專利名稱：血清中尿素的化學發光測定方法
技術領域：
本發明涉及一種醫用試劑檢測方法，特別涉及血清中尿素的化學發光測定方法。
背景技術：
利用現代生物技術所開發的超微量測定方法，極大的推動了生物和醫學各領域的各項臨床和科研工作的快速發展，為人類的科學事業和社會進步作出了非凡的貢獻。
上世紀七十年代由Arakawa首先發表了應用魯米諾——過氧化物酶的化學發光反應進行酶免分析的技術，這一技術由于靈敏度高達10-18mol，可在20分鐘內快速測定出結果，可簡便實現完全自動化，有效期長達一年以上，無放射性和致畸物質，利于環保而受到普遍歡迎，是目前發展最迅速的檢測技術。
目前，化學發光技術在免疫分析中已得到相當普及的程度，已發展為能檢測多種生物活性物質的常規監床檢測方法，從免疫反應方式分，該方法有兩種基本類型，即化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)和免疫化學發光分析(Immunochemiluminometricassay，ICMA)；從發光方式上看，一是將發光物質直接標記到抗體或抗原上，免疫反應后，在起動劑的作用下而發光，另一種是用酶標記抗體或抗原，免疫反應后，加入化學發光底物，在酶催作用下而發光。
該方法雖有突出的優點，但目前僅限于免疫分析，而在生化分析中還是空白。
血清尿素或尿素氮受生理性和病理性因素的影響。生理因素有高蛋白飲食血清尿素和尿液排出量顯著增高；血清尿素男性高于女性；隨年齡增加而升高；妊娠女低于非孕女；一天中不同時間也有變化。
病理性血液尿素增加腎前性有，失水使血液尿素潴留；如劇烈嘔吐、幽門梗阻、腸梗阻、長期腹瀉等；腎性急性腎小球腎炎、腎病晚期、腎功能衰竭、慢性腎盂腎炎、中毒性腎炎等；腎后性疾病有前列腺腫大、尿路結石、尿路狹窄、膀胱腫瘤等。
血尿素減少較少見，如肝炎合并廣泛性肝壞死。
現在普遍使用的測定血清中尿素的方法為比色法，該法是利用脲酶使尿素放出氨，后者與α-戊酮二酸和NADH在谷氨酸脫氫酶催下生成谷氨酸等，NADH的下降速率與尿素的含量成正比，以此測定尿素的濃度。該法的不足之處主要有1、線性范圍窄。由于檢測對顏色的變化分辨率不像化學發光那么敏感，線性范圍不能完全滿足臨床檢測的需要，對高濃度的樣品需要經稀釋后測定，帶來一定不便。
2、靈敏度不如化學發光。比色法是比顏色的深淺，而化學發光是測定光信號，靈敏度要高出許多。
3、只能用儀器操作。有的是測定酶促反應的速率，對時間要求十分嚴格，手工或半自動操作均難達到要求，只能使用全自動設備進行。
4、全自動生化儀昂貴。目前使用的全自動生化儀幾乎全為進口，設備十分昂貴，大多在幾十萬到幾百萬之間，中小醫院難以承受，普及使用受到限制。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是一種提供能克服上述缺陷、靈敏度高、線性范圍寬、方便、安全的血清中尿素的化學發光測定方法。解決該技術問題采用的主要技術方案血清中尿素的化學發光測定方法，其特征在于尿素在脲酶作用下放出氨；氨與α-戊酮二酸和NADH在谷氨酸脫氫酶催下生成谷氨酸；而谷氨酸經其氧化酶(GLOD)氧化而生成過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶的作用下，使化學發光物氧化而發光；光信號的大小與尿素的濃度呈正相關，即尿素濃度越大發出的光信號越強；記錄這種光信號即可推測尿素的濃度；用已知濃度的尿素與測出的光信號，作出劑量-反應曲線；未知樣品的尿素含量可從該曲線推算出來；所述的化學發光物為魯米諾；所述的尿素可以是血漿中的尿素；所述的尿素也可以是尿液中的尿素。本發明與現有技術相比有如下優點該方法的特征在于用化學發光物代替顯色物，達到更靈敏、更穩定、范圍寬、更安全的目的。用該方法可以制備相應的定量測定尿素的商品試劑盒。具體優點是①靈敏度更高。傳統方法是檢測顏色深淺，而化學發光是測光信號，可一個一個光子計數，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。②線性范圍寬。測顏色的深淺的分辨率比光子計數的精度要低得多，化學發光的檢測范圍高達105。③安全適用。化學發光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利于環境保護。④便于普及。本發明所制備的試劑盒，可用于全自動測量，也可用于手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫療和研究機構使用。⑤巨大的社會效益。用化學發光法測定生化指標或免疫物質，可同用一臺化學發光儀，不再需要進口昂貴的生化儀，節省大量資金，不只降低了成本，對醫療機構、患者及社會均大有益處。
