稀土元素金屬螯合標記定量蛋白質組的方法與試劑盒的制作方法

專利名稱：稀土元素金屬螯合標記定量蛋白質組的方法與試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質組學中蛋白質定量的方法與試劑盒。具體的說，涉及一種用于定量蛋白質組學的稀土元素金屬螯合標記蛋白質的新方法與試劑盒。
背景技術：
定量蛋白質組學是通過某種方法或技術，對某些過程中生物樣品(細胞、組織或體液等)中蛋白質的含量進行比較分析，是從蛋白質組水平上對基因表達進行準確的定量分析，是當前研究重大疾病致病機制以及藥理控制機制的必要手段及研究前沿。
當前，蛋白質組研究中廣泛應用的相對定量方法主要有依賴雙向凝膠電泳(Twodimensional electrophoresis，2-DE)的染色方法和穩定同位素標記的質譜檢測技術。2-DE相對定量方法可以通過染色強度直觀地反映蛋白質表達的差異，但是染料的存在，容易給后續的質譜檢測帶來干擾。另外，2-DE分離的效果不是很好，許多蛋白質點包含了一個以上的蛋白；并且不能對分子量極高或極低、等電點極酸或極堿和含量低的蛋白質以及膜蛋白質等進行有效分離和呈現，因此已不能適應目前蛋白質組研究深入發展的需要。
第二種定量策略是引進穩定同位素化學標記結合質譜技術的定量策略。近年來，定量蛋白質組學主要以質譜檢測為核心的穩定同位素化學標記方法。但是受到同位素試劑合成困難，價格高等因素的制約。
Meares C.F.等人避開以穩定同位素為質量標簽，而以化學性質很相近的稀土金屬元素作為質量標簽，提出了“元素標記親和標簽”(ECAT，Element-coded affinity tags，WhetstoneP.A.，Butlin N.G.，Corneillie T.M.，and Meares C.F.，Bioconjugate Chem.，2004；153-6)的新方法，并且合成了一個標準肽段驗證了分別標記有稀土元素釔和鋱的肽段混合物的色譜共洗脫和質譜中的響應。但是他們并沒有能夠將該方法用來解決蛋白質組學中的定量問題。

發明內容
本發明提供了一種以化學性質很相近的稀土金屬為質量標簽的蛋白質組學相對定量方法。本發明人發現結合多維液相色譜分離手段和多級串聯質譜，使用價格遠遠低于穩定同位素的稀土元素作為定量蛋白質組學中的質量內標準是可行的，可以用來解決蛋白質組學的相對定量問題。
具體的說，本發明提供了一種用于定量稀土元素金屬螯合標記蛋白質的方法，該方法包括(1)用還原劑打開蛋白質分子中的二硫鍵，破壞其高級結構；用烷基化試劑封閉巰基，防止其重新形成二硫鍵；(2)用化學消化或酶消化法對蛋白質進行消化，產生適于質譜分析的肽段；用試劑對酶切肽段的側鏈氨基進行保護；(3)對肽段進行化學修飾和處理并進行質譜定量；其特征在于所述步驟(3)的處理方法為(a)用一種或多種雙功能螯合劑對肽段進行修飾，使其帶上螯合基團；(b)分別用兩種不同的或多種單同位素稀土元素金屬鹽離子，與標記在肽段上的螯合劑發生螯合作用；(c)將兩種分別標記有不同稀土金屬離子的待比較樣本的肽段混合物合并，用一維或多維色譜分離手段將合并肽段進行分離；(d)用質譜定量與鑒定肽段，進行質譜數據的解析及蛋白質的鑒定。
其中，步驟(a)所述雙功能螯合劑優選為分子內帶氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或異硫氰酸基多羧酸活性聯接基團的化合物，特別優選為二乙三胺五乙酸雙酸酐。
步驟(b)所述稀土元素優選為三氯化釔和三氯化鋱。
步驟(d)所述質譜優選LC-Q-TOF-MS/MS電噴霧離子化串聯質譜，或MALDI TOF/TOF基質輔助激光解離飛行時間串聯質譜，更優選使用液質聯用；質譜數據的解析及蛋白質的鑒定優選采用數據庫搜索方法。
