專利名稱：一次性碳基葡萄糖芯片的制備及電化學檢測方法
技術領域：
本發明涉及一次性碳基葡萄糖檢測芯片的制備，并結合電化學分析的優點及酶電極的高選擇性、高靈敏度，實現血液中葡萄糖濃度的快速檢測。
背景技術：
隨著人類生活水平的提高，各種代謝綜合癥的發病率逐年增加，其中高血脂、高血糖和糖尿病的發病率更是呈上升趨勢。例如，全世界糖尿病患者人數在1997年為1.43億，而2005年已達3.0億，數量翻了一番。我國糖尿病的發病狀況同樣較為嚴重，患者數量已超過三千萬，占總人口的2.5％。同時還有相當數量的葡萄糖耐量減低患者(糖尿病的前期)，這些患者中每年將有5％-15％轉變為糖尿病。如此龐大的糖尿病人群不僅給患者及其家庭帶來了痛苦，而且也給國家和社會帶來了沉重的負擔，因此預防和治療糖尿病具有十分積極的意義。
糖尿病是一種新陳代謝異常的疾病，就現階段而言它還是一種只能控制但卻難以治愈的“不治之癥”，已成為人類第五大死因。血糖是糖尿病患者經常檢測的指標，血糖定期檢測能夠讓正常人及時了解自身健康狀況，防病于未然，實現糖尿病的早期發現、早期診斷和治療并由現在的治療醫療向將來的預防醫療轉變。同時糖尿病患者需進行經常性的血糖家庭自檢，并依據檢測結果隨時對飲食和用藥進行控制和調整，以便使血糖水平保持正常或接近正常，防止由于血糖的升高引發的失明、腎、神經以及心腦血管并發癥。因此運用先進的科學技術發展有效的、高靈敏度、高選擇性的分析方法，實現糖尿病的早期診斷及糖尿病患者血糖家庭自檢，受到各國科學工作者的廣泛關注。
電化學分析技術具有許多優越性，如測試探頭可微型化，不受體系濁度和顏色影響，方法靈敏度高、速度快、花費低、危害小等。它還具有檢測儀器簡單、易于微型化的特點，線性范圍寬、靈敏度高，因而可直接將檢測信號轉換為直觀易讀的濃度值，便于非專業人士使用。目前，市場上有多種商品化血糖檢測便攜式儀器可用于糖尿病患者血糖的家庭自檢，各種儀器按檢測原理可分為兩類，一類是基于光學法，另一類是基于電化學方法。光學測試方法由于測量精度較低、容易污染等原因，已逐步被電化學方法所取代。用于血糖檢測的電化學方法包括葡萄糖傳感器(電化學法試條)和電化學檢測儀器，其核心部分是葡萄糖傳感器的制備。但由于其生產技術繁雜，因此開發擁有自主知識產權的血糖檢測芯片技術，降低檢測成本，對高血脂、高血糖和糖尿病的篩查與臨床早期診斷、療效觀察和指導治療具有重要意義。
發明內容
技術問題本發明目的是提供一種靈敏、價廉的一次性碳基血糖電化學檢測芯片的制備及電化學檢測方法，能實現血液中葡萄糖濃度的快速檢測，為高血脂、高血糖和糖尿病的篩查與臨床早期診斷與治療提供新途徑。
技術方案利用聚合物膜的生物兼容性和一次性碳電極的制備重復性好、價廉等優點，制備一種同時包含酶及電子傳遞媒介體的修飾電極。
本工作首先利用絲網印刷技術在PVC基質表面制備包含工作電極、輔助電極及參比電極的一次性電極芯片。結合聚合物膜技術，將葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶與二茂鐵酸混合物固定在工作電極表面，利用酶對葡萄糖的催化反應產生的電化學活性物質的安培響應，實現血液中葡萄糖濃度的快速檢測。
由于聚合物分子中含有大量的羥基，有利于構造生物兼容性好的聚合物膜仿生界面，在此界面上，固定的酶可穩定地保持其生物活性。同時由于聚合物膜的水溶性，使固定化酶與樣品中的葡萄糖充分接觸，并催化葡萄糖的氧化產生具有電活性的過氧化氫，根據過氧化氫的氧化電流可測定葡萄糖的含量。
