專利名稱：化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)心肌鈣蛋白t的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床血液免疫分析領(lǐng)域，建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白T以 早期、敏感、特異地診斷急性心肌梗死。此外本發(fā)明也可用于實(shí)驗(yàn)室作生理、病理、藥理等 多項(xiàng)研究。
技術(shù)背暴
心血管疾病是常見病和多發(fā)病，是威脅人類健康的首要疾病。急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是常見的心血管疾病，正確診斷及時(shí)救治對(duì)挽救瀕死心肌，改善 預(yù)后降低急性期病死率和死亡率具有重要意義。在AMI的生化診斷方面，肌酸激酶(CK) 及其同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)等是目前常用的心肌酶譜。但是心肌酶譜并非 心臟所特有，在正常人骨骼肌中也有少量存在。非心臟手術(shù)或骨骼肌損傷患者CK-MB也可 升高，且CK-MB在AMI發(fā)病后4一8小時(shí)才開始升高，持續(xù)時(shí)間又短(48-72小時(shí))，因而 臨床應(yīng)用受到限制。1987年英國Cummins等首先報(bào)告用測(cè)定周圍血中心肌鈣蛋白(cTn)濃度
來診斷AMI (Cummins ，et al. infarction Am heart J， 1987,113:1333-1334)。 1991年
Ka加s等人最早報(bào)道了 cTnT對(duì)診斷AMI具有髙度敏感性和特異性
(clin.chem.l991;83:902-912.)。近年來研究表明，心肌肌鈣蛋白(Cardiac Troponin)是
心肌特異的調(diào)節(jié)蛋白，其亞單位肌鈣蛋白T (cTnT)和肌鈣蛋白I (cTnl)在AMI時(shí)釋放入 血是心肌損傷的特異性標(biāo)志物，并具有靈敏度髙，在血中出現(xiàn)時(shí)間早，診斷窗口.時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu) 點(diǎn)。此外cTnT在預(yù)測(cè)梗塞面積，評(píng)價(jià)溶栓療效，AMI預(yù)后心功能判定，不穩(wěn)定心絞痛預(yù)后 評(píng)估，圍手術(shù)期心肌損傷的判定等方面均具有重要的臨床價(jià)值。
以往學(xué)者們對(duì)cTnT診斷AMI的特異性有些爭(zhēng)論。1991年katus發(fā)現(xiàn)cTnT與骨骼肌有 1%-2%交叉反應(yīng)(clin. Chem. 1991; 83 : 902-912.)。但也有學(xué)者認(rèn)為cTnT與骨骼肌的基因編 碼不同，兩者在結(jié)構(gòu)和免疫原方面有很大差別。在檢測(cè)cTnT的方法改進(jìn)后，用兩種均為心
肌特異的單克隆抗體檢測(cè)cTnT時(shí)，與骨骼肌交叉反應(yīng)陽性率<0.5% (Katus HA^ etal. Clin. chem. 1992 , 38: 386)。 Baum等人對(duì)75名無心臟病的骨骼肌患者(其中33名Duche皿e病， 42例馬拉松運(yùn)動(dòng)員長(zhǎng)跑后)用改進(jìn)后的檢測(cè)方法檢測(cè)cTnT,未發(fā)現(xiàn)一例陽性反應(yīng)(Bodor GS. etal. Clin. chem. 1992 ， 38: 2203.)。由此可以認(rèn)為，在無心臟病的骨骼肌中及運(yùn)動(dòng)員血漿 中未發(fā)現(xiàn)cTnT存在，所以cTnT對(duì)診斷急性心肌梗死與cTnl同樣具有心肌特異性。然而當(dāng) 發(fā)生AMI時(shí)，cTnT在升髙倍數(shù)和持續(xù)時(shí)間上優(yōu)于cTnl，因?yàn)閏TnT在正常人血清中含量很 低，在心肌細(xì)胞中含量高，一旦少量釋放入血漿，cTnT即可升高30-200倍，而cTnl僅升高 10"20倍(楊振華中華醫(yī)學(xué)雜志。1992, 72 (1) 51-52)。另外cTnT在血液和淋巴液中消 除速率慢，AMI時(shí)cTnT升高可持續(xù)2--3周，較cTnl持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。
