專利名稱：血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法
技術領域：
本發明涉及對人血清中缺血修飾白蛋白進行檢測的方法。該方法利用急性冠狀動脈綜合癥(ACS)患者血清中缺血修飾白蛋白與外源性Co2+結合能力減弱的特性，在血清中加入一定濃度鈷溶液，使其與血清中白蛋白充分結合，再加入試劑檢測反應體系中的游離鈷，通過吸光度變化表示游離鈷含量變化，進而間接表示缺血修飾白蛋白的濃度。
背景技術：
人血清白蛋白(HSA)是一種循環蛋白，其氨基末端序列為人類所特有，能與金屬鈷、銅和鎳等離子結合，與其它種屬動物白蛋白相比，HSA的金屬結合位點更易受生物化學因素的影響而被降解。人血清白蛋白在氧自由基作用下，其氨基末端結構發生改變，導致其與某些外源性金屬鈷、銅、鎳結合能力減弱的白蛋白，稱為缺血修飾白蛋白(Ischemia modified albumin IMA)。
研究表明IMA基本具備理想心肌缺血標志物基本特征，在以下幾個方面具有重要價值(1)對于因胸痛或不適來就診的急診患者進行危險分層，對低危患者有助排除ACS診斷。
(2)作為對疑似ACS患者最早升高的短期缺血危險分層標志物，有助于臨床醫師早期恰當處理病人。傳統的心肌損傷標志物常在心肌細胞發生壞死后血中濃度方可升高，IMA在心肌可逆的心肌缺血階段血中濃度即迅速升高，可早期并靈敏地反應心肌缺血狀況，將心肌缺血的診斷窗由原來的缺血發生后4-6小時提前到5-10分鐘。
目前，IMA測定一般利用正常人血清中白蛋白能與Co2+結合而缺血修飾白蛋白與Co2+結合能力減弱的特性，采用白蛋白-鈷結合試驗(ACB)進行。正常人白蛋白以活性形式存在，加入鈷試劑后，Co2+與人血清白蛋白N-末端結合，溶液中游離Co2+濃度下降，心肌缺血病人血清標本中含有大量的IMA，加入同等量的鈷試劑后，由于IMA與Co2+的結合能力下降，溶液中存在較多量的游離Co2+，加入二硫蘇糖醇(DTT)試劑后，游離鈷可與二硫蘇糖醇反應，產生棕紅色化合物。游離鈷含量越高，顏色欲深，用分光光度計測定吸光度值大小，從而間接表示血清中IMA含量。
由于DTT做顯色劑存在檢測結果常隨生產廠家、試劑種類、批號等引起結果不穩定，分辨率明顯不高和測試溶液后價格略高的問題，本發明人提出了使用二硫赤蘚糖醇(DTE)作為檢測反應體系中游離鈷的顯色試劑的優選方法。
在上述缺血修飾白蛋白測定方法中，有二種結果表達方式一種是吸光度單位；一種是單位定義，即在某一特定條件下吸光度上升或下降某一吸光度為1U/L，此二種結果表達方式均為相對單位，無法實現溯源，這對定量檢測試驗而言，屬通常不采用的方式，應在無法溯源與無確定標準的情況下迫不得已才采取的一種方式。
發明內容
本發明的目的在于通過檢測反應體系中剩余鈷含量的方式，以游離鈷含量表示血清與鈷結合程度，表述缺血修飾白蛋白與鈷結合力的下降，從根本上解決了缺血修飾白蛋白定量問題，并將檢測結果以游離鈷濃度報告。
本發明的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，利用缺血修飾白蛋白鈷結合能力減弱的特性，使用化學試劑檢測反應體系中的游離鈷，獲得吸光度變化表示游離鈷含量變化，間接表示缺血修飾白蛋白的濃度，并將所述的對游離鈷檢測的結果以游離鈷濃度指標替代吸光度，避免由于儀器或試劑性能差別和不穩定導致缺血修飾白蛋白檢測結果的不穩定。
本發明的缺血修飾白蛋白測定方法，根據檢測結果數據，制作游離鈷濃度指標與吸光度的關系曲線，確認鈷濃度與吸光度之間的線性關系為C測定＝A(測定-測定對照管)/A(標準-標準對照管)*C標準其中，C標準為標準液含游離鈷的濃度，C測定為所測血清反應體系中含游離鈷的濃度，A(測定-測定對照管)為測定管吸光度與測定對照管吸光度的差值，A(標準-標準對照管)為標準管吸光度與標準對照管吸光度的差值。
本發明的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，可以根據鈷溶液的專用國家標準，實現數據的溯源。