具體制備的方法為1).選用PVC材料作為基質，在其上刻出軌道，用NaOH溶液和去離子水徹底地清洗，干燥后刷上銀漿作導電用，2).將用聚乙烯醇、超細石墨粉、纖維素二醋酸鹽制成的石墨墨水印刷在上述的銀漿軌道上，形成印刷碳電極，3).將碳電極用硅膠橡皮層覆蓋，只暴露導電的終端，其中心圓點為碳糊電極，左側為Ag/AgCl參比電極，右側是輔助電極，4).將PVA水溶液與葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶和二茂鐵酸的混合物共混，并點在上述印刷碳電極表面，紫外燈下烘干，制成印刷碳電極；
5).酶修飾印刷碳電極芯片的制備采用聚乙烯醇作為膜基底材料，通過與酶及電子傳遞媒介體共混，利用點樣技術及紫外光固化技術將酶固定在碳電極表面。
酶層修飾的方法為將平均分子量為4萬左右的聚乙烯醇(PVA)用水溶解，配成聚乙烯醇水溶液，室溫過液后煮沸得澄清透明溶液；將該溶液與葡萄糖氧化酶溶液、二茂鐵酸溶液等體積混和，噴灑該混和液于工作電極表面并使其完全覆蓋，紫外燈下烘后取出保存備用。
血液中血糖濃度的電化學檢測(1)測量電位選擇同一芯片，在其上滴一滴已知濃度的葡萄糖標準溶液，改變不同電位測量氧化電流的變化，尋找測定最佳電位，以獲得最優的檢測范圍和靈敏度。
(2)標準曲線繪制印刷碳電極上的電流響應信號與基底電極制備及酶修飾過程有關，不同批次得到的電極在同一葡萄糖濃度給出的電流信號并不相同。繪制不同情況下的標準曲線并進行必要的校正，可提高分析的正確性和準確性。
a)用同一芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液的氧化電流，繪制標準曲線，確定最優的線性范圍。
b)用同一批次印刷電極，同一批次或不同批次酶-聚合物修飾芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液，繪制標準曲線。
c)用不同批次印刷電極，同一批次或不同批次酶-聚合物修飾芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液，繪制標準曲線。
(3)標準曲線校正使用不同的芯片(同一批次與不同批次)對血液樣品中的血糖濃度進行檢測，從相應的標準曲線讀出血糖值，通過與臨床檢測數值及標準方法測定的數值比較，得出相關系數并對相應的標準曲線進行校正，提高檢測的正確性與準確性。
有益效果本發明利用電化學分析簡便、易行、價廉的特點，以碳、銀槳為導電材料，結合酶反應的高選擇性、高靈敏度，制備了一種靈敏、價廉的一次性碳基血糖電化學檢測芯片，實現了血液中葡萄糖濃度的快速檢測，為高血脂、高血糖和糖尿病的篩查與臨床早期診斷與治療提供新途徑。該方法較現有的血糖分析方法，具有以下優點
(1)利用PVA這種聚合物材料固定酶具有很好的應用前景，該材料價廉易得、低毒性、水溶性，且具有良好的化學穩定性和生物兼容性；(2)該方法表現出很好的精確性、重復性和穩定性，制備方法簡單，檢測成本較現有的測定方法，要低得多。
(3)電化學檢測芯片的生產成本低，利潤和市場空間巨大。如采用本發明生產的檢測芯片，生產成本不到0.1元/片，修飾后成本達0.25元/片，而市場銷售價格(國外品牌)卻在5元/條以上。
(4)電化學儀器操作簡便靈活、成本較低、分析速度快，適用于臨床快速檢測。
本發明通過聚合物膜修飾技術成功地將酶或酶與電子傳遞媒介體混合物固定在印刷碳電極表面，該材料價廉易得、低毒性、水溶性，且具有良好的化學穩定性和生物兼容性。結合酶反應對底物的特異性識別，通過酶對底物催化產生電活性物質進行安培檢測，實現了血糖的定量檢測。由于電化學檢測操作簡單、成本較低、分析速度快，可實現血糖的快速測定，為糖尿病等代謝綜合癥的診斷與治療提供了新途徑。
圖1是血糖芯片檢測原理示意圖。
具體實施例方式
