、壓力控制裝置6、檢測器7 和分離柱8組成。
泵1與第一分流器2相連，然后通過進樣裝置3與第二分流器4相連，兩個 分流器同時連接到切換裝置5上，最后流路通過一個壓力控制裝置6通入廢液。 分離柱8與第二分流器4直接相連，可減少柱前的死體積；檢測器7為柱上檢測 器。
進樣時，通過切換裝置5，使第二分流器4關閉，流路由第一分流器2分流, 樣品在低流速下由進樣裝置3引入分離柱。利用樣品在固定相上的保留，樣品停 留在分離柱8的柱頭，達到大體積進樣的目的。系統的壓力由與切換裝置5相連
的壓力控制裝置6控制。
進樣完畢后，通過切換裝置5，使第一分流器2關閉。流路通過第二分流器4 進行分流，流動相在高速下通過第二分流器4以前的管路。從而使這部分死體積 能夠被忽略。
實施例2
如圖2所示， 一種微流量HPLC在線大體積進樣的方法和裝置，由泵l、第 一分流器2、進樣裝置3、第二分流器4、切換裝置5、兩個壓力控制裝置6、檢 測器7和分離柱8組成。
泵1與第一分流器2相連，然后通過進樣裝置3與第二分流器4相連；第一 分流器2和第二分流器4分別與一個壓力控制器6相連，最終連接到切換裝置5 上；分離柱8與第二分流器4直接相連.，可減少柱前的死體積；檢測器7為柱上
進樣時，通過切換裝置5，使第二分流器4關閉，流路由第一分流器2分流。 樣品在低流速下由進樣裝置3引入分離柱。樣品利用在固定相上的保留而停留在 分離柱8的柱頭，達到大體積進樣的目的。系統的壓力由與第一分流器2相連的 壓力控制裝置6控制。
進樣完畢后，通過切換裝置5，使第一分流器2關閉，流路通過第二分流器4 進行分流。流動相在高速下通過第二分流器4以前的管路，從而使這部分死體積 能夠被忽略。系統的壓力由與第二分流器4相連的壓力控制裝置6控制。
實施例3:
如圖3所示， 一種微流量HPLC在線大體積進樣的方法和裝置，由泵l、第 一分流器2、進樣裝置3、第二分流器4、兩個切換裝置5、兩個壓力控制裝置6、 檢測器7和分離柱8組成。
泵1與第一分流器2相連，然后通過進樣裝置3與第二分流器4相連；第一 分流器2和第二分流器4分別與 一個壓力控制器6和一個切換裝置5相連，流路 通過它們成兩條通路流入廢液；分離柱8與第二分流器4直接相連，可減少柱前 的死體積；檢測器7為柱上UV檢測器。
進樣時，通過與第二分流器4相連的切換裝置5使第二分流器4關閉。流路 由第一分流器2分流，樣品在低流速下由進樣裝置3引入分離柱。樣品利用在固 定相上的保留而停留在分離柱8的柱頭，達到大體積進樣的目的。系統的壓力由與第一分流器2相連的壓力控制裝置6控制。
進樣完畢后，通過與第一分流器2相連的切換裝置5使第一分流器2關閉； 通過與第二分流器4相連的切換裝置5使第二分流器4打開，流路通過第二分流 器4進行分流；流動相在高速下通過第二分流器4以前的管路，從而使這部分死 體積能夠被忽略。系統的壓力由與第二分流器4相連的壓力控制裝置6控制。
實施例4
實驗條件毛細管(河北永年銳豐色譜器件有限公司，內徑IOO拜，外徑: 375拜)，填料C18-3mhi，液相泵日本Jasco-PU1585，質譜檢測器， 一個十通切換 閥和一個進樣閥(Rheodyne),反壓閥(Upchurch): 2000psi
樣品人上皮細胞細胞分離蛋白酶解產物
請參閱圖4，即利用本發明所提供的方法及裝置進行大體積進樣所獲得的色 譜圖。
權利要求
1. 一種微流量液相色譜在線大體積進樣的方法，其特征在于在微流量HPLC分離系統的流路中，添加多流路分流切換裝置，使得在系統進樣和分離時，流動相從不同流路分流。利用樣品在固定相上的保留，實現色譜系統的大體積進樣；具體為流動相由分流器分流后進入進樣裝置，再經另一分流器進入分離柱，在低流速下樣品由進樣裝置引入分離柱，樣品利用在固定相上的保留而停留在分離柱的柱頭，達到大體積進樣的目的。
2、 按照權利要求1所述微流量液相色譜在線大體積進樣的方法,其特征在于 所述微流量HPLC分離系統的流量在10nL/min至250uL/min范圍內。
3、 按照權利要求1所述微流量液相色譜在線大體積進樣的方法,其特征在于 所述微流量液相色譜是指微柱HPLC、毛細管HPLC或微流控芯片HPLC。
4、 一種權利要求1所述微流量液相色譜在線大體積進樣的專用裝置,包括泵. 進樣裝置、分離柱等，其特征在于泵(1 )通過第一分流器(2 )與進樣裝置(3 ) 相連；進樣裝置(3)的另一端與第二分流器(4)相連；第二分流器(4)與分離 柱(8)相連；在分離柱(8)上設置有檢測器(7);兩個分流器分別與切換裝置(5)和壓力控制裝置(6)與廢液接收裝置相連。
5、 按照權利要求4所述微流量液相色譜在線大體積進樣的專用裝置，其特征 在于所述進樣裝置為進樣閥或者自動進樣器。
6、 按照權利要求4所述微流量液相色譜在線大體積進樣的專用裝置，其特征 在于所述分離柱(8)釆用的固定相可以是各種規格的聚合物材料及顆粒、硅膠 或原位聚合的整#^措斗。
7、 按照權利要求4所述微流量液相色譜在線大體積進樣的專用裝置，其特征 在于所述分離柱(8)釆用的固定相為反相填料、正相填料、離子交換樹脂填料、 體積排阻填料、變性體積排阻填料、整*真料、硅膠或通過硅膠衍生得到的填料。
全文摘要
本發明涉及微分離系統的進樣方法，具體地說是一種微流量液相色譜在線大體積進樣的方法和專用裝置。在微流量液相色譜分離系統的流路中，添加多流路分流切換裝置，使得系統在進樣和分離時，流動相可以從不同流路分流。樣品利用在固定相上的保留，實現色譜系統的大體積進樣。具體為流動相由分流器分流后進入進樣裝置，再經另一分流器進入分離柱。在低流速下將樣品由進樣裝置引入分離柱。本發明的優點為可實現微流量分離系統中大體積樣品的上樣；克服了微流量系統中大體積進樣時帶來的梯度延遲效應，特別適合于梯度分離。系統不僅具有死體積小、柱前效應小、分離重復性好等特點，而且結構簡單、操作方便。
文檔編號G01N30/16GK101206205SQ200610134978
公開日2008年6月25日 申請日期2006年12月22日 優先權日2006年12月22日
發明者潔 張, 張麗華, 張玉奎, 張維冰, 振 梁, 梁作成, 段繼誠 申請人:中國科學院大連化學物理研究所