專利名稱：在活體細胞中篩選配體與受體結合的方法和系統的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及在活體細胞中高通量篩選配體-受體結合的方法和系統。
背景技術：
高通量篩選(High-throughput screening，HTS)研究得益于近年來許多其他技術的進步。巨型化合物庫的合成技術和篩選過程中自動機器人的參與使許多藥物開發公司能夠常規地每天篩選大量的化合物。
體外和活體檢測中的高通量篩選是評估化合物的重要過程。以細胞為基礎的分析方法，尤其那些利用光學端點的活性篩選方法能研究這些化合物的廣泛的功能特征，如特異性的細胞內生物化學通路、蛋白質間相互作用和靶點的亞細胞定位。組合化學和高通量篩選與實時藥理學的整合是藥物發現和開發的重要部分。
G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是細胞表面受體中極為重要的一類。所有市場上處方藥中超過60％的藥物都是通過與已知的G蛋白偶聯受體相互作用而發揮作用的，這說明了此類受體在藥學上的重要性。成百上千的受體通過異三聚體G蛋白傳遞信息，目前已經分離了其中至少17種不同的形式。大多數G蛋白偶聯受體由線狀7次跨膜單蛋白鏈組成。這些受體常被稱為7次跨膜受體(seven-transmembrane receptors，STRs)。目前已經發現一百多種不同的GPCRs，包括許多結合同一配體的不同受體，可能還有更多的GPCRs還未被發現。開發新的藥物發現分析方法以鑒定新的GPCRs調控子將會極為有益。
細胞膜受體蛋白作為治療性用途靶點是極有價值的。細胞膜受體的例子包括G蛋白偶聯受體和酪氨酸激酶受體(receptors of tyrosine kinases，RTKs)。細胞膜受體可能參與了免疫系統調節、自主神經系統信息傳遞、炎癥反應、細胞分化和增殖以及生理感覺如嗅覺和視覺。
在許多生物活動過程中，配體-受體結合(ligand-receptor binding，LRB)觸發了一系列細胞信號轉導事件的發生。除這些事件外，GPCR蛋白通路的共同特征是一個含有與配體結合的受體的內吞囊泡的內在化。在許多酪氨酸激酶通路中也能觀察到細胞內吞作用。基于GPCRs和RTKs作為藥物靶點的重要性，已經發展了一些研究配體受體結合的細胞內吞的方法，包括測量細胞膜電容的膜片鉗技術(cell membrane capacitance，Cm)、免疫化學方法和綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)標記方法。
在GPCRs通路中幾乎不存在膜電容測定所需的離子流。免疫化學方法在檢測中常需要大量的細胞，且需耗幾十分鐘。雖然綠色熒光蛋白標記GPCR蛋白被應用，但存在許多缺點1)不能應用于野生型GPCRs；2)GPCR-GFP信號很微弱不能用于檢測單個囊泡內吞；3)綠色熒光蛋白標記可能改變GCPRs自身的某些特性；GFP標記的RTKs的也擁有關于敏感性和基因工程方面相似的問題。由于GPCRs和RTKs在治療應用上的重要性，亟待發展能用于高通量篩選系統中的高敏感性的檢測方法。
發明內容
一方面，本發明是關于建立了用于檢測配體與細胞膜受體結合并產生內吞的具體方法，即在單個細胞上檢測配體與一種或多種細胞膜受體結合的一種方法，包括用熒光染料及配體的孵育細胞的步驟；檢測內吞囊泡的熒光染料等。
另一方面，本發明涉及配體與細胞膜蛋白結合的篩選系統。一個與本發明相對應的系統包括自動液體控制裝置、x-y方向定位平臺、單細胞內吞囊泡成像顯微鏡及其配套裝置，以及能夠控制x-y方向單位步徑的操作系統。
本發明的其它方面和優點將會在以下的說明書和權利要求書中進一步說明。
圖1顯示一種配體與GPCR結合后通過GRK引起磷酸化、并與β-抑制蛋白(β-arrestin)結合觸發內吞等。
圖2A-2B顯示細胞FM孵育過程及隨后的FM成像結果。
圖3A-3B顯示在單個DRG神經元上通過FEI方法記錄到的ADP引起的內吞現象和柱狀圖統計結果。