具體實施例方式現舉例說明本發明的實施例。尿素在脲酶作用下放出氨；氨與α-戊酮二酸和NADH在谷氨酸脫氫酶催下生成谷氨酸；而谷氨酸經其氧化酶(GLOD)氧化而生成過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶的作用下，使化學發光物氧化而發光；光信號的大小與尿素的濃度呈正相關，即尿素濃度越大發出的光信號越強；記錄這種光信號即可推測尿素的濃度；用已知濃度的尿素與測出的光信號，作出劑量-反應曲線；未知樣品的尿素含量可從該曲線推算出來；所述的化學發光物為魯米諾；所述的尿素可以是血漿中的尿素；所述的尿素也可以是尿液中的尿素；這便是本發明的血清中尿素的化學發光測定方法。該方法可用于測定血漿、血清或尿液中的尿素含量。
一、試劑包括混合酶液；尿素標準單一或系列濃度；底物液二、測定程序按下表進行，加樣單位為μl。
三、用適當方法處理作出劑量-反應曲線，根據樣品的RLU值從該曲線求出其血清尿素或尿素氮的濃度。或直接由公式求出尿素濃度＝(樣品RLU/標準RLU)×標準濃度尿素氮＝尿素濃度×28四、也可用雙試劑測定。
本發明的靈敏度更高因為傳統方法是檢測顏色深淺，而本發明是測光信號，可一個一個光子計數，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。線性范圍寬這是因為傳統的測顏色的深淺的分辨率比光子計數的精度要低得多，本發明的化學發光檢測范圍高達105。安全適用本發明的化學發光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利于環境保護。便于普及本發明所制備的試劑盒，可用于全自動測量，也可用于手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫療和研究機構使用。社會效益巨大用本發明的化學發光測定方法測定生化指標或免疫物質，可同用一臺化學發光儀，不再需要進口昂貴的生化儀，節省大量資金，不只降低了成本，對醫療機構、患者及社會均大有益處。本發明方法簡單，成本低，適于大、中、小醫療機構廣泛推廣應用。
權利要求
1.血清中尿素的化學發光測定方法，其特征在于尿素在脲酶作用下放出氨；氨與α-戊酮二酸和NADH在谷氨酸脫氫酶催下生成谷氨酸；而谷氨酸經其氧化酶(GLOD)氧化而生成過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶的作用下，使化學發光物氧化而發光；光信號的大小與尿素的濃度呈正相關，即尿素濃度越太發出的光信號越強；記錄這種光信號即可推測尿素的濃度；用已知濃度的尿素與測出的光信號，作出劑量-反應曲線；未知樣品的尿素含量可從該曲線推算出來。
2.根據權利要求1所述的血清中尿素的化學發光測定方法，其特征在于所述的化學發光物為魯米諾。
3.根據權利要求1所述的血清中尿素的化學發光測定方法，其特征在于所述的尿素可以是血漿中的尿素。
4.根據權利要求1所述的血清中尿素的化學發光測定方法，其特征在于所述的尿素也可以是尿液中的尿素。
全文摘要
本發明血清中尿素的化學發光測定方法，涉及一種在生化分析中醫用試劑的化學發光測定方法。現有的方法檢測范圍窄、靈敏度低、操作要求高、儀器昂貴等技術問題。解決該技術問題的主要技術方案血清中尿素的化學發光測定方法，其特征在于尿素在脲酶作用下放出氨；氨與α－戊酮二酸和NADH在谷氨酸脫氫酶催下生成谷氨酸；而谷氨酸經其氧化酶氧化而生成過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶的作用下，使化學發光物氧化而發光；尿素濃度越大發出的光信號越強；用已知濃度的尿素與測出的光信號，作出劑量－反應曲線；未知樣品的尿素含量可從該曲線推算出來。它靈敏度更高、線性范圍寬、成本低，準確性高，便于普及，適于大、中、小各類醫療機構廣泛應用。
文檔編號G01N33/62GK1912589SQ20061011497
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月10日 優先權日2006年8月10日
發明者王京, 高淑舫 申請人:福建省洪誠生物藥業有限公司