該方法可對兩種不同生理狀態的蛋白質酶切產生的肽段進行雙功能螯合基團的修飾；再用兩種不同單同位素的稀土元素金屬離子進行螯合標記，然后將標記有不同稀土金屬離子的不同生理狀態的肽段混合物合并在一起，通過多維色譜分離和串聯質譜分析測定。標記有不同稀土金屬離子的同一肽段在液相分離中能夠被共洗脫，并且一級質譜的離子峰對的質譜響應與預期的一致。在一級質譜圖中質量數相差值為稀土元素金屬的質量數差值的一對肽段的離子強度比例，也就是相應的兩種比較蛋白質的相對比例，單電荷的離子峰對的質量數差異為單同位素稀土元素金屬的質量數差，雙電荷的離子對的質量數差異為單同位素稀土元素金屬的質量數差的二分之一，依此類推。通過二級質譜生成的peak list文件進行數據庫檢索來鑒定蛋白質。在一級質譜響應信號中，發明人發現標記有金屬鋱的肽段對標記有金屬釔的肽段有離子抑制現象。當設定的兩種蛋白樣本的混合比例為1∶1時，從一級質譜圖中標記釔金屬離子與標記有鋱金屬離子肽段的離子強度的平均比例為0.65∶1，重復性好。并且在設定比例1.0到10之間是呈線性變化的，線性關系良好，相關系數為0.99以上。
雙功能螯合劑為分子內或帶氨基多羧酸，或帶芳香胺多羧酸，或帶異硫氰酸基多羧酸活性聯接基團的化合物。如二乙三胺五乙酸雙酸酐(bicyclic anhydride diethylenetriamine-N，N，N’，N”，N”-pentaacetic dianhydride，DTPAA)為雙功能螯合試劑，它一端能夠與肽段的胺基偶合，一端能夠與稀土金屬離子螯合。雙功能螯合劑被廣泛應用于放射免疫分析和靶向放療中，價格相對低廉。另外，稀土金屬量大價廉，化學性質極為相似，所以以稀土金屬元素為質量標簽結合質譜檢測方法在蛋白質組學定量中的應用潛力巨大。
另一方面，本發明還提供了用于定量蛋白質組學中稀土元素金屬螯合標記蛋白質的試劑盒，該試劑盒的組分包含(a)一種或多種對肽段進行修飾，使其帶上螯合基團的雙功能螯合劑；(b)兩種或多種單稀土元素三氯化物；(c)能進行肽段色譜分離的色譜柱。
其中，組分(a)優選分子內或帶氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或帶異硫氰酸基多羧酸活性聯接基團的化合物；組分(c)優選反相柱或離子交換柱，更優選在線聯用色譜柱。
為方便使用，該試劑盒還可包含以下組分中的一種或多種用于打開蛋白質分子中二硫鍵的還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)和三羧乙基膦(TCEP)；封閉巰基防止其重新形成二硫鍵的烷基化試劑，如碘乙酰胺和碘乙酸；蛋白質消化劑，如胰蛋白酶；側鏈氨基保護試劑，如O-甲基異脲；此外還可含有一種或多種用于肽段色譜分離的緩沖體系；國家行政機關批準的使用說明等。
本發明的新方法和試劑盒適用于對兩種或多種不同狀態的組織或細胞的蛋白質差異表達進行相對的定量，該方法快速，使用方便。可同時比較不同生理病理條件下兩種或多種樣本的蛋白質表達水平上的差異，從而簡便快速準確地篩選到表征該生理病理條件的生物標志物，是疾病診斷及藥物篩選簡單快速的分析工具。蛋白質定量與定性分析可在一個實驗周期中同步完成。特別適用于生物學、醫學和藥物學領域中進行差異蛋白質組或比較蛋白質組分析。
本方法是蛋白質差異表達相對定量分析工具，大大降低蛋白質組學中相對定量的成本。并且反應條件相對溫和，操作簡單，容易實現。蛋白質定量與定性分析可在一個實驗周期中同步完成。本發明的方法和試劑盒具有廣泛的實用性。用途包括但不限于在醫學、藥學、農業和畜牧業等領域進行各種動植物和微生物的蛋白質組研究。