圖4A-4B顯示在單個DRG神經元上通過FEI方法記錄到的5-HT引起的內吞現象和柱狀圖統計結果。
圖5A-5B顯示在單個DRG神經元上通過FEI方法記錄到的NGF引起的內吞現象和柱狀圖統計結果。
圖6A-6B顯示本發明的一種用于在同一DRG神經元上觀察不同類型的配體與其相應的多種受體結合的方法。
圖7A-7D顯示本發明的一種用于實時檢測配體-受體結合及其產生內吞的方法。
圖8A-8E顯示本發明的一種在同一細胞上應用不同顏色的熒光染料檢測不同配體-受體結合的方法。
圖9A-9C顯示本發明的一種在多孔板上篩選配體-受體結合及其產生內吞的方法。
圖10顯示一套應用本發明方法進行高通量篩選的自動系統的示意圖。
具體實施例方式本發明提供了篩選配體與細胞膜受體結合的具體方法和系統。本發明的方法是建立在檢測或監測配體-受體結合后產生的內吞小泡。這些方法不針對某種特定的受體，而是普遍適用于細胞膜上眾多的受體同與其相應的配體結合后產生的內在化(內吞)。這樣的受體包括如G蛋白偶聯偶聯受體(GPCR)和酪氨酸激酶受體(RTK)家族。因此，本發明有很多應用價值，包括用于篩選與不同細胞膜受體結合的治療性藥物。
本發明適合于任何能夠產生內在化(內吞)的受體，為明晰起見，下面以GPCR和RTK家族為例詳細說明。然而，這些例證并不用于限定本發明的適用范圍。
七次跨膜的GPCR是最大的一種細胞膜受體家族。這種受體將細胞外生物信號通過配體-GPCR結合后轉化為一系列的細胞內生物信號，參見Conner等，“Regulated Portals of Entry into the Cell，”Nature，42237-44(2003)。激動劑與GPCR結合導致包括GPCR反應失敏、GPCRs內在化以及GPCRs的同與G蛋白無關的信號轉導通路的結合。GPCR失敏是第二信使依賴的蛋白激酶(secondmessenger-dependent protein kinase)或G蛋白偶聯受體激酶(GRKs)引起的G蛋白磷酸化反應導致與G蛋白解偶聯的結果。GRK介導的受體磷酸化加速與β-抑制蛋白的結合，β-抑制蛋白與許多種GPCRs結合后能夠引起網絡蛋白包埋的受體囊泡內在化(比如，內吞)，參見Ferguson，S.S.，“Evolving Concepts in GProtein-Coupled Receptor Endocytosisthe Role in Receptor Desensitizationand Signaling，”Pharmacology Review，531-24(2001).在所有的GPCR中，配體-受體結合引起的內在化(內吞)都涉及一個高度保守的區域。因此，配體-受體結合引起的內吞是大多數GPCRs的共性。
GPCRs參與了許多刺激-反應通路，從通過細胞內信息傳遞到生理感應，如視覺和味覺。GPCR功能的多樣性是與其識別極其眾多種類的配體相匹配的，這些配體中包括蛋白質，小分子甚至光子。GPCR在正常生理過程和病理狀況中的普遍參與使得GPCR成為40-50％的現代藥物的作用靶點。
RTK是由配體-受體結合產生內吞的另一大的受體家族。這種受體參與細胞內信號轉導并調控細胞的關鍵性功能活動，比如細胞增殖、分化、抗凋亡和神經突生長等。這些酶的活性失控，例如通過點突變或過渡表達等機制，將導致各種癌變或者良性增生。確實，70％以上的已知癌基因和原癌基因都是為RTKs編碼的。
配體-受體結合引起的內吞已經被廣泛研究。該過程是通過細胞膜內陷形成囊泡從細胞膜脫離，使得囊泡再進入細胞內的過程。圖1詳細顯示了這一經典的GPCR的內吞過程。除產生第二信使外，受體-配體結合還引起GPCR的細胞內GPCR的C末端磷酸化(由G蛋白受體激酶介導)，隨后β-抑制蛋白與磷酸化的GPCR結合觸發受體通過囊泡內吞而內在化。類似的過程(受體內在化)也發生在RTKs上。
多種技術已經被開發并應用于研究配體-受體結合引起的內吞過程。有少部分GPCRs能夠調控離子通道和/或細胞內鈣庫，GPCR與其受體結合會產生離子電流或細胞內瞬間的鈣離子濃度的升高。然而絕大多數GPCRs不能產生任何瞬時離子電流，因此促成了其它技術的發展。
