專利名稱：二氧化碳診斷/測定試劑盒及二氧化碳濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測 定二氧化碳濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
血液內二氧化碳的含量對人體內酸堿平衡的調節起著重要的作
用。血液pH的恒定是維持生命活動必不可少的條件，血漿中的多種緩 沖系統中以碳酸氫鹽緩沖系統最為重要，直接影響血液的PH。
血液內二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純 代謝性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根[HC03—]下降或升高，總二氧化碳 也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根升高 或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測定方法較可分為直接測定和間接推算 兩類。直接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Corway微 量擴散法、流動注射氣體擴散法等。間接推算是利用血氣分析儀測得 的PH與PCO"根據H-H方程的變換形式 HC03— (m mol /L) =0.03XPC02Gnm Hg) Xantilog(PH—p ka)或 HC(V (m mol/L)二0. 225XPC02(k Pa) Xantilog(PH-p Ka) 計算獲得。
式中PH為37。 C時測得值，pka在37。 C為6. 10。
目前，以間接推算法應用較普遍，由血液分析儀的微處理計算機并 與血氣分析結果一起報告，準確性基本可以符合臨床要求。
直接測定法以滴定法應用最廣泛，但由于受多種因素影響，測定誤
差較大。
酶法測定適合自動化分析，結果可靠，應當是很有前途的測定方 法，但目前尚有待深入研究。
檢索中國專利發現，申請號為96190276.0、申請日為1996. 02. 06 的發明專利申請公開了一種用來導出病人血液中氣體含量的非侵入性 的系統和方法。該系統相應于體積測量呼氣中的二氧化碳濃度。然后 處理該數據導出動脈血中二氧化碳氣體水平。若數據為時間域，處理 可將時間域數據轉換成體積域。該方法也經迭代評估了多個變量的顯 著性，所得的關系可供快速和準確地對健康人和患肺病病人進行血中 氣體含量的測定。近年來，申請號為02282386. 7、申請日為2002. 10. 29 的實用新型專利公開了一種醫用的血液碳酸氫根測定儀，主要由操作 面板、進樣檢測機構、定滴加液機構、攪拌機構和以單片機為主控元 件的電器控制部分組成。其操作面板包括有手動按鍵、輸入鍵盤和顯 示屏；進樣檢測機構由沿圓周均布樣本孔且在孔內放置樣本瓶的樣本 轉盤和豎直裝配在轉盤下面的驅動電機及對應于檢測位樣本孔設置的 光電檢測器組成；定滴加液機構由配置電機的微量泵和設置于樣本孔 上方的定滴頭及配置在定滴頭滴液口處的計滴器組成；攪拌機構由設 置在樣本轉盤下方相應位置的攪拌電機和裝配在攪拌電機軸上的磁盤 及放置于樣本瓶內的攪拌棒組成。
以上專利均與酶法測定無關，這從一個側面說明，國內此方面的 實驗研究十分缺乏。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測
還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得 以測定二氧化碳濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法 的二氧化碳診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析 儀或半、全自動生化分析儀上進行二氧化碳濃度測定，而且測定速度 快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明二氧化碳濃度測定方法原理如下
二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素bl 丙酮酸脫氫酶
丙酮酸+高鐵細胞色素1)1+水 丙酮酸+還原型輔酶乳酸脫氫酶 L-乳酸+輔酶 這種方法應用丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase (cytochrome) ; EC 1.2.2.2 )酶(偶)聯乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase ; EC 1丄1.27 ; EC U丄28)酶促反應終點/速率比色 法。丙酮酸脫氫酶酶解二氧化碳反應產生丙酮酸，再通過(偶)聯合 乳酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化 成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下降的程 度/速度，可以測算二氧化碳的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明二氧化碳診 斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
乳酸脫氫酶 20000 U/L
乙酸 20 mmol/L
亞鐵細胞色素bl 6mmol/L
本發明的二氧化碳診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素M、丙酮
酸脫氫酶、乳酸脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl。 試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶。 還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫 酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。 試劑2
緩沖液、乙酸、亞鐵細胞色素bl。
試劑3
緩沖液、穩定劑、乙酸、亞鐵細胞色素bl、丙酮酸脫氫酶、 乳酸脫氫酶。
還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫 酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉 狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定二氧化碳濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
乳酸脫氫酶 20000 U/L
乙酸 20 mmol/L
亞鐵細胞色素bl 6mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑; 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始
吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧 化碳樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)， 延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出二氧化 碳的濃度大小。 實施例二
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩定劑
還原型輔酶
乙酸
亞鐵細胞色素bl
50 mmol/L
0.25 mmol/L
30 mmol/L
9 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸脫氫酶 乳酸脫氫酶
50 mmol/L 3000 U/L 25000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始
吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧 化碳樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下 降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出二氧化 碳的濃度大小。 實施例三
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩定劑
還原型輔酶
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
亞鐵細胞色素bl
15 mmol/L
12 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸脫氫f
乳酸脫氫酶
50 mmol/L 22000 U/L 30000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用
測定二氧化碳濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，
反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副 波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例 為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左 右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出二 氧化碳的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應 用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的二氧化碳濃度測定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100972130002C1.gif" wi="133" he="26" top= "48" left = "37" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出二氧化碳的濃度大小測定結果。
2. —種二氧化碳診斷/測定試劑盒，主要成分包括:緩沖液 20-500 mmol/L穩定劑 1-50 mmol/L還原型輔酶 0.1-0.35mmol/L丙酮酸脫氫酶 1000——80000 U/L乳酸脫氫酶 1000——80000 U/L乙酸1-50 mmol/L亞鐵細胞色素bl 1-50 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用: 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于
4. 根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、丙酮 酸脫氫酶、乳酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、 還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl組成；試劑2，由緩沖液、 穩定劑、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶組成。還原型輔酶、乙酸、亞 鐵細胞色素bl、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、丙酮 酸脫氫酶、乳酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、 還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、乙酸、亞鐵細胞色素bl組 成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶組成。 還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫 酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于還 包括穩定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定二氧化碳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/84GK101169445SQ20061009721
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優先權日2006年10月24日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司