專利名稱：同時測定魚肉中復方磺胺甲噁唑及代謝物的液相色譜法的制作方法
技術領域：
本發明涉及磺胺類抗菌藥的測定方法；具體的說是采用高效液相色譜法同時測定魚肉中磺胺甲噁唑(SMZ)、乙酰化代謝產物(乙酰化磺胺甲噁唑，NSMZ)和甲氧芐啶(TMP)的方法。
背景技術：
磺胺甲噁唑(又稱新諾明)是水產養殖病害防治上廣泛使用的藥物，通常與磺胺增效劑甲氧芐啶配伍使用；磺胺甲噁唑在魚體內的代謝除了原形藥物磺胺甲噁唑以外，乙酰化磺胺甲噁唑是其主要代謝產物，在體內殘留時間較長。因此，研究磺胺類藥物在水產品中殘留時，檢測其乙酰化代謝產物和增效劑的含量是非常必要的。目前，有關磺胺甲噁唑等磺胺類藥物的檢測多使用高效液相色譜法，相關報道如下(1)、制藥行業的相關報道袁枚等(2005、廣州惠華動物保健品有限公司)報道用反相高效液相色譜法同時測定復方新諾明水溶性粉中的磺胺甲噁唑和甲氧芐啶；池玉梅等(2001、南京中醫藥大學)報道高效液相色譜法同時測定復方新諾明注射液中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的含量。以上方法樣品前處理較簡單，不涉及從組織中提取藥物的樣品前處理過程，方法不適合藥物在水產品中的含量檢測。
(2)、醫學和獸醫領域的相關報道崔艷莉等(2003、廣西獸藥監察所)報道高效液相色譜法同時測定豬血漿中的磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑和甲氧芐啶；丁晨光等(1997、解放軍大連醫學高等專科學校)報道高效液相色譜法測定人血漿中的磺胺甲噁唑和甲氧芐啶。水產動物不同于哺乳動物，在蛋白組分和脂肪含量上存在較大差異，樣品基質不同會影響分析方法的回收率和干擾檢測。
(3)、水產領域的相關報道徐維海等(2004、中國科學院海洋研究所)報道了水產品中包括磺胺甲噁唑在內的14種磺胺類藥物殘留的高效液相色譜法；郭根和等(2005、福建省農業科學院)報道高效液相色譜法測定對蝦中五種磺胺類藥物殘留；林海丹等(2003、廣州出入境檢驗檢疫局)報道動物源性食品中磺胺類藥物殘留的固相萃取高效液相色譜測定法；鄭宗林等(2005、上海水產大學)報道中華絨螯蟹血淋巴內磺胺甲噁唑的測定；劉長征等(2004、中國水產科學研究院長江水產研究所)報道水產品中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶含量的高效液相色譜法測定。這些相關的報道大多僅涉及磺胺類藥物本身的檢測，沒有涉及增效劑甲氧芐啶和乙酰化代謝產物三者的同時檢測，所采用的樣品前處理方法也與本發明不同。
發明內容
本發明提供了一種同時測定魚肉中磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的高效液相色譜方法，具有靈敏、準確、可靠的特點。
實現本發明的技術方案如下它的技術方法包括樣品制備、樣品前處理、標準溶液的配制、流動相配制及色譜條件A、樣品制備采集魚的肌肉組織樣品，用剪刀初步剪碎，用高速均質器均質，冷凍保存。
B、樣品前處理樣品解凍后，準確稱取魚肉組織，加入0.3mol/L鹽酸，靜置1小時，加入無水硫酸鈉，后加入二氯甲烷/丙酮混合液(3∶1比例)，4℃冰箱靜置8-12小時后，用高速均質器均質，再用二氯甲烷-丙酮混合液清洗均質器的刀頭(均質)，合并2次的提取液，充分振蕩，離心(4000-6000r/min離心5-10min)，取出全部上清液，剩余殘渣再加入二氯甲烷/丙酮提取，充分振蕩，離心(4000-6000r/min離心5-10min)，取上清液與第一次提取液合并，提取液在33-35℃下用氮氣吹干，殘渣用流動相溶解，加入正己烷充分震蕩，靜置一段時間，棄去正己烷，下層液用微孔濾膜(0.22μm或0.45μm)過濾后進高效液相色譜儀測定。
C、標準溶液的配制分別準確稱取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙酰化磺胺甲噁唑和200mg甲氧芐啶標準品一起溶于100mL流動相中，配成同時含有三種藥物的母液(200μg/mL)，于冰箱中4℃保存，臨用前再依次稀釋成系列梯度的標準溶液。