最近開發的兩種技術涉及使用綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)標記GPCR或β-抑制蛋白。熒光共振能量的轉移(Fluoresenceresonance energy transfer，FRET)用于檢測有GFP標記的GPCR的配體-受體結合。標記有GFP的β-抑制蛋白也可以用于以同樣的方式檢測配體與GPCR的結合。然而，這兩種方法都存在有缺陷(i)FRET不適用于分析野生型的GPCRs；(ii)GPCR-GFP的信號太弱而不能用于檢測單個囊泡內吞；(iii)GPCRs鏈接GFP后可能會使GCPRs失去其原有的部分特性；(iv)帶GFP標記的β-抑制蛋白僅適用于由細胞工程改造過的表達適當量的GFP標記的β-抑制蛋白、GRK和受體的細胞。由于多種類型的β-抑制蛋白，GRKs和受體的存在，這種技術不適用于天然受體。研究RTks內吞的技術中也出現了類似的問題。
通常引起胞吐和內吞的兩種刺激是去極化和化學配體。雖然對配體-受體結合不能實時檢測，但是一些方法能夠實時檢測胞吐和內吞。共聚焦FM成像已經用于實時分析胞吐以及延期測定在單個細胞上的內吞(時間延遲約3-5分鐘)。參見Zhang等，“Calcium-And Dynamin-Independent Endocytosis In Dorsal RootGanglion Neutrons，”Neuron，42225-236(2004)。FM成像的優點是可以顯示內吞囊泡的空間分布。另一種實時檢測是用膜片鉗分析細胞膜電容(membranecapacitance，Cm)的變化。Cm已經被用于研究去極化引起的胞吐和內吞過程。該方法同樣可以記錄配體引起的胞吐。
本發明的方法基于FM內吞成像(FM endocytosis imaging，FEI)。共聚焦成像能夠用于檢測配體-受體結合引起的內吞。FEI方法的原理是(i)細胞外苯乙烯基FM染料(如FM2-10)通過內吞囊泡被吞噬；(ii)FM染料分子被吞入囊泡后亮度會增加100倍左右。這樣，經過適當的刺激，負載FM的單個囊泡在通用的共聚焦顯微鏡下就可以被檢測到。
圖2A顯示本發明的一種方法。如圖2A所示，單個細胞用含有一種染料(比如一種FM染料)和一種能夠與該細胞膜上一種已知的受體結合的配體進行處理。配體與其受體結合觸發該受體內在化(內吞)。在內吞過程中，FM染料也會同時被吞噬進入內吞囊泡。然后，將多余的FM染料清洗干凈，這樣只有裝載有FM染料的囊泡才能夠檢測到熒光。通過這種方法，在單細胞中的單個囊泡就可以應用FM成像而被觀察到。需指明的是，在這個例子中使用的是一種FM染料，而其它適合的染料也可以使用，并且不超過本發明的應用范圍。再者，既然FM染料(或其它類似的染料)被吞噬入囊泡后已經實質上地增加了熒光強度(增加大約100倍)，也就沒有必要將細胞外多余的FM染料完全清洗干凈。因此，本發明的一些其它方法可能沒有包括這一清洗步驟。
含有染料的細胞囊泡的圖像可以通過合適的顯微鏡被觀察到，包括共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡。共聚焦顯微鏡掃描成像(Go et al.，AnalyticalBiochemistry 247210-215(1997))和多光子顯微鏡成像(Denk et al.，Science24873(1990))是得到高精度顯微鏡樣品的圖像分析的成熟方法。這些系統的優點在于它們的焦深很窄，這就能夠在有限的軸相范圍內進行特征分析。例如，這使得細胞胞漿內的特性和細胞膜表明的特性能夠被區分開。多光子掃描成像使用的是短脈沖式激光，因此，用這種系統可以檢測到熒光的延續時間(Lakowicz et al.，Anal.Biochem.202316-330(1992))，提供一些額外的不同的檢測性能。下面描述的是來自共聚焦顯微鏡獲得的結果。然而，本領域的一般技術人員會懂得這些只是用以描述，而本發明的具體實例可以用其它類似功能的顯微鏡來實現。