在檢測測定方法的精密度時，檢測高低二個濃度樣本，確定儀器內CV＜5％，批內CV＜5％，符合測試要求。
本發明的的缺血修飾白蛋白測定方法，避免采用吸光度報告時由于儀器或試劑性能差別和不穩定導致缺血修飾白蛋白檢測結果不穩定的問題，本檢測方法所使用的鈷標準溶液可以溯源至國家標準。
具體實施例方式
本發明以二硫赤蘚糖醇(DTE)作為檢測反應體系中的游離鈷的顯色試劑為例敘述具體的實施方式。所用的測試管采用血清180μl，加入2.48mmol/L氯化鈷溶液120μl，加pH7.8的Tris-HCl緩沖液1600ul，混勻放37℃水浴箱8分鐘，加入5mmol/L的DTE 200ul，混勻放37℃溫育2分鐘，在UV-2800紫外可見分光光度計下，在波長480nm處比色，測定游離鈷濃度。具體的測試方案見表1表1
用分光光度計，10mm比色杯，在480nm處以蒸餾水調零，分別讀取上述4個測試管的吸光度。
吸光度和血清反應體系中含游離鈷的濃度之間所存在的對應關系，通過DTE法標準曲線的制作得出。
該曲線的制作方法是將CoCl2分別配置成620μmol/l，1240μmol/l，1860μmol/l，2480μmol/l四種不同濃度，用上述方法檢測其濃度與吸光度的線性關系。
1.系列標準液按照下表配制①2480μmol/l CoCl2配置稱29.5mgCoCl2，用去離子水30ml將其溶解于燒杯中，待溶解后，移入50ml容量瓶中補足。
②1240μmol/l CoCl2配置取10.0ml①液加入10.0ml去離子水混勻即可。
③1860μmol/l CoCl2配置取5ml②液，加入5ml①液，混勻即可。
④620μmol/l CoCl2配置取5ml②液，加入5ml去離子水混勻即可。
⑤0μmol/l CoCl2配置用生理鹽水替代。
2.標準曲線測定
混勻放37℃ 2min取出，在Uv-2800分光光度計上480nm處比色，以空白管為空白，由低濃度到高濃度比色，記錄各反應管吸光度。
3.測量結果如下表
A0＝-100.61A1＝2917.3R＝0.99924.結論本法檢測Co2+的線性可達2480μmol/l。
根據以上測量結果，確定吸光度與CoCl2濃度存在線性關系，其計算方程為C測定＝A(測定-測定對照管)/A(標準-標準對照管)*C標準其中，C標準為標準液含游離鈷的濃度，C測定為所測血清反應體系中含游離鈷的濃度，A(測定-測定對照管)為測定管吸光度與測定對照管吸光度的差值，A(標準-標準對照管)為標準管吸光度與標準對照管吸光度的差值。
利用測定的反應體系中游離鈷含量，間接表示IMA濃度。以標本反應體系中含游離鈷濃度(umol/l血清)報告結果。
計算的結果以游離鈷含量表達，游離鈷含量的單位為μmol/L。
檢測的數據的可靠性分析根據分析校準函數(測量函數的反函數)Y＝X/A1-b/A1，分析靈敏度R應在2700～3000之間；不確定度CV＜5％，線性0-2480mmol/L。
測量正確度該方法所用鈷標準溶液已溯源至國家標準物質。(標準號GBW08613，200604)。
測量精密度按EP5-A2文件要求，對本法進行精密度測試高低二個濃度連續測定5日，每日測定8批，每批測定2個數據，共80個數據。統計結果儀器內CV均＜5％。表明本試驗精密度良好。
測量的檢測限受分析靈敏度、正確度、精密度和空白值的影響。本法檢測限為0-2480μmol/L。
測量的測定低限與高限已測最低結果為770μmol/L，已測最高結果為1925μmol/L。
由于本法檢測的核心物質是游離鈷，國家計量院有鈷國家標準物質(GBW08613)，故可以將該檢測體系進行溯源。
根據下述實驗，檢測標準溶液的溯源性采用的材料鈷標準物質(GBW08613 200604)，檢測試劑盒。
采用的方法1.鈷標準物質按1∶8，1∶10，1∶20比例稀釋，配成2121，1697，848umol/l三種不同濃度鈷溶液，分別按本法溯源。