D、流動相配制及色譜條件取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5(v/v/v)的比例配制流動相，超聲波脫氣30min后備用。
所用色譜條件a、色譜柱選用規格為4.6mm×250mm C18ODS柱；b、柱溫25-30℃；c、流速0.8-1.0mL/min；進樣量10-20μL；d、紫外檢測波長272nm；e、流動相為水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
本發明具有以下優點1、本發明方法能夠同時檢測魚肉中的磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧芐啶，可節省大量的人力、物力和時間，降低了檢測成本。
2、加入鹽酸有助于藥物從魚肌肉組織蛋白上解離，提高回收率；二氯甲烷-丙酮作為提取液，對三種藥物均有較好的提取效果，同時浸出雜質少且易排除基質干擾；濃縮溫度低于35℃，滿足磺胺類藥物耐熱性差的特點；加入二氯甲烷/丙酮后冰箱放置8-12小時不僅能夠充分提取肌肉組織中的藥物，而且使蛋白質變性充分，減少提取過程的損失，提取效果理想。
3、本方法中，磺胺甲噁唑、甲氧芐啶及乙酰化磺胺甲噁唑藥物峰與雜峰能較好分離，最低檢測限可達0.005、0.01、0.005mg/kg，準確度和精密度高。
圖1魚肉空白樣品的液相色譜2加入磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧芐啶標樣的魚肉空白樣品的液相色譜圖1-甲氧芐啶；2-磺胺甲噁唑；3-乙酰化磺胺甲噁唑具體實施方式
下面通過實施例結合附圖詳細敘述本發明的技術內容它的技術方法包括樣品制備、樣品前處理、標準溶液的配制、流動相配制及色譜條件
A、樣品制備采集魚的肌肉組織樣品，用剪刀初步剪碎，用高速均質器均質，放入塑料離心管中，密封冷凍保存。
B、樣品前處理取15支15ml塑料離心管，分別加入解凍后的空白肌肉組織1g，放入塑料離心管中，加入不同濃度的標準液(0.5、2.0、10.0、50.0、200.0μg/mL)各0.1mL，每個濃度設3個平行，使三種藥物在1g肌肉組織中的濃度分別達到0.05、0.20、1.00、5.00、20.00μg/g，充分混合，靜置4小時，加入0.3mol/L鹽酸0.2mL，靜置1小時，加入0.5g無水硫酸鈉，加入3mL二氯甲烷/丙酮(3∶1比例)混合液，密封離心管，4℃冰箱靜置8小時后，用高速均質器均質10s(16000r/min)，再用3mL二氯甲烷/丙酮提取液清洗均質器刀頭，合并2次的提取液，振蕩1min，靜置5min后，5000r/min離心10min，取出全部上清液，放入15mL玻璃離心管中，剩余殘渣加入4mL二氯甲烷/丙酮再次提取，振蕩1min，靜置5min后，5000r/min離心10min，取上清液與第一次提取液合并，在35℃下氮氣吹干，殘渣用1mL流動相溶解，加入1mL的正己烷，漩渦混合1min，靜置10min，棄去正己烷，下層液用0.22μm微孔濾膜過濾后進高效液相色譜儀測定。
C、標準溶液的配制分別準確稱取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙酰化磺胺甲噁唑和200mg甲氧芐啶標準品一起溶于100mL流動相中，配成同時含有三種藥物的母液(200μg/mL)，于冰箱中4℃保存，臨用前依次稀釋成50.00、20.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01μg/mL的標準溶液。
D、流動相配制及色譜條件取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5(v/v/v)的比例配制流動相，超聲波脫氣30min。
色譜條件4.6mm×250mm C18ODS柱；柱溫25℃；流速1.0mL/min；進樣量20μL；紫外檢測波長272nm；流動相為水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
