專利名稱：使用動物血清或血漿配制甲狀腺激素免疫分析校準品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以動物血清或血漿替代人血清或血漿配制甲狀腺激素免疫診斷試劑盒校準品的方法，該校準品是免疫診斷試劑盒的一個重要組件。
背景技術：
免疫診斷試劑對待測物的定量測定基于校準品與待測樣本之間的比較，通過對比免疫反應后二者信號的強弱，從而對樣本中的待測物進行定量。無論對于樣本或校準品，二者的介質(或基質，指除了待測物以外的所有其它組分的總和)都會對免疫分析信號的強弱產生影響，從而影響待測物定量結果的準確性。不同的介質參數、不同的免疫分析模式、以及不同的待測物種類對免疫診斷產生的結果可能相似也可能截然不同，但對于免疫診斷試劑盒校準品的配制，一個總的原則是校準品介質要盡可能地與待測物標本相一致，即二者介質在組份種類、含量、介質粘度、酸堿性、干擾物質類型、濃度等各方面保持一致，以便使校準品、樣本之間的信號具有可比性。目前免疫診斷試劑大多以人血清或血漿作為標本，因此原理上也要求使用相應的人血清或血漿配制校準品；但由于人血清或人血漿來源困難，成本高，而且較大量的人血清或血漿往往來源于多個不同個體，其中可能存在多種復雜、未知的潛在病原體(如各種肝炎病毒、性傳播疾病病原體等)，處理和使用這種人血液制品均存在一定程度的風險；盡管目前幾乎所有免疫診斷試劑中的人血液組分都經過了HBsAg、抗HCV、HIV、TP等常見病原體的檢測，均為檢測陰性制品，但由于檢測方法的局限(存在假陰性)以及眾多未經檢測的其它病原體存在的可能性，人血液制品的處理和使用仍存在相當程度的危險。基于上述原因，目前國內外的某些免疫診斷試劑盒校準品的配制使用含蛋白質的緩沖液或動物血液制品(全血、血清或血漿)，通過模擬，使緩沖液或動物血液等替代品與待測樣本的介質具有相似的蛋白含量、酸堿性、粘度，從而使校準品不僅能滿足準確檢測的目的，還使校準品的處理、配制和使用更容易、更安全，同時也降低了試劑盒成本。
但使用上述替代品配制的免疫診斷試劑盒校準品目前僅限于部分蛋白質類待測物的檢測，如AFP、CEA、TSH、INSULIN等。一些受樣本基質成分影響較大的待測物，如TT3、TT4、FT3、FT4、rT3，目前其檢測試劑盒校準品的配制仍使用人血清或人血漿。
使用人血液以外替代物，如動物血清或血漿，配制TT3、TT4、FT3、FT4、rT3等待測物校準品有三個前提1)動物血清或血漿中的T3、T4、rT3等甲狀腺激素與人血清或血漿中的待測物分子T3、T4、rT3具有完全相同的分子結構和免疫反應活性；2)動物血清或血漿中的T3、T4、rT3與其中的甲狀腺激素結合蛋白的結合行為與人血液中的結合行為相似；3)可以通過去除人血清或血漿中T3、T4、rT3同樣的方法去除動物血清或血漿中的T3、T4、rT3；上述1)、2)二個前提使動物血清或血漿中的甲狀腺激素能真實模擬人血清或血漿樣本中的甲狀腺激素(T3、T4、rT3)及其存在狀態，前提3)使動物血清或血漿能用于低濃度校準點的配制。
目前尚未見使用人血清或血漿以外的替代物配制甲狀腺激素校準品的報道和實際應用。
發明內容
本發明公開一種使用動物血清或血漿配制甲狀腺激素免疫分析校準品。
本發明是這樣實現本發明是一種以動物血清或血漿替代人血清或血漿配制甲狀腺激素免疫診斷試劑盒校準品的方法，包括人血清或血漿替代品的種類、處理方式和適用范圍，通過去除動物血清或血漿中的甲狀腺激素、校準品的配制、校準及方法可靠性驗證等步驟配制甲狀腺激素免疫診斷試劑盒校準品。