圖1.A圖為胰島素GFFYTPK分別標記了Y和Tb標簽的帶兩個正電荷的共洗脫肽段的一級質譜圖，共洗脫時間為29.87分鐘，可以看到m/z為660.58和695.55的一組峰，它們的質量數相差35Da。B圖為理論比例設定為0.5∶1.0時，一級質譜圖中離子強度Y/Tb為0.38∶1.0。
圖2.胰島素胰酶酶切肽段FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER標記了Tb標簽的帶三個正電荷肽段的二級質譜圖。
具體實施例方式
下面的實施例將對本發明作進一步的解釋，但是本發明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。本領域的技術人員在權利要求的范圍內所做出的某些改變和調整也應認為屬于本發明的范圍。
實施例1 標準蛋白胰島素的相對定量1.1取0.1mg胰島素，溶于100μL 50mM pH 7.0的碳酸氫三乙胺緩沖溶液中。加入0.2μL100mM還原劑三羧乙基磷(TCEP)，37℃反應4小時后冷卻至室溫，加入0.5μL 100mM碘乙酰胺(IAA)，室溫避光反應1小時后加入10mM DTT終止反應。加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切2小時。再補加2ug胰蛋白酶，37℃酶切10小時。將酶切得到的胰島素肽段混合物加入到360μg二乙三胺五乙酸雙酸酐的固體粉末中，劇烈渦震1min后，常溫放置1小時。然后將該反應溶液放入真空干燥機中完全干燥后，加入0.1M醋酸胺溶液中重新溶解，按照體積平均分為兩份，其中一份加入40μL濃度為0.15M的YCl3，另一份中加入同樣濃度和體積的TbCl3水溶液。37℃溫孵2小時。然后將兩種反應溶液按照不同的比例(1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，2∶1，5∶1，10∶1)混合。
1.2各取0.6μL不同比例混合后的樣品直接在液質聯用(LC-Q-TOF Micro Waters，美國)儀器上進行測定分析。LC-Q-TOF Micro的分析條件為液相采用Waters CapLC液相色譜系統，用2％乙腈，0.1％甲酸溶液上樣，流速為20μL/min，樣品在320μm i.d.×1mm的PepMap C18預柱上脫鹽4分鐘。分析柱采用C18毛細管柱(75μm i.d.×15cm，LC Packings)。色譜分離的梯度洗脫為溶液A(水/乙腈為95/5，v/v，含0.1％甲酸)；溶液B(水/乙腈為15/85，v/v，含0.1％甲酸)，分流后流速約為200nl/min。梯度4％B——50％B，45min；50％B——100％B，10min；100％B保持10min，再用6min回到4％B，平衡15min。液相洗脫液直接進入Q-TOF Micro(Waters)質譜儀的納升噴霧源(nanoflow source)，質譜在正離子模式下工作，源溫80℃，cone gas氮氣流速50L/h，毛細管納升噴頭電壓為3.2kV，鞘氣壓力5psi，檢測器MCP電壓2850V。采用數據依賴的信號采集方式(survey scan)，信號閾值設為7counts，一次選擇3或5個豐度最高的離子自動進行串聯質譜數據采集，一級MS掃描范圍m/z(400-1500)，1秒/scan，二級MSMS掃描范圍m/z(80-1500)或m/z(80-2000)，1秒/scan，二級碰撞電壓根據母離子的帶電荷情況和荷質比大小自動調整，MS和MS/MS數據在連續模式下獲得。所有的數據用MassLynx 4.0軟件處理。所有的MSMS數據生成數據文件peak list用于數據庫檢索鑒定。搜索參數包括可變修飾在肽段的N端或賴氨酸標記了DTPA-Y標簽的質量數加上464Da，在肽段的N端標記了DTPA-Tb標簽的質量數加上534Da。