因?yàn)閏TnT在血中正常含量很低，測(cè)定方法需有很低的可測(cè)限和較高的靈敏度。最初建 立檢測(cè)血清cTnT的ELISA方法是基于親和純的一種多抗和一種單抗建立起來的，以后又發(fā) 展了更敏感特異的ELISA單抗一步法，整個(gè)反應(yīng)90分鐘完成，檢測(cè)范圍0.1-15 Pg/L 。由 于全部采用單抗，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較高，與骨骼肌交叉反應(yīng)性率<0.5% (KatusHA.etal.Clin. chem.，1992， 38:386)?？焖俣ㄐ詼y(cè)定方法采用金免疫層析法(鄭佐婭，陶義訓(xùn)，上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn) 雜志，1996, 11, 57-58。)。
1977年Arakawe創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescent imm皿oas幼y ，CLIA)。該 方法可以使檢測(cè)范圍達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)，并且敏感度可達(dá)10的負(fù)18次方摩爾水平。
同化學(xué)發(fā)光免疫分析方法相比，酶免疫分析法和金免疫層析法在敏感度上要低得多。
發(fā)明內(nèi)容
親合素一生物素雙單抗夾心一步法檢測(cè)cTiiT方法該方法需要兩種同cTnT反應(yīng)具有不 同結(jié)合位點(diǎn)的單抗。需制備單抗(1)同生物素的復(fù)合物，單抗(2)同酶的復(fù)合物，將鏈霉 親合素固化于固相載體上。當(dāng)￥抗(1)同生物素的復(fù)合物、單抗(2)同酶的復(fù)合物和樣品 (或標(biāo)準(zhǔn)品)一起加入反應(yīng)池后，通過一步法生成復(fù)合物固相載體一鏈霉親合素一生物素 一單抗(l) —cTnT一單抗(2) —酶，經(jīng)過洗滌后加入底物、氧化劑、增強(qiáng)劑便可法光。
競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)cTnT的方法只需用一種單抗。首先制備cTnT—鏈霉親合素的復(fù)合物，酶一 生物素的復(fù)合物，將單抗固化于固相載體上。當(dāng)樣品(或標(biāo)準(zhǔn)品)同cTnT—鏈親合素復(fù)合物、
酶一生物素復(fù)合物一起加入反應(yīng)池，經(jīng)過反應(yīng)、洗滌后加入酶的底物、氧化劑、增強(qiáng)劑便可 發(fā)光。
若底物是二酰基肼的衍生物，則單抗(2)所結(jié)合的酶為辣根過氧化物酶；若底物是環(huán)1， 2—二氧乙烷衍生物(AMPPD)，則單抗(2)所結(jié)合的fil為堿性磷酸酶。
酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析法可采用全自動(dòng)檢測(cè)儀，也可采用半自動(dòng)發(fā)光儀。根據(jù)需要，固 相載體可選用多孔板或磁微粒。
單克隆抗體同酶或生物素的結(jié)合已有多處報(bào)道，現(xiàn)已成常規(guī)方法
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3、 尹伯元、王仁芝、李振甲、許以平等編著《標(biāo)記免疫學(xué)》41一50頁。
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具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
cTnT的提取、純化及其單克隆抗體的制備。參照文獻(xiàn)(Jin J-P， J. Biol. Chem. 1988， 263(15) :7309 ; 傅朝平等細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，1996, 12 (1): 39 ;周國華 等，中國生理學(xué)雜志，2004, 6 (2): 198;張海珠等，鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003年， 03期；李志梁、傅朝平等，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，第五期)，將新鮮無心臟病的 心肌組織無鹽勻漿，70'C高鹽萃取，硫酸銨鹽析，DEAE纖維素柱層析，獲得cTnT純品。100g 心肌組織獲得4. 5mg cTnT。經(jīng)凝膠電泳cTnT為一條帶，經(jīng)免疫印跡鑒定證實(shí)DEAE纖維柱層 析第二峰為cTnT的活性峰。