在操作共聚焦顯微鏡時，改變不同的掃描層可得到相應層的光切面(Optical slides，OSs)。圖2B是一例圖，顯示的是細胞在共聚焦顯微鏡下掃描厚度1-2μm得到的OS。這些數據可以觀測到一層或全細胞掃描圖片的FM熒光亮點(單個囊泡)分布，全細胞掃描圖片是該細胞各層OSs疊加圖。查看單個OS的優點是可以觀察到細胞內內吞囊泡的行蹤軌跡，這就為研究囊泡細胞內行蹤提供了可能。全細胞掃描圖可以觀察到囊泡的總數，提供了所有分析中的最高敏感度。例如，全細胞掃描圖片可以用于監測配體-受體結合事件的時間效應——比如實時監測。
與本發明一些具體內容相一致，全部的過程從細胞的制備、熒光染料的添加、配體的添加、多余的染料的洗脫、FM熒光亮點成像的OS以及數據的分析都可以由自動操作系統控制(將在后面描述)。再者，由于FEI是一種光學技術，應該能夠很好的適用于發展一種快速的高通量生物分析。因此，FEI技術應該能夠在評估后選藥物與所選的受體的結合上具有應用價值。
FEI生物分析舉例 圖3A顯示在單個背根神經節(DRG)神經元上ADP引起的內吞FM成像。DRG取自雄性Wistar大鼠(80-120g，SLACCAS公司，上海)胸段和腰段脊髓，并在4℃的DMEM溶液(GIBCO Laboratories，NY)中用95％ O2和5％ CO2充氧，神經節放于37℃含有1.0mg/ml的膠原酶(IA型，Sigma)和0.3mg/ml胰酶(III型，Sigma)的培養液中消化40分鐘，用標準細胞外液洗脫5次，用光滑細滴管吹打神經節至無明顯的塊狀物質。將細胞懸濁液滴加在小的玻片上。處理好的細胞可以使用1-8小時。實驗只觀察直徑＜25μm的神經元。
在圖3A，細胞表明用白圈標記。對照組細胞用含有FM染料的細胞外液孵育3分鐘，實驗組細胞用含有ADP和FM染料的細胞外液孵育3分鐘。標準細胞外液(ES)的成份150mM NaCl，5mM KCl，2.5mM CaCl2，1mM MgCl2，10mMHEPES，和10mM葡萄糖，調pH＝7.4。FM染料，比如可能是FM2-10或FM4-64，配置成適宜的濃度(比如10-100μM)。所有的實驗都在室溫(22-25℃)下進行。然后將細胞外含有FM的溶液洗去(用細胞外液漂洗，洗3次)，這樣以去除細胞外非特異性的FM沾染。給液和灌洗都可采用已知的液體控制或給藥系統來完成。例如，本實驗中使用的武漢INBIO公司生產的MPS-2給藥系統。MPS-2給藥系統是通過電磁閥控制可以快速切換(＜50ms)的7道給藥系統。
細胞內含有染料的囊泡可通過共聚焦顯微鏡成像觀察，比如Zeiss LSM510(Germany)。FM2-10和FM4-64都可被488nm激光激發，FM2-10的發射光是505-600nm，而FM4-64的發射光＞630nm。因此，細胞內同時存在有這兩種染料，采用不同的濾光鏡就可以將這兩種信號分別顯示出來。
圖3A結果所顯示的FM亮點數(代表內吞囊泡的多少)在用ADP刺激的細胞中有非常顯著的增加，暗示ADP通過與其GPCR(P2Y)結合產生了內吞效應。圖3A顯示的是細胞一個1μm OS圖像和由20個OS疊加的全細胞圖像。從單個OS的FM亮點分別來分析，ADP引起的囊泡在DRG神經元胞漿區域的分布多于周邊區域的分布。這種空間分布可以為研究囊泡的行蹤軌跡提供可能。
每張OS中的FM亮點可以人工或自動計數，比如利用一些輔助軟件，例如Media Cybernetics公司的Image-ProPlus軟件(Silver Spring，MD)。囊泡成像的大小在0.04μm2到1μm2之間。所以，通過FM亮點圖像的象素大小就可以計算出囊泡的相應大小。工藝上普遍采用影像處理技術，本領域的一般技術人員會知道這些圖像是可以進行技術的，比如對圖像的平滑以及動態分布(熒光強度分布)等進行調節，使絕大部分(一般＞90％)的熒光亮點都能夠被計數，盡可能地減少背景干擾。
這種定量數據在任何已知的分析中都可被應用，比如柱狀圖形式，如圖3B所示，用于分析配體-受體結合和內吞過程。柱狀圖可以清楚地顯示經ADP作用后細胞內FM亮點顯著性的增多。柱狀圖代表的所有FM亮點數比所有OSs多。圖3C的柱狀圖顯示細胞內囊泡的分布情況。胞漿區域的內吞囊泡數是周邊區域囊泡數將近2倍。