1).選用PVC材料作為基質，在其上刻出軌道，用NaOH溶液和去離子水徹底地清洗，干燥后刷上銀漿作導電用，2).將用聚乙烯醇、超細石墨粉、纖維素二醋酸鹽制成的石墨墨水印刷在上述的銀漿軌道上，形成印刷碳電極，3).將碳電極用硅膠橡皮層覆蓋，只暴露導電的終端，其中心圓點為碳糊電極，左側為Ag/AgCl參比電極，右側是輔助電極，4).將PVA水溶液與葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶和二茂鐵酸的混合物共混，并點在上述印刷碳電極表面，紫外燈下烘干，制成印刷碳電極；5).酶修飾印刷碳電極芯片的制備采用聚乙烯醇作為膜基底材料，通過與酶及電子傳遞媒介體共混，利用點樣技術及紫外光固化技術將酶固定在碳電極表面。
以葡萄糖氧化酶和二茂鐵酸修飾印刷碳電極測定血液中血糖為例1.酶固定(1)印刷碳電極制備選用PVC材料作為基質，在其上刻出1mm×3cm的軌道，用NaOH溶液和去離子水徹底地清洗，干燥后刷上銀漿作導電用。將用聚乙烯醇，超細石墨粉，纖維素二醋酸鹽制成的石墨墨水印刷在上述的銀漿軌道上，將電極用硅膠橡皮層覆蓋，只暴露導電的終端(工作表面是9平方毫米)。
(2)酶層修飾將平均分子量為4萬左右的PVA用水溶解，配成2％的水溶液，室溫過液后煮沸1分鐘得澄清透明溶液。將該溶液與2mg/mL葡萄糖氧化酶溶液、0.4mM二茂鐵酸溶液等體積混和，噴灑2微升該混和液于工作電極表面并使其完全覆蓋，紫外燈下烘30分鐘后取出保存在4℃冰箱中備用。
2.最佳電位選擇及干擾研究對同一芯片，在其上滴一滴已知濃度的葡萄糖標準溶液(0.1M pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液)，改變不同電位測量氧化電流的變化，尋找測定最佳電位。以0.1M pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液為稀釋液，加入與葡萄糖體內共存的電活性干擾物質，在最佳電位條件下測定干擾物質的電流響應。實驗結果顯示，最佳測量電位為0.4伏，尿酸1mM、抗壞血酸1mM無明顯干擾。
3.標準曲線繪制取同一批次制得的10根酶修飾電極，測定同一葡萄糖標準溶液在0.4V的電流，驗證電極的重復性。另取同一批次制得的10根酶修飾電極，測定不同葡萄糖濃度在0.4V的電流響應，繪制標準曲線。其檢測原理如圖2所示。實驗結果表明，同一批次制得的酶電極間具有很好的重復性，對同一葡萄糖濃度的測量誤差小于5％，且在葡萄糖濃度1.8mg/dL～32.6mg/dL范圍內呈線性關系。
4.血糖檢測在優化的實驗條件下，測定全血樣品的電化學響應，根據電流值從標準曲線上讀出葡萄糖濃度，并與標準方法測定值比較校正。利用本發明測量的100個樣品的血糖值與標準方法對比，測定的結果具有良好的一致性。
1)測量電位選擇同一芯片，在其上滴一滴已知濃度的葡萄糖標準溶液，改變不同電位測量氧化電流的變化，尋找測定最佳電位，以獲得最優的檢測范圍和靈敏度，2)標準曲線繪制印刷碳電極上的電流響應信號與基底電極制備及酶修飾過程有關，繪制不同情況下的標準曲線并進行必要的校正a)用同一芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液的氧化電流，繪制標準曲線，確定最優的線性范圍，b)用同一批次印刷電極，同一批次或不同批次酶-聚合物修飾芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液，繪制標準曲線，c)用不同批次印刷電極，同一批次或不同批次酶-聚合物修飾芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液，繪制標準曲線，3)標準曲線校正使用同一批次與不同批次的不同的芯片，對血液樣品中的血糖濃度進行檢測，從相應的標準曲線讀出血糖值，通過與臨床檢測數值及標準方法測定的數值比較，得出相關系數并對相應的標準曲線進行校正，提高檢測的正確性與準確性。