1.3在一級質譜圖上可以看到m/z為660.58和695.55的一組峰，它們的質量數相差35Da，為胰島素GFFYTPK分別標記了Y和Tb標簽的帶兩個正電荷的共洗脫肽段。見說明書附圖1。在這些肽段中標記有Y和Tb的比例為設定值的0.65倍。胰島素的另外一個胰酶酶切肽段FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER標記Tb標簽的帶三個正電荷肽段的耳機質譜圖如說明書附圖2所示。
實施例2 標準蛋白馬心肌紅蛋白的相對定量2.1取0.1mg馬心肌紅蛋白，溶于100μL 50mM pH 7.0的碳酸氫三乙胺緩沖溶液中。肌紅蛋白的氨基酸序列中沒有半胱氨酸殘基，故不需要還原烷基化步驟。加入2ug胰蛋白酶，37℃酶切2小時。再補加2ug胰蛋白酶，37℃酶切10小時。將酶切得到的肌紅蛋白肽段混合物加入到360μg二乙三胺五乙酸雙酸酐的固體粉末中，劇烈渦震1min后，常溫放置1小時。然后將該反應溶液放入真空干燥機中完全干燥后，加入0.1M醋酸胺溶液中重新溶解，平均分為兩份，其中一份加入40μL濃度為0.15M的YCl3，在另外一份中加入同樣濃度和體積的TbCl3水溶液。37℃溫孵2小時。然后將兩種反應溶液按照不同的比例(1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，2∶1，5∶1，10∶1的比例混合。
2.2各取0.6μL不同比例混合后的樣品直接在液質聯用的LC-Q-TOF Micro(Waters，美國)儀器上進行測定分析。LC-Q-TOF Micro的分析條件為液相采用Waters CapLC液相色譜系統，用2％乙腈，0.1％甲酸溶液上樣，流速為20μL/min，樣品在320μm i.d.×1mm的PepMap C18預柱上脫鹽4分鐘。分析柱采用C18毛細管柱(75μm i.d.×15cm，LCPackings)。色譜分離的梯度洗脫為溶液A(水/乙腈為95/5，v/v，含0.1％甲酸)；溶液B(水/乙腈為15/85，v/v，含0.1％甲酸)，分流后流速約為200nl/min。梯度4％B——50％B，45min；50％B——100％B，10min；100％B保持10min，再用6min回到4％B，平衡15min。液相洗脫液直接進入Q-TOF Micro(Waters)質譜儀的納升噴霧源(nanoflow source)，質譜在正離子模式下工作，源溫80℃，cone gas氮氣流速50L/h，毛細管納升噴頭電壓為3.2kV，鞘氣壓力5psi，檢測器MCP電壓2850V。采用數據依賴的信號采集方式(survey scan)，信號閾值設為7counts，一次選擇3或5個豐度最高的離子自動進行串聯質譜數據采集，一級MS掃描范圍m/z(400-1500)，1秒/scan，二級MSMS掃描范圍m/z(80-1500)或m/z(80-2000)，1秒/scan，二級碰撞電壓根據母離子的帶電荷情況和荷質比大小自動調整，MS和MS/MS數據在連續模式下獲得。所有的數據用MassLynx 4.0軟件處理。所有的MSMS數據生成數據文件peak list用于數據庫檢索鑒定。搜索參數包括可變修飾在肽段的N端或賴氨酸標記了DTPA-Y標簽的質量數加上464Da，在肽段的N端標記了DTPA-Tb標簽的質量數加上534Da。