通過上述介紹，由于配體-受體結合引起的內吞是一種普遍現象，本發明方法應該可用于其它配體和/或受體，如圖4A和4B所示的是5-HT(5-羥色胺)與其相應的受體結合的檢測結果。
圖4A左圖顯示的是對照組(用細胞外液和FM孵育3分鐘)FM成像圖，DRG神經元胞漿中僅有非常少的FM亮點。與之相反，圖4A右圖顯示的是5-HT(0.1mM)處理(用細胞外液、5-HT和FM孵育3分鐘)后DRG神經元胞漿中出現了大量的內吞囊泡。圖4B顯示的是該現象的柱狀圖統計結果。
綜上所述，本發明的方法也能夠用于其它非GPCR家族的細胞膜受體，假如這些受體也通過配體-受體結合引起的內吞起作用。圖5舉例說明神經生長因子(NGF)與一種酪氨酸激酶(RTK)家族的受體結合的實驗結果。NGF是一種多效性神經營養調節蛋白，調節NGF敏感神經元的發育，保護和再生等。在DRG神經元上，NGF可以和RTK結合。如同ADP和5-HT一樣，FEI成像結果顯示NGF(50ng/ml)可引起細胞胞漿中內吞囊泡明顯的增多。圖5B是該結果的統計柱狀圖。
應用FEI，在同一個細胞上能夠量化不同GPCRs的相對豐度。如圖6A所示，在單個DRG神經元上對應6種不同的GPCR分別添加了6種不同配體并進行了FM亮點計數(FM亮點數代表內吞囊泡數)。這6種配對的GPCR(配體)分別是P2Y受體(ADP)，5HT受體(5-HT)，M型ACh受體(MCh)，GABAB受體(baclofen)，α腎上腺素受體(NE)和δ-鴉片受體(deltorphin)。如圖6B所示，激動P2Y受體，5HT受體和δ-鴉片受體產生的FM亮點數比激動α腎上腺素受體，GABAB受體和M型ACh受體多2-3倍，即暗示在DRG神經元細胞膜上前面幾種受體數量要比后面幾種受體豐富很多。
如上述所示，天然細胞含有多種能夠介導內吞的受體。這些細胞不適合用于篩選作用于一個特定受體的藥物。對于這樣的藥物篩選，可以通過在細胞上表達特定的靶受體來解決。即在細胞上只表達一種特定的受體，這種受體可以是天然的也可以是轉染產生的。本發明的方法同樣適合于轉染特定受體的細胞。轉染靶受體的方法已經是眾所皆知了。
例如，在正常不表達某種GPCR的哺乳類細胞上異源性表達重組哺乳動物該受體，就為研究該受體功能或該受體的特異性激動劑和拮抗劑提供了便利參見美國，專利號5,401,629，申請人Harpold等)。該專利揭示了在小鼠細胞表達人類毒蕈堿受體(human muscarinic receptor，HM1)。這些異位表達研究給受體信號機制研究和基因突變研究提供了可能。基因突變研究在確定受體與配體結合的有效部位或受體信號轉導有效部位十分有效。另外，除這種對機制的研究外，按照本發明的具體內容，細胞轉染也可以用于檢測配體(如激動劑)與特定受體結合。
FEI的實時記錄 如上所述，本發明的方法能夠相對簡單地提供內吞囊泡的圖像信息。因此，這些方法在用于檢測配體-受體結合引起的內吞時可用于實時監測內吞過程。這一技術被命名為熒光強度FEI記錄(fluorescence intensity of FEI recording，FIF記錄)，如圖7A-7D所示。應用于實時監測，上述的FEI方法將作以下調整以獲得更理想的FIF記錄結果(i)空間分布效應將減弱，即增加OS厚度以提高檢測的靈敏度；(ii)共聚焦掃描將Z軸固定(通常Z軸固定在接近于細胞的中間)；(iii)細胞成像記錄時，細胞外液中有FM染料(即不再洗去細胞外液中的染料)。在這些條件下，FIF記錄能夠快速獲得許多配體結合后X-Y軸細胞圖像以便實時監測配體-受體結合引起的效應。
圖7A舉例說明實時記錄配體-受體結合引起的效應。如圖所示，細胞放置于含有熒光染料(如FM2-10)的細胞外液中，OS的檢測厚度是2.5μm。右圖顯示的掃描圖像的從1到k(即從t1到tk)，這段顯示的是給予配體前的記錄，即背景記錄。掃描圖像從K+1到m(即時間從tk+1到tm)，這段顯示細胞給予含有配體(ADP)的細胞外液后的記錄。這些圖像提供的信息可以推測配體與受體結合后的效應。