本發明所述的動物血清或血漿的種類包括牛、馬、豬、羊、兔、鼠的動物血清或血漿。
本發明所述的去除動物血清或血漿中甲狀腺激素的處理方式包括稀釋、添加試劑、去激素等步驟；處理方法可采用活性碳吸附法，具體操作為，以生理鹽水(含0.9％NaCl的蒸餾水)稀釋動物血清或血漿至原濃度的80％～90％，加入活性碳，混勻24～48小時；加入助沉劑，混勻24～48小時；離心去除活性碳和助沉劑，分離血清或血漿；動物血清或血漿的處理方法也可以采用陰離子交換樹脂法，具體操作為，用酸、堿法處理陰離子交換樹脂；將陰離子交還樹脂與動物血清或血漿混合，攪拌48小時；過濾分離血清或血漿。
本發明所述的主要性能參數指血清或血漿的粘度、酸度、蛋白含量、與待測物或相關物質的結合能力、干擾物質類型、濃度。
本發明所述的適用范圍指適用于本發明的免疫診斷待測物的類型或種類，特指目前仍使用人血清或血漿配制校準品的甲狀腺激素，包括用于甲狀腺功能評估的FT3(游離三碘甲狀腺原氨酸)、FT4(游離甲狀腺素)、TT3(總三碘甲狀腺原氨酸)、TT4(總甲狀腺素)、rT3(反式三碘甲狀腺原氨酸)。T4、T3、rT3是人體主要的甲狀腺激素，是評價人體甲狀腺功能狀態的常用指標。因為血清或血漿中FT3、FT4、TT3、TT4、rT3的測定受多種介質因素(如蛋白對激素的結合能力)的影響，要準確測定甲狀腺激素的濃度，要求校準品介質與待測標本介質具有良好的一致性，即二者具有相似的粘度、酸度、蛋白含量、蛋白對激素的結合能力、干擾物質類型、濃度等；以前沿用人血清或人血漿配制甲狀腺激素免疫診斷試劑盒校準品，本發明描述了以動物血清或血漿替代人血清或人血漿用于配制甲狀腺激素免疫診斷試劑盒校準品的方法。
本發明的有益效果是(1)由于本發明涉及的動物血清或血漿來源于個體單一、飼養環境可控的動物，使得動物血清或血漿的制備、處理以及制品的使用都更加安全可靠；(2)本發明可使用常規的人血清或血漿處理方法去除動物血清或血漿中的甲狀腺激素，如活性碳吸附法(A)以生理鹽水(含0.9％NaCl的蒸餾水)稀釋動物血清或血漿至原濃度的80％～90％。將1000ml血清與120g活性碳(Sigma C3345)混合，置于旋轉混勻器上處理48小時；(B)加入200g高嶺土磨成的粉末，攪拌混勻后置于旋轉混勻器上處理48小時；(C)取出混合物，于40000×g超速離心5～8小時，取上清，測量甲狀腺激素的濃度；若甲狀腺激素殘留濃度仍較高，重復以上步驟。通過上述處理，本發明所用的動物血清或血漿可以不含或只含極低濃度的甲狀腺激素，可有效用于低濃度甲狀腺激素校準品的配制。
(3)本發明可顯著降低校準品配制成本；以動物血清或血漿配制的校準品成本大約是人血清或血漿配制的校準品的1/10。
具體實施例方式實施例1基于小牛血清校準品的FT3 TRFIA與基于人血清校準品的FT3 TRFIA，其使用方法為1、去除小牛血清中的甲狀腺激素(A)將1000ml血清與120g活性碳(Sigma C3345)混合，置于旋轉混勻器上處理48小時；(B)加入200g高嶺土磨成的粉末，攪拌混勻后置于旋轉混勻器上處理48小時；
(C)取出混合物，于40000×g超速離心5～8小時，取上清，測量甲狀腺激素的濃度；若甲狀腺激素殘留濃度仍較高，重復以上步驟。
2、防腐與貯存在已去除甲狀腺激素的小牛血清中加入生物防腐劑NaN3至終濃度0.05％～0.1％。