2.3在一級質譜圖上可以看到m/z為1034.20和1069.25的一組峰，它們的質量數相差35Da，為肌紅蛋白肽段VEADIAGHGQEVLIR分別標記了Y和Tb標簽的帶兩個正電荷的共洗脫肽段。除此之外的還可以看到m/z為857.71和892.73的一組峰，為肌紅蛋白肽段TEAEMK分別標記了Y和Tb標簽的帶兩個正電荷的共洗脫肽段，等等。在這些肽段中標記有Y和Tb的比例為設定值的0.65倍。
實施例3 六種標準蛋白混合物的相對定量3.1配置每種蛋白的濃度為0.1mmoL/L的六種蛋白溶液(牛血清白蛋白、轉鐵蛋白、α-乳球白蛋白、β-乳球白蛋白、肌紅蛋白和溶菌酵素蛋白)，緩沖溶液為50mM pH 7.0的碳酸氫三乙胺。各取70μL混合在一起。加入0.8μL 500mM還原劑三羧乙基磷(TCEP)，37℃反應4小時后冷卻至室溫，加入1μL 1M碘乙酰胺(IAA)，室溫避光反應1小時后。加入5ug胰蛋白酶，37℃酶切2小時。再補加5ug胰蛋白酶，37℃酶切10小時。將酶切得到的肌紅蛋白肽段混合物加入到360μg二乙三胺五乙酸雙酸酐的固體粉末中，劇烈渦震1min后，常溫放置1小時。然后將該反應溶液放入真空干燥機中完全干燥后，加入等量的0.1M醋酸胺溶液中重新溶解，平均分為兩份，其中一份加入168μL濃度為0.15M的YCl3，在另外一份中加入同樣濃度和體積的TbCl3水溶液。37℃溫孵2小時。然后將兩種反應溶液按照不同的比例1∶1的比例混合。
3.2各取0.6μL不同比例混合后的樣品直接在液質聯用的LC-Q-TOF Micro(Waters，美國)儀器上進行測定分析。LC-Q-TOF Micro的分析條件為液相采用Waters CapLC液相色譜系統，用2％乙腈，0.1％甲酸溶液上樣，流速為20μL/min，樣品在320μm i.d.×1mm的PepMap C18預柱上脫鹽4分鐘。分析柱采用C18毛細管柱(75μm i.d.×15cm，LC Packings)。色譜分離的梯度洗脫為溶液A(水/乙腈為95/5，v/v，含0.1％甲酸)；溶液B(水/乙腈為15/85，v/v，含0.1％甲酸)，分流后流速約為200nl/min。梯度4％B——50％B，45min；50％B——100％B，10min；100％B保持10min，再用6min回到4％B，平衡15min。液相洗脫液直接進入Q-TOF Micro(Waters)-質譜儀的納升噴霧源-(nanoflow source)，質譜在正離子模式下工作，源溫80℃，cone gas氮氣流速50L/h，毛細管納升噴頭電壓為3.2kV，鞘氣壓力5psi，檢測器MCP電壓2850V。采用數據依賴的信號采集方式(survey scan)，信號閾值設為7counts，一次選擇3或5個豐度最高的離子自動進行串聯質譜數據采集，一級MS掃描范圍m/z(400-1500)，1秒/scan，二級MSMS掃描范圍m/z(80-1500)或m/z(80-2000)，1秒/scan，二級碰撞電壓根據母離子的帶電荷情況和荷質比大小自動調整，MS和MS/MS數據在連續模式下獲得。所有的數據用MassLynx 4.0軟件處理。所有的MSMS數據生成數據文件peak list用于數據庫檢索鑒定。搜索參數包括可變修飾在肽段的N端或賴氨酸標記了DTPA-Y標簽的質量數加上464Da，在肽段的N端標記了DTPA-Tb標簽的質量數加上534Da。
3.3在質譜測定的結果中，所有的MSMS數據生成數據文件peak list通過數據庫檢索鑒定出了這六個標準蛋白，在它們的一級質譜中帶電荷數不同的標記有Y和Tb標簽的一組組肽段的平均離子強度比為0.65。是設定比例1的0.65倍。
權利要求