圖7B顯示在單個DRG神經元上從t＝tk(對照)和t＝tm(ADP)的記錄。對照圖像是即將給予配體(ADP)前的記錄，而“ADP”圖像是給予ADP一段時間后的記錄。該結果證實給予配體結合后引起細胞內熒光亮點數(內吞囊泡)明顯地增加。
圖7C顯示的是一典型的時間變化過程，FM強度的變化是與時間相關的。熒光強度的大小代表內吞囊泡總數的多少。圖7D顯示21次實驗時間變化的平均值。這些結果清楚地顯示了給予ADP能夠顯著性地增加細胞內熒光強度(即內吞囊泡數)。也可以明顯地觀察到配體-受體結合引起的內吞發生的時間需要數秒。因此，FIF記錄的采樣率可以用1Hz或稍低一點。這些結果顯示本發明的上述方法可以實時監測配體-受體結合引起的內吞。
不同的FEI標記 以上實例顯示細胞內吞囊泡空間分布的圖像足以適用于觀察不同位置的囊泡。例如，用于探測囊泡在細胞內的去向。現已知道GPCR通過激活載體產生囊泡內吞，并且每種不同的GPCR囊泡可以有其自身特異的裝載途徑。在同一細胞上將囊泡用不同的顏色的FM染料標記可以在不同條件下(如時間、配體不同等)分別觀察它們不同的裝載通路。
圖8A顯示的是用兩種不同的染料標記的細胞。如左圖所示，細胞先用含有ADP和FM2-10(綠色熒光)的細胞外液孵育，然后染料和ADP漂洗后再用含有5-HT和FM4-64(紅色熒光)的細胞外液孵育，再將染料和5-HT漂洗，最后在共聚焦顯微鏡下觀察，如右圖所示。FM2-10和FM4-64都可被488nm激光激發，FM2-10的發射光在530-600nm內可被檢測，而FM4-64的發射光＞635nm可被檢測。
參見圖8B，ADP和5-HT引起的內吞囊泡能夠被紅色的FM4-64和綠色的FM2-10分別被標記。這兩種內吞囊泡數也很接近(圖8D)，可以肯定，在DRG神經元上ADP和5-HT相應的受體數目相近(見圖6B)。FM疊加圖顯示大多數綠色和紅色FM亮點在整個胞漿中是分散分布的，暗示ADP引起的內吞囊泡和5-HT引起的內吞囊泡的裝載途徑是不同的。
為了驗證ADP引起的內吞囊泡和5-HT引起的內吞囊泡是否有裝載的共性。用80mM KCl處理細胞3分鐘，如圖8C所示，囊泡數量明顯地減少了。圖8E統計結果顯示大約43％的紅色/P2Y內吞囊泡和大約37％的綠色/5-羥色胺受體被排出。這一結果暗示ADP和5-HT引起的內吞囊泡大約有40％有一共同的裝載途徑，即將它們運送到預釋放池(readily releasable vesicle pool，RRP)中，這種RRP內的囊泡可因隨后的動作電位排出細胞。
藥物的高通量篩選方法 以上的描述已經清楚的闡明了本發明的方法能夠提供研究配體-受體結合引起內吞的靈敏度、時間和空間分辯圖像。因為在治療性藥物當中，細胞膜受體經常被作為作用靶點，本發明的方法對篩選針對特定受體的藥物具有很好的實用性。
高通量篩選(HTS)已經成為藥物開發中鑒定藥物潛在先導分子能否作用于特定疾病靶點的關鍵一環。成功的篩選由下列幾個因素衡量，其中包括通量和成本，但是最終要看有多少高通量篩選的陽性物能通過藥物發現的過程檢驗。通過使用96孔到384孔再到536孔板可將分析試驗微型化，然后利用自動化裝置實現提高效率和減少篩選成本。
在單個細胞上能夠快速檢測內吞囊泡的方法，使FEI技術作為快速藥物/配體生物分析成為可能。因為FEI是一種光學分析方法，所以可適用于自動化控制的針對有配體-受體結合引起的內吞現象的受體的治療性藥物的高通量篩選，并且這一方法非常。
多孔程序舉例 圖9A-8B顯示本發明的一種方法，即使用多孔板(2*2孔板)進行高通量篩選配體-受體結合引起的內吞效應。多孔板孔底是0.17mm厚的玻璃，其它與標準細胞培養板相同。本例中，單個DRG細胞被接種在玻璃底壁上。
如圖9A所示，四個孔中分別用不同的試劑進行處理。孔(1，1)是用含FM的細胞外液孵育；孔(1，2)是用含FM和80mM KCl細胞外液孵育；孔(2，1)是用含FM和ADP的細胞外液孵育；孔(2，2)是用含FM、蘇拉明和ADP的細胞外液孵育。每孔的孵育時間都是3分鐘。
