專利名稱：二氧化碳診斷/測定試劑盒及二氧化碳濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定二氧化碳濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
血液內二氧化碳的含量對人體內酸堿平衡的調節起著重要的作用。血液pH的恒定是維持生命活動必不可少的條件，血漿中的多種緩沖系統中以碳酸氫鹽緩沖系統最為重要，直接影響血液的pH。
血液內二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純代謝性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根[HCO3-]下降或升高，總二氧化碳也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時，血液碳酸氫根升高或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測定方法較可分為直接測定和間接推算兩類。直接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴散法、流動注射氣體擴散法等。間接推算是利用血氣分析儀測得的PH與PCO2，根據H-H方程的變換形式 HCO3-(m mol/L)＝0.03×PCO2(mm Hg)×antilog(PH-p ka)或 HCO3-(m mol/L)＝0.225×PCO2(k Pa)×antilog(PH-p Ka) 計算獲得。
式中PH為37℃時測得值，p ka在37℃為6.10。
目前，以間接推算法應用較普遍，由血液分析儀的微處理計算機并與血氣分析結果一起報告，準確性基本可以符合臨床要求。
直接測定法以滴定法應用最廣泛，但由于受多種因素影響，測定誤差較大。
酶法測定適合自動化分析，結果可靠，應當是很有前途的測定方法，但目前尚有待深入研究。
檢索中國專利發現，申請號為96190276.0、申請日為1996.02.06的發明專利申請公開了一種用來導出病人血液中氣體含量的非侵入性的系統和方法。該系統相應于體積測量呼氣中的二氧化碳濃度。然后處理該數據導出動脈血中二氧化碳氣體水平。若數據為時間域，處理可將時間域數據轉換成體積域。該方法也經迭代評估了多個變量的顯著性，所得的關系可供快速和準確地對健康人和患肺病病人進行血中氣體含量的測定。近年來，申請號為02282386.7、申請日為2002.10.29的實用新型專利公開了一種醫用的血液碳酸氫根測定儀，主要由操作面板、進樣檢測機構、定滴加液機構、攪拌機構和以單片機為主控元件的電器控制部分組成。其操作面板包括有手動按鍵、輸入鍵盤和顯示屏；進樣檢測機構由沿圓周均布樣本孔且在孔內放置樣本瓶的樣本轉盤和豎直裝配在轉盤下面的驅動電機及對應于檢測位樣本孔設置的光電檢測器組成；定滴加液機構由配置電機的微量泵和設置于樣本孔上方的定滴頭及配置在定滴頭滴液口處的計滴器組成；攪拌機構由設置在樣本轉盤下方相應位置的攪拌電機和裝配在攪拌電機軸上的磁盤及放置于樣本瓶內的攪拌棒組成。
以上專利均與酶法測定無關，這從一個側面說明，國內此方面的實驗研究十分缺乏。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定二氧化碳濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的二氧化碳診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行二氧化碳濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明二氧化碳濃度測定方法原理如下 二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素b1 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸+高鐵細胞色素b1+水 丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+ 乙酰輔酶A+還原型輔酶 這種方法應用細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶(cytochrome-dependent pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.2.2)酶(偶)聯輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶(NAD(P)+-dependent pyruvate dehydrogenase；EC1.2.1.51)酶促反應連續監測法。細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶作為作用酶，功能為將二氧化碳酶解產生丙酮酸。輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶作為循環酶輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶的酶促作用使丙酮酸再次變回二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重復循環利用。輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶也同時作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算出二氧化碳的濃度。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明二氧化碳診斷/測定試劑盒較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 輔酶A6mmol/L 乙酸 20mmol/L 亞鐵細胞色素b1 9mmol/L 細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 本發明的二氧化碳診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1 緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩定劑、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶。
輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A。
試劑2 緩沖液、乙酸、亞鐵細胞色素b1。
試劑3 緩沖液、穩定劑、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶。
輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定二氧化碳濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式 下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 輔酶A6mmol/L 乙酸 20mmol/L 亞鐵細胞色素b1 9mmol/L 細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
實施例二 本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 輔酶A 8mmol/L 乙酸 30mmol/L 亞鐵細胞色素b1 12mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶12000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
實施例三 本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 輔酶3mmol/L 輔酶A 12mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 乙酸10mmol/L 亞鐵細胞色素b1 6mmol/L 試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶8000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶8000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定二氧化碳濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
申請人:經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法的二氧化碳的濃度測定方法，其方法原理如下
將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出二氧化碳的濃度大小測定結果。
2.一種二氧化碳診斷/測定試劑盒，主要成分包括
緩沖液 20——500mmol/L
穩定劑 1——50mmol/L
輔酶 1——6mmol/L
輔酶A1——12mmol/L
乙酸 1——50mmol/L
亞鐵細胞色素b1 1——20mmol/L
細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶 1000——80000U/L
輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶 1000——80000U/L
其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成單劑試劑。
4.根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5.根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、乙酸、亞鐵細胞色素b1組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩定劑1-4000mmol/L或0.1％-100％體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定二氧化碳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、細胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/84GK101169421SQ200610096879
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月24日 優先權日2006年10月24日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司