專利名稱：無機磷診斷/測定試劑盒及無機磷濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種無機磷診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定 無機磷濃度的測定方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
人體內磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動 態平衡，血中鈣、磷濃度之間有一定關系，正常人血鈣升高則血磷降 低，反之亦然。血槳中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每 100毫升血漿轉磷濃度的乘積為35—"40。當二者乘積大于40時，鈣 和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，>70時，可發生轉移性鈣化。當乘積 <35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶解，影響成骨作用， 引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生素D，甲狀 旁腺激素及降鈣素的調節。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分 析磷酸鹽陰離子(H2P04"， HP042—)。常用的方法有磷鉬酸還原法，非 還原法，染料結合法，酶法，同位素稀釋質譜法、原子吸收分光光度 法和流動注射分析法等。決定性方法是同位素稀釋質譜法，WHO推薦 的中等實驗室測定無機磷的常規方法是比色法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中
加入非離子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類 很多，性能比較穩定的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米
吐爾等。表面活性劑則以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜 聚化合物，方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm 有光吸收，必須做標本空白，否則結果偏高。
酶法測定無機磷是發展趨勢，其優點是無機磷酸鹽化合物在酶作用 下的中性范圍內是穩定的，可用于常規樣品的自動化分析。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯法(Couple Reaction)技術，計量還原型煙酰胺輔酶 (還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷濃度 的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的無機磷診斷/測定試 劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化 分析儀上進行無機磷濃度的測定，而且測定速度快、準確度高，因而 可以得到切實的推廣應用。
本發明無機磷濃度測定方法原理如下
無機磷+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 谷氨酰胺合成酶
氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸
腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸羧化酶
無機磷+腺苷二磷酸+草酰乙酸
氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶
L-谷氨酸+水+輔酶
丙酮酸羧化酶(EC6.4丄1)、谷氨酰胺合成酶(EC6.3丄2)作為循 環酶谷氨酰胺合成酶的酶促作用利用無機磷和腺苷二磷酸作用產生 腺苷三磷酸；丙酮酸羧化酶再將腺苷三磷酸再次變回無機磷及腺苷二 磷酸，使無機磷不斷地被重復循環利用，產生大量的氨離子。
谷氨酸脫氫酶(EC 1.4丄2 ; EC 1.4.1.3、 EC 1.4丄4)作為顯色酶， 利用氨離子使還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度 下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算出無機 磷濃度。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明無機磷診斷/ 測定試劑盒較為理想
緩沖液100 mmol/L
穩定劑50 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶6000 U/L
谷氨酰胺合成酶6000 U/L
谷氨酸脫氫酶8000 U/L
腺苷二磷酸2 mmol/L
谷氨酰胺4 mmol/L
2-酮戊二酸酯 16mmol/L 丙酮酸 12mmol/L 二氧化碳 20 mmol/L
本發明的無機磷診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩
定劑、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、
丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化 碳、2-酮戊二酸酯、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸
脫氫酶。
腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮 酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶。
試劑3
緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶。
腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮 酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定無機磷濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
谷氨酰胺合成酶 8000 U/L
谷氨酸脫氫酶 8000 U/L
腺苷二磷酸 2 mmol/L谷氨酰胺
2-酮戊二酸酯
丙酮酸
4 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L
二氧化碳 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；
使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間IO分鐘，起
始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無
機磷樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，
檢測方法為速率法，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出無機磷
濃度的大小。
實施例二
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 腺苷二磷酸 谷氨酰胺 2-酮戊二酸酯
0.25 mmol/L 2 mmol/L 4 mmol/L 16 mmol/L丙酮酸
12 mmol/L
:氧化碳
20 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸羧化酶
谷氨酰胺合成酶
谷氨酸脫氫酶
50 mmol/L 6000 U/L 6000 U/L 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機 磷樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下 降反應)，檢測方法為速率法，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2 分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出無機磷 的濃度大小。
實施例三
本實施例的無機磷診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑
50 mmol/L還原型輔酶
0.25 mmol/L
腺苷二磷酸 谷氨酰胺 2-酮戊二酸酯 丙酮酸
二氧化碳
2 mmol/L 4 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸羧化酶 谷氨酰胺合成f
50 mmol/L 8000 U/L 8000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
50 mmol/L
谷氨酸脫氫酶 8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定無機磷濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反 應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波 長405nm，被測無機磷樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，檢測方法為速率法，延遲 時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出無機磷 濃度的大小。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化 分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好、不受內外 源物質的污染，便于推廣應用。
權利要求
1.一種酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的無機磷濃度測定方法，其方法原理如下無機磷+谷氨酰胺+腺苷二磷酸 谷氨酰胺合成酶氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳 丙酮酸羧化酶無機磷+腺苷二磷酸+草酰乙酸氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶 谷氨酸脫氫酶 L-谷氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的大小速度，測算出無機磷濃度大小測定結果。
2. —種無機磷診斷/測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液20－500 mmol/L 穩定劑 1-50 mmol/L 還原型輔酶 0.1-0.35 mmol/L 丙酮酸羧化酶 1000-500000 U/L 谷氨酰胺合成酶 1000-500000 U/L 腺苷二磷酸 1－12 mmol/L 谷氨酰胺 4-20 mmol/L 2-酮戊二酸酯 4-20 mmol/L丙酮酸 5-20 mmol/L二氧化碳 5——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、 2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶(EC6.4丄1)、谷氨酰胺合成酶(EC 6.3丄2)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4丄2 ; EC 1.4丄3、 EC 1.4丄4)、還原型輔酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、 2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶(EC6.4丄1)、谷氨酰胺合成酶(EC 6.3丄2)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4丄2 ; EC1.4丄3、 EC 1.4丄4)、還 原型輔酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、 谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、還原型輔酶組成； 試劑2，由緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷 氨酸脫氫酶組成。腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、還 原型輔酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、 2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶(EC6.4.1.1)、谷氨酰胺合成酶(EC6.3.1.2)、谷氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2 ; EC1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、還 原型輔酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、腺苷二磷酸、 谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、還原型輔酶組成； 試劑2，由緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶組成; 試劑3，由緩沖液、穩定劑、谷氨酸脫氫酶組成。腺苷二磷酸、谷 氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶、谷氨 酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述無機磷診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩定劑1一4000 mmol/L或0.1％-100％體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的無機磷診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定無機磷濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、腺苷二磷酸、谷氨酰胺、丙酮酸、二氧化碳、2-酮戊二酸酯、丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶(偶)促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的大小速度，從而測算出無機磷的濃度。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果，便于推廣應用。
文檔編號G01N33/84GK101173937SQ20061009731
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優先權日2006年10月30日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司