3、FT3TRFIA校準品的配制與校正在已去除甲狀腺激素的小牛血清中加入不同量的三碘甲狀腺原氨酸(T3)，混勻后靜置12小時。使用不受樣本結合蛋白影響的FT3反滴定測定方法(Wallac FT3 TRFIA)校正上述FT3校準品的FT3濃度，使六個FT3校準品的FT3濃度值分別為0、1.5～3pmol/L、6～8pmol/L、15～18pmol/L、35～39pmol/L、70～80pmol/L。
4、基于小牛血清校準品的FT3TRFIA以上述基于小牛血清校準品的FT3TRFIA測量17份待測人血清樣品FT3濃度(1)試劑的準備將銪標記抗T3單克隆抗體配制成工作濃度；將分析緩沖液、校準品、17份待測人血清樣品和所需數量的微孔反應條平衡至室溫(20～25℃)。
(2)吸取25μl校準品和待測樣品，加入反應板微孔內。
(3)在各微孔內加入150μl己稀釋的銪標記抗T3單克隆抗體溶液，在室溫(20～25℃)下慢速振動1小時。
(4)洗板6次。將板條在潔凈無塵的吸水紙上拍干。
(5)在每個微孔內加入150μl增強液，于慢檔振板5分鐘。
(6)將微孔反應板已固定在時間分辨熒光測定儀上進行檢測；儀器處理數據后得到樣本FT3濃度值。
5、基于人血清校準品的FT3 TRFIA分別按上述1、2、3、4實施人血清去除甲狀腺激素、防腐與貯存、FT3 TRFIA校準品配制與校正、FT3 TRFIA測量17份待測人血清樣品，得到基于人血清校準品的17份血清樣品的FT3濃度值。
6、Wallac FT3 TRFIA將上述17份待測人血清樣品以Wallac FT3 TRFIA(二步反滴定法)測定，得到基于人血清校準品的17人血清樣品的FT3濃度值。
7、測量值(pmol/L)的準確性對比
注1#FT3 TRFIA，基于小牛血清校準品的FT3 TRFIA；2#FT3 TRFIA，基于人血清校準品的FT3 TRFIA；3#FT3 TRFIA，Wallac FT3 TRFIA。
上述結果顯示，基于小牛血清校準品的1#FT3 TRFIA與基于人血清校準品的2#FT3TRFIA、3#Wallac FT3 TRFIA測量值顯著相關；以Origin-5.0軟件處理數據，相關系數均為0.999，測量值具有一致性(R＞0.05)。
實施例2基于小牛血清校準品的TT4 TRFIA與基于人血清校準品的TT4 TRFIA，其使用方法為1、去除小牛血清中的甲狀腺激素方法步驟同實施例1。
2、防腐與貯存在已去除甲狀腺激素的小牛血清中加入生物防腐劑NaN3至終濃度0.05％～0.1％。
3、TT4 TRFIA校準品的配制與校正在已去除甲狀腺激素的小牛血清中加入不同量的甲狀腺素(T4)，混勻后靜置12小時；使用Wallac TT4 TRFIA校正TT4校準品的TT4濃度，使六個TT4校準品的TT4濃度值分別為0、20-30nmol/L、50-60npmol/L、100-110nmol/L、150-160nmol/L、290-300nmol/L。
4、基于小牛血清校準品的TT4 TRFIA以上述基于小牛血清校準品的TT4 TRFIA測量16份待測人血清樣品TT4濃度
(1)試劑的準備將洗滌液、銪標記準備好并將分析緩沖液、校準品、16份待測人血清樣品和所需數量的微孔反應條平衡至室溫(20～25℃)。
(2)吸取25μl校準品和待測樣品，加入反應板微孔內。