權利要求
1.一種一次性碳基血糖電化學檢測芯片的制備方法，其特征在于制備的方法為1).選用PVC材料作為基質，在其上刻出軌道，用NaOH溶液和去離子水徹底地清洗，干燥后刷上銀漿作導電用，2).將用聚乙烯醇、超細石墨粉、纖維素二醋酸鹽制成的石墨墨水印刷在上述的銀漿軌道上，形成印刷碳電極，3).將碳電極用硅膠橡皮層覆蓋，只暴露導電的終端，其中心圓點為碳糊電極，左側為Ag/AgCl參比電極，右側是輔助電極，4).將PVA水溶液與葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶和二茂鐵酸的混合物共混，并點在上述印刷碳電極表面，紫外燈下烘干，制成印刷碳電極；5).酶修飾印刷碳電極芯片的制備采用聚乙烯醇作為膜基底材料，通過與酶及電子傳遞媒介體共混，利用點樣技術及紫外光固化技術將酶固定在碳電極表面。
2.根據權利要求1所述的一次性碳基血糖電化學檢測芯片的制備方法，其特征在于酶層修飾的方法為將平均分子量為4萬左右的聚乙烯醇用水溶解，配成聚乙烯醇水溶液，室溫過液后煮沸得澄清透明溶液；將該溶液與葡萄糖氧化酶溶液、二茂鐵酸溶液等體積混和，噴灑該混和液于工作電極表面并使其完全覆蓋，紫外燈下烘后取出保存備用。
3.一種如權利要求1所述的一次性碳基血糖電化學檢測芯片的電化學檢測方法，其特征在于1)測量電位選擇同一芯片，在其上滴一滴已知濃度的葡萄糖標準溶液，改變不同電位測量氧化電流的變化，尋找測定最佳電位，以獲得最優的檢測范圍和靈敏度，2)標準曲線繪制印刷碳電極上的電流響應信號與基底電極制備及酶修飾過程有關，繪制不同情況下的標準曲線并進行必要的校正a)用同一芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液的氧化電流，繪制標準曲線，確定最優的線性范圍，b)用同一批次印刷電極，同一批次或不同批次酶-聚合物修飾芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液，繪制標準曲線，c)用不同批次印刷電極，同一批次或不同批次酶-聚合物修飾芯片測定不同濃度葡萄糖標準溶液，繪制標準曲線，3)標準曲線校正使用同一批次與不同批次的不同的芯片，對血液樣品中的血糖濃度進行檢測，從相應的標準曲線讀出血糖值，通過與臨床檢測數值及標準方法測定的數值比較，得出相關系數并對相應的標準曲線進行校正，提高檢測的正確性與準確性。
全文摘要
一次性碳基血糖電化學檢測芯片的制備及電化學檢測方法涉及一次性碳基血糖檢測芯片的制備，并結合電化學分析的優點及酶電極的高選擇性、高靈敏度，實現血液中葡萄糖濃度的快速檢測。芯片的制備方法為1)選用PVC材料作為基質，在其上刻出軌道，刷上銀漿作導電用；2)將用聚乙烯醇、超細石墨粉、纖維素二醋酸鹽制成的石墨墨水印刷在上述的銀漿軌道上，形成印刷碳電極；3)將碳電極用硅膠橡皮層覆蓋；4)將PVA水溶液與葡萄糖氧化酶或葡萄糖氧化酶和二茂鐵酸的混合物共混，并點在上述印刷碳電極表面，制成印刷碳電極；5)采用聚乙烯醇(PVA)作為膜基底材料，通過與酶及電子傳遞媒介體共混，利用點樣技術及紫外光固化技術將酶固定在碳電極表面。
文檔編號G01N27/30GK1912626SQ20061008840
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月22日 優先權日2006年8月22日
發明者劉松琴 申請人:東南大學