每孔按順序掃描后得到圖像在圖9B顯示，內吞信號(FM亮點/細胞)的分析統計結果用柱狀圖在圖9C顯示。在圖9B中，四欄圖像代表的是四個不同的孔的細胞，也就是四種不同的處理方式。在每一欄的頂端圖像是可見光圖像，顯示細胞在孔中的狀況。方框內的細胞是用于圖像分析的細胞。
被選中的細胞進行單層OS成像(中間圖像)和全細胞成像(底層圖像)(圖9B)。圖9C顯示的是孔內配體-受體結合的熒光亮點(內吞囊泡)數的柱狀統計結果圖。從統計結果可以看出ADP可以明顯地引起內吞，此內吞可以被蘇拉明(特異性的酪氨酸磷酸酯酶抑制劑)阻抑。
雖然以上只介紹了4孔板的人工操作，但是本領域中的技術人員可以理解這種技術可能在任何多孔板(96孔甚至更多)上應用。再者，結合電子定位系統進行同步定位、細胞移植、配體添加/漂洗、FM成像和/或FM分析等，可以使部分或全部的配體/藥物篩選程序實現自動化。將表達有所需受體的(如GPCR或RTK)的細胞系細胞種植于多孔板內，可以檢測多種不同化學制劑在各孔內的效應。在一些孔內，配體若能夠產生大量的FM亮點(即內吞囊泡)則說明配體對受體是有作用的。
上述自動化系統是本發明提供的實施系統的一些具體體現。這些系統從最近的儀器制造學的發展中吸取優點。參見Taylor等.，美國科學家，80322-335(1992)，提出了許多方法和它們的應用。例如，Proffitt等，(Cytometry24204-213(1996))，描述了半自動化熒光數字式成像系統應用于各種組織培養平板的原位定量法細胞計數，其中包括了96孔微滴定量盤。并且，美國專利6,875,578號，申請人Giuliano等發現了基于熒光系統的個別細胞分析技術。
與本發明具體化相一致，一套系統需要有共聚焦顯微鏡(或其它合適的顯微鏡)配置有機動載物臺、視頻照相機、計算機和相應的軟件等組成。計算機和軟件控制用于機動載物臺、掃描標本和產生圖像等。另外，軟件能夠進行圖像分析和計算各種的熒光值。該系統的機動載物臺可適用于各種組織培養平板的配置，比如通常用的96孔板。
另外，本發明的系統還可包括液體流動自動控制/輸送系統。有許多商品化的系統都適用，例如前面描述過的MPS-2給藥系統。
與本發明的具體化相一致，圖10顯示的是細胞篩選系統100的示意圖。如圖所示，篩選系統100由熒光成像系統101，包括顯微鏡、XY方向載物平臺104能夠夾持培養皿105以及能夠將培養皿進行定位移動并調節培養皿的位置以便聚焦)；成像設備103(比如數碼相機)；光源102可定向產生視覺效應的可見光和激發熒光的發射光以及將熒光導向成像設備(相機)；計算機系統106從相機103接收和處理數字化數據，包括顯示和輸入設備，(比如鍵盤、鼠標等)。計算機系統106可進一步包括數字存儲和文件存檔以及結果的對照、獲取、處理和顯示的方法。應該要指出的是其中有些功能(比如數據的存儲或分析)可在不同的計算機上完成。另外，細胞掃描系統100可以包括微量給藥系統107用于向培養皿添加試劑或從培養皿中移走溶液。
如圖10所示的例子中，顯微鏡系統101是倒置的。任何具有相似功能的顯微鏡都可以適用，比如蔡司倒置熒光顯微鏡。光源102，例如，100瓦汞弧燈或75瓦氙氣燈。XY方向平臺104是用于移動培養皿105，使培養皿在顯微鏡物鏡上方進行XY方向移動。成像裝置103相當于高辨率的數碼相機。
應該指出的是，高通量“整盤”檢讀系統已是眾所周知的，并通常用于高通量篩選系統進行大批量的篩選。參見Beggs，J.of Biomolec.Screening271-78(1997)和Macaffrey等，J.Biomolec.Screening 1187-190(1996)。然而，細胞篩選系統，與本發明具體化相一致，是對單個孔中單個細胞的進行成像。一種本發明的系統能夠提供空間分辨率，而“整盤”檢讀系統則不可能做到。
一種本發明的系統提供便捷的方法用于高通量篩選配體-受體結合，能夠顯著性地提高藥物篩選效率。如上所述，本發明的方法能夠提供高度的空間和時間分辨率來監測受體與配體結合后產生的內在化。這種性能使得檢測藥物對于復雜的分子活動和細胞功能提供了可能，比如觀察信號轉導通路，細胞凋亡、細胞分化、細胞黏附、移動、胞吐和細胞間的信號交流等。另外，應用多顏色熒光，在一次篩選中可能對多靶點及多種細胞活動進行分析處理。細胞各種反應間的相互關系有可能成為評估靶點及優化先導物的極其有用的信息。