2.按下述測定步驟
生理鹽水180μl，加入鈷標準物質120μl，加PH7.8 Tris-HCl緩沖液1600ul，混勻放37℃水浴箱8分鐘，加入5mmol/L DTE200ul，混勻放37℃溫育2分鐘，在UV-2800紫外可見分光光度計下480nm處比色，以蒸餾水為空白，測定游離鈷濃度。
鈷標準物質溯源步驟
用UV-2800分光光度計，10mm比色杯，在480nm處以蒸餾水調零，分別讀取4管吸光度，根據下式計算反應體系中游離鈷含量C測定＝A(溯源-溯源對照管)/A(標準-標準對照管)*C標準，得出游離鈷濃度(umol/l)，報告結果。
3.若在生化分析儀上進行溯源，參數如下37℃ 波長480nm樣本18μL試劑243μL試劑1172μL
兩點法，吸光度上升反應。
實驗結果
結論該方法溯源結果滿足溯源要求。按本法測定鈷國家標準物質，鈷國家標準物質(GBW08613 200604)測定值為999.3ug/ML(三種濃度測定均值)，與標示值(1000ug/ML)相差0.7ug/ML，＜1％，符合溯源要求。表明本法已經實現溯源。
用本法檢測高低二個濃度樣本，按EP5-2A文件要求，測定所建IMA測試方法的精密度度所用儀器為日立UV-2800紫外可見分光光度計，501-A超級恒溫水浴箱，亞光溫濕度計，倒計時器，芬蘭雷伯移液器(10-200ul)，金花移液器(10-1000ul)；試劑與方法IMA的游離鈷濃度測定法相同；樣本1號、2號高低二個濃度樣本結果對比根據獲得的精密度實驗原始數據按傳統方法統計樣本1x＝1684.5SD＝54.99CV＝3.26％樣本2x＝1149.2SD＝43.21CV＝3.76％根據結果對比，可以得出結論高、低二個濃度樣本，按本法測定儀器內CV＜5％，批內CV＜5％，符合方法學測試要求。
權利要求
1.一種血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其利用缺血修飾白蛋白鈷結合能力減弱的特性，使用化學試劑檢測反應體系中的游離鈷，獲得吸光度變化表示游離鈷含量變化，間接表示缺血修飾白蛋白的濃度，其特征在于對游離鈷檢測的結果是以游離鈷濃度指標替代吸光度，避免由于儀器或試劑性能差別和不穩定導致缺血修飾白蛋白檢測結果的不穩定。
2.根據權利要求1的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其特征在于根據檢測結果數據，制作游離鈷濃度指標與吸光度的關系曲線，確認鈷濃度與吸光度之間的線性關系為C測定＝A(測定-測定對照管)/A(標準-標準對照管)*C標準其中，C標準為標準液含游離鈷的濃度，C測定為所測血清反應體系中含游離鈷的濃度，A(測定-測定對照管)為測定管吸光度與測定對照管吸光度的差值，A(標準-標準對照管)為標準管吸光度與標準對照管吸光度的差值。
3.根據權利要求1或2的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其特征在于該方法所用鈷溶液已溯源至國家標準物質，實現數據的溯源。
4.根據權利要求1或2的血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，其特征在于在檢測測定方法的精密度時，檢測高低二個濃度樣本，確定儀器內CV＜5％，批內CV＜5％，符合測試要求。
全文摘要
本發明提出一種血清缺血修飾白蛋白的游離鈷定量測定方法，利用缺血修飾白蛋白鈷結合能力減弱的特性，使用化學試劑檢測反應體系中的游離鈷，獲得吸光度變化表示游離鈷含量變化，間接表示缺血修飾白蛋白的濃度；根據檢測結果，制作游離鈷濃度指標與吸光度的關系曲線，確認鈷濃度與吸光度之間的線性關系為C
文檔編號G01N21/31GK1904617SQ20061010435
公開日2007年1月31日 申請日期2006年8月9日 優先權日2006年8月9日
發明者陳寶榮, 方虹, 楊振華 申請人:北京航天總醫院