(3)在各微孔內加入150μl已稀釋的銪標記溶液，在室溫(20～25℃)下慢速振動1小時。
(4)洗板6次。將板條在潔凈無塵的吸水紙上拍干。
(5)在每個微孔內加入150μl增強液，于慢檔振板5分鐘。
(6)確定微孔反應板已固定在時間分辨熒光測定儀上進行檢測；儀器處理數據后得到樣本TT4濃度值。
5、基于人血清校準品的TT4 TRFIA分別按上述1、2、3、4實施人血清去除甲狀腺激素、防腐與貯存、TT4 TRFIA校準品配制與校正、TT4 TRFIA測量16份待測人血清樣品，得到基于人血清校準品的16人血清樣品的TT4濃度值。
2、Wallac TT4 TRFIA將上述16份待測人血清樣品以Wallac TT4 TRFIA(二步反滴定法)測定，得到基于人血清校準品的16人血清樣品的TT4濃度值。
3、測量值(nmol/L)的準確性對比
注1#TT4 TRFIA，基于小牛血清校準品的TT4 TRFIA；2#TT4 TRFIA，基于人血清校準品的TT4 TRFIA；3#TT4 TRFIA，Wallac TT4 TRFIA。
上述結果顯示，基于小牛血清校準品的1#TT4 TRFIA與基于人血清校準品的2#TT4TRFIA、3#Wallac TT4 TRFIA測量值顯著相關，以Origin-5.0軟件處理數據，相關系數分別為0.997、0.995，測量值具有一致性(R＞0.05)。
通過上述數據可看出本發明所用方法可成功去除動物血清或血漿中的甲狀腺激素，以這種去除激素的動物血清或血漿替代人血清或血漿配制甲狀腺激素免疫診斷試劑盒校準品，可以準確測定人血液樣本中的總甲狀腺激素或游離甲狀腺激素的濃度。
權利要求
1.使用動物血清或血漿配制甲狀腺激素免疫分析校準品，包括人血清或血漿替代品的種類、處理方式和適用范圍，其特征在于所述的動物血清或血漿的處理方式包括稀釋、添加試劑、去激素或去除某種或某幾種組分，處理方法可采用活性碳吸附法，具體操作為，以含0.9％NaCl的蒸餾水稀釋動物血清或血漿至原濃度的80％～90％；加入活性碳，混勻24～48小時；加入助沉劑，混勻24～48小時；離心去除活性碳和助沉劑，分離血清或血漿；動物血清或血漿的處理方法也可以采用陰離子交換樹脂法，具體操作為，用酸、堿法處理陰離子交換樹脂；將陰離子交換樹脂與動物血清或血漿混合，攪拌48小時；過濾分離血清或血漿。
2.根據權利要求1所述的使用動物血清或血漿配制甲狀腺激素免疫分析校準品，其特征在于所述的動物血清或血漿的種類包括牛、馬、豬、羊、兔、鼠的動物血清或血漿。
3.根據權利要求1所述的使用動物血清或血漿配制甲狀腺激素免疫分析校準品，其特征在于所述的適用范圍指適用于本發明的免疫診斷待測物的類型或種類，特指目前仍使用人血清或血漿配制校準品的甲狀腺激素，包括用于甲狀腺功能評估的FT3、FT4、TT3、TT4、rT3。
全文摘要
本發明為使用動物血清或血漿配制甲狀腺激素免疫分析校準品，包括動物血清或血漿的種類、處理方式、適用范圍。由于本發明使用動物血清或血漿代替人血清或血漿配制甲狀腺激素免疫診斷試劑盒校準品，從而使得血清的處理、校準品的配制和使用都更為安全，診斷試劑成本顯著降低。
文檔編號G01N33/531GK1904614SQ200610027229
公開日2007年1月31日 申請日期2006年6月2日 優先權日2006年6月2日
發明者吳馮波, 張小寒, 沈正陽, 唐曉燕 申請人:上海新波生物技術有限公司, 蘇州新波生物技術有限公司