本發明的具體化包括下面一個或更多的優點。本發明的方法提供一種便捷的光學生物分析方式用于篩選能夠與細胞膜上眾多的受體結合的配體。這些方法通常可應用于任何能夠在與配體結合后產生內吞的受體。這些方法能夠應用于針對與配體結合后產生內吞的受體進行的高通量藥物篩選。許多這樣的受體已經被發現參與某種疾病的發生。本發明的具體化同時也提供了一種可用于藥物高通量篩選的自動化篩選系統。
雖然本發明被描述成有限的幾個具體方面，本領域的技術人員可從其公開中受益，并且正確評價其他的可能被設計的并不脫離在這里公開的本發明的具體化。因此，本發明的范圍應該僅被附屬的權利要求書所限制。
權利要求
1.一種檢測與細胞膜受體結合的配體的方法，其特征在于，包括以下步驟用染料和配體對細胞進行孵育；和在細胞中檢測含有染料的內吞囊泡。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括在孵育后、檢測前漂洗細胞，從而去除細胞外染料。
3.如權利要求1和2中任一權利要求所述的方法，其中所述的染料為熒光染料。
4.如權利要求1至3中任一權利要求所述的方法，所述的細胞膜受體是G蛋白偶聯受體或酪氨酸激酶受體家族中的一種。
5.如權利要求1至4中任一權利要求所述的方法，其特征在于使用顯微鏡進行檢測。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的顯微鏡是共聚焦顯微鏡。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，在一張或多張光學圖片中進行檢測。
8.如權利要求3至7中任一權利要求所述的方法，其特征在于，該方法進一步包括獲得一個或多個細胞內含染料的內吞囊泡的圖像的步驟。
9.如權利要求3至8中任一權利要求所述的方法，其特征在于，該方法進一步包括對細胞內含染料內吞囊泡進行定量的步驟。
10.如權利要求1至9中任一權利要求所述的方法，其特征在于，該方法進一步檢測步驟以時間為可變因素進行。
11.如權利要求1至10中任一權利要求所述的方法，其特征在于，在一個多孔板的單個孔中操作此法。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的各步驟程序由自動裝置操作。
13.如權利要求2所述的方法，其特征在于，該方法還進一步包括下列步驟漂洗細胞后，用第二種染料和第二種配體孵育細胞；和于檢測前，漂洗細胞以去除細胞外的第二種染料和第二種配體。
14.一種篩選與細胞膜結合的配體的系統，其特征在于，包括自動液體操作裝置；x-y方向載物臺；觀察單個細胞內吞囊泡成像的顯微鏡配置；和控制x-y載物平臺和顯微鏡移動的控制裝置。
15.如權利要求14所述的系統，其所述的控制裝置還包括用于分析內吞囊泡的軟件。
16.如權利要求14和15中任一權利要求所述的系統，其特征在于，所述的顯微鏡是共聚焦顯微鏡。
17.如權利要求14至16中任一權利要求所述的系統，其特征在于，所述的培養皿是多孔板。
全文摘要
本發明涉及篩選配體與細胞膜受體結合并產生內吞的方法和系統。檢測配體與細胞膜受體結合的方法，包括用染料和配體孵育細胞和檢測細胞中含染料的內吞囊泡。篩選與細胞膜受體結合的配體的系統包括自動液體控制裝置、x－y控制載物平臺、單個細胞的內吞囊泡成像的顯微鏡裝置、自動分析FM亮點(內吞囊泡)軟件以及控制x－y載物平臺和顯微鏡移動的控制裝置。
文檔編號G01N33/50GK101063657SQ20061002624
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月29日 優先權日2006年4月29日
發明者周專, 程和平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 北京大學