本發明方法對魚的肌肉組織在0.05、0.20、1.00、5.00、20.00μg/mL5個濃度梯度的回收率試驗。結果表明，經過本試驗的前處理步驟，空白樣品和添加藥物樣品的色譜圖均未出現明顯的雜質峰(圖1-2)，樣品分離良好，肌肉中SMZ、TMP、NSMZ 5個濃度水平的添加回收率范圍在82.12-90.87％、79.64-88.67％、78.21-86.08％(表1)。以上5個濃度的樣品于1d內分別重復進樣5次和分5d測定，以此衡量定量方法的精密度(表2)，試驗中三種藥物在5個不同濃度水平下平行樣品的相對標準偏差范圍在1.44-3.13％、2.01-4.23％、1.09-4.56％，符合磺胺甲噁唑、甲氧芐啶及乙酰化磺胺甲噁唑殘留分析的要求。
表1SMZ、TMP及NSMZ在魚肌肉組織中的回收率
表2SMZ、TMP及NSMZ在魚肌肉組織中的日內及日間精密度
本方法在0.01-20mg/kg濃度范圍內，SMZ、TMP、NSMZ在魚肌肉組織中線性關系良好，相關系數均可達0.9999；該方法以引起2-3倍信噪比(S/N)定義為最低檢測限，SMZ、TMP、NSMZ的最低檢測限分別為0.005、0.01、0.005mg/kg，完全符合磺胺甲噁唑、甲氧芐啶及乙酰化磺胺甲噁唑殘留分析的要求。
權利要求
1.一種同時測定魚肉中復方磺胺甲噁唑及代謝物的液相色譜法，其特征在于它的技術方法，包括樣品制備、樣品前處理、標準溶液的配制、流動相配制及測定所用色譜條件；A、樣品制備采集魚的肌肉組織樣品，用剪刀初步剪碎，用高速均質器均質，冷凍保存；B、樣品前處理稱取解凍魚肉組織，加入鹽酸，靜置，加入無水硫酸鈉后，加入二氯甲烷/丙酮混合液，4℃條件下靜置一段時間后，用高速均質器均質，用二氯甲烷/丙酮混合液清洗均質器的刀頭，提取液經充分振蕩后離心，殘渣用二氯甲烷/丙酮提取液再次提取，合并2次提取液并用氮氣吹干，殘渣用流動相溶解，加入正己烷去脂肪，下層液用微孔濾膜過濾后進高效液相色譜儀測定；所述的樣品前處理，加入鹽酸的濃度為0.3mol/L；加入鹽酸的比例為0.2mL/g肌肉；加入鹽酸后的靜置時間為1小時；加入的提取液為3∶1比例混合的二氯甲烷/丙酮混合液；4℃冰箱靜置的時間為8-12小時后；C、標準溶液的配制分別準確稱取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙酰化磺胺甲噁唑和200mg甲氧芐啶標準品一起溶于100mL流動相中，配成同時含有濃度為200μg/mL三種藥物的母液，于冰箱中4℃保存，臨用前再依次稀釋成系列梯度的標準溶液；D、流動相配制取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5的比例配制流動相，超聲波脫氣30min后備用；E、測定所用色譜條件色譜柱選用規格為4.6mm×250mm C18ODS柱；柱溫25-30℃；流速0.8-1.0mL/min；進樣量10-20μL；紫外檢測波長272nm；流動相為水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
全文摘要
一種同時測定魚肉中復方磺胺甲噁唑及代謝物的液相色譜法。以鹽酸、3∶1比例的二氯甲烷/丙酮混合液作為提取劑，可將殘留在魚肉組織中的磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧芐啶充分提取出，提取的雜質少，可省略凈化的過程；加入提取液后，在4℃冰箱靜置一段時間，能夠使蛋白質變性充分，從而減少提取時因蛋白黏附在高速均質器上所造成的損失，提高了回收率；將提取的有機溶劑用氮氣吹干、過濾后即可進高效液相色譜儀測定。本發明方法操作簡便、快速、檢測成本低、靈敏度高，可用在科研單位和進出口商品檢測部門進行魚肉中復方磺胺甲噁唑及代謝物含量的測定。
文檔編號G01N30/06GK1908654SQ20061006852
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月18日 優先權日2006年8月18日
發明者王群, 李健, 劉淇, 何玉英 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所