1.一種用于定量稀土元素金屬螯合標記蛋白質的方法，該方法包括(1)用還原劑打開蛋白質分子中的二硫鍵，破壞其高級結構；用烷基化試劑封閉巰基，防止其重新形成二硫鍵；(2)用化學消化或酶消化法對蛋白質進行消化，產生適于質譜分析的肽段；用試劑對酶切肽段的側鏈氨基進行保護；(3)對肽段進行化學修飾和處理并進行質譜定量；其特征在于所述步驟(3)的處理方法為(a)用一種或多種雙功能螯合劑對肽段進行修飾，使其帶上螯合基團；(b)分別用兩種不同的或多種單同位素稀土元素金屬鹽離子，與標記在肽段上的螯合劑發生螯合作用；(c)將兩種分別標記有不同稀土金屬離子的待比較樣本的肽段混合物合并，用色譜分離手段將合并肽段進行分離；(d)用質譜定量與鑒定肽段，進行質譜數據的解析及蛋白質的鑒定。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)所述雙功能螯合劑為分子內帶氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或異硫氰酸基多羧酸活性聯接基團的化合物。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)所述雙功能螯合劑為二乙三胺五乙酸雙酸酐。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(b)所述稀土元素為三氯化釔和三氯化鋱。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(d)所述質譜是LC-ESI-MS/MS電噴霧離子化串聯質譜，或MALDI TOF/TOF基質輔助激光解離飛行時間串聯質譜。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(d)所述質譜數據的解析及蛋白質的鑒定方法為使用數據庫搜索。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)的處理方法為(a)用二乙三胺五乙酸雙酸酐對肽段進行修飾，使其帶上螯合基團；(b)分別用三氯化釔和三氯化鋱與標記在肽段上的螯合劑發生螯合作用；(c)將兩種分別標記有不同稀土金屬離子的待比較樣本的肽段混合物合并，用一維或多維色譜分離手段將合并肽段進行分離；(d)用基質輔助激光解離飛行時間串聯質譜定量與鑒定肽段，使用數據庫搜索進行質譜數據的解析及蛋白質的鑒定。
8.一種用于定量蛋白質組學中稀土元素金屬螯合標記蛋白質的試劑盒，其特征在于該試劑盒的組分包含(a)一種或多種對肽段進行修飾，使其帶上螯合基團的雙功能螯合劑；(b)兩種或多種單稀土元素三氯化物；(c)能進行肽段色譜分離的色譜柱。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于組分(a)所述雙功能螯合劑為分子內或帶氨基多羧酸，芳香胺多羧酸，或帶異硫氰酸基多羧酸活性聯接基團的化合物。
10.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于組分(c)所述色譜柱為反相柱或離子交換柱。
全文摘要
本發明提供了一種稀土元素金屬螯合標記蛋白質，用于定量蛋白質組學研究的新方法和試劑盒。該方法涉及蛋白質的還原烷基化和胰酶酶切、肽段的雙功能試劑修飾、稀土元素金屬的鰲合、多維液相色譜分離與多級串聯質譜聯用定量與鑒定。通過一級質譜峰離子信號強度來定量，蛋白質的鑒定通過串聯二級質譜和數據庫搜庫。本發明還提供了便于該方法實施的試劑盒。
文檔編號G01N30/06GK101042375SQ20061006507
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月20日 優先權日2006年3月20日
發明者錢小紅, 劉慧玲, 張養軍, 王京蘭 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所