cTnT免疫BALB/c小鼠。首次用35ugcTnT同等體積不完全佐劑混合(含2. 0mg卡介苗) 腹腔注射，以后每周脾內(nèi)注射cTnT 35ug,共免疫3次。第4次為加強(qiáng)免疫，cTnT50ixg脾 內(nèi)注射，3—5天內(nèi)進(jìn)行融合。
細(xì)胞融合及單抗產(chǎn)生小鼠脾細(xì)胞同Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按l: 5進(jìn)行融合?？寺』囵B(yǎng),3 次間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞珠。接種BALB/c:成年小鼠基礎(chǔ)免疫用0. 2ml降植烷和不 完全佐劑腹腔注射，1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞懸液，10—12天處死接種小鼠，收集腹水， 其效價(jià)在1.5X10的負(fù)6次至1.0X10的負(fù)7次方。經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、濃縮后加甘 油置一201C保存。。相加試驗(yàn)證實(shí)，A3、 D6可識(shí)別cTnT不同位點(diǎn)。該單抗不與cTnl及骨骼 肌反應(yīng)。A3稱為單抗(1), D6稱為單抗(2)。
實(shí)施例2
辣根過氧化物酶發(fā)光體系的配制方法發(fā)光底物二?；碌难苌?優(yōu)選魯米諾)濃度 為1.0mMol/L。復(fù)合氧化劑過硼酸鈉一H2O2各為1. OmMol/L。復(fù)合增強(qiáng)劑對(duì)羥基肉硅酸一 對(duì)碘酚各為0. 05mMol/L。用0.1Mol/L， pH8. 60的Tris—HCl緩沖液調(diào)整pH。
實(shí)施例3
親合素一生物素雙單抗夾心一步法檢測(cè)cTnT化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立
1、 按前述文獻(xiàn)制備單抗(l)同生物素的復(fù)合物，單抗(2)同辣根過氧化物酶的復(fù)合物，將 鏈霉親合素結(jié)合于Nunc板上。
2、 建立親合素一生物素雙單抗夾心一步法檢測(cè)cTnT的CLIA法。將待測(cè)血淸(或cTnT的標(biāo) 準(zhǔn)品)、單抗(1)同生物素的復(fù)合物、單抗(2)同辣根過氧化物酶的復(fù)合物各50ul加入經(jīng) 鏈霉親合素包被的Nanc板孔中，37'C溫育60分鐘，用PBST洗滌3次，加入魯米諾底物溶 液(具體配制見實(shí)施例2)，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)425nm發(fā)光值，由微機(jī)軟件算出樣品 含量。該方法的靈敏度經(jīng)測(cè)定(Bo+2SD)為0.005ng/ml，檢測(cè)范圍0. Ol — l. 50 ng/ml。
實(shí)施例4
正常人與AMI患者血液內(nèi)cTnT含量測(cè)定。正常人51例，AMI患者19例，正常人組cTnT 的含量為0.02土0.01ng/mL， AMI組為0. 95±0. 22 ng/mL。
權(quán)利要求
1. 心肌鈣蛋白T(cTnT)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于用辣根過氧化物酶促化學(xué)發(fā)光體系。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫分析方法，其特征在于用雙單抗夾心法和/或競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)cTnT。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述辣根過氧化物酶促化學(xué)發(fā)光體系，其特征在于用二?；卵苌镒鳛?發(fā)光底物，過氧硼酸鈉一H202作為復(fù)合氧化劑，對(duì)羥基肉硅酸一對(duì)碘酚作為復(fù)合增強(qiáng)劑, 辣根過氧化物酶作為酶促催化劑。
全文摘要
一種用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的分析方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101206225SQ20061013040
公開日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者王仁芝, 蘇殿杰, 蘇 韓, 魏桂梅 申請(qǐng)人:天津天美生物技術(shù)有限公司