專利名稱：環境砷污染的生物標記監測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種環保技術的方法，具體是一種環境砷污染的生物標記監測方法，即利用細胞色素P450作為生物標記物來監測養豬場周圍環境中和使用過豬糞肥的土壤環境中砷污染的方法。
背景技術：
砷是動物體必需的一種微量元素，具有多種重要作用。近年來砷制劑已成為世界各國廣泛使用的飼料添加藥物，促進了畜牧業的發展，取得了較好的社會經濟效益。但同時大量含砷的畜禽排泄物進入環境，對環境造成了污染。其污染對象主要是養殖場周圍環境和使用過豬糞肥的土壤環境。對于環境砷污染的監測，目前主要還是化學測定法，即通過檢測土壤中砷的含量來了解砷污染狀況。但是化學測定法有其缺陷性，僅憑含量無法反應這些污染物的生物效應。生物標記監測法則可以彌補其不足，不僅可以反應土壤污染狀況，還可以反應生物的適應性，以及污染物在分子水平上的毒性效應；等等。
生物標記物(也稱生物標志物)是近年來興起的一種較新的環境監測方法，細胞色素P450(CYP450)是其中應用最廣泛的一種。細胞色素P450酶系是廣泛存在于各種動物、植物、和微生物等不同生物體內的一類代謝酶系，具有極其重要的生理功能。用P450酶系的誘導或抑制作用，可以作為分子水平上敏感的生物標記物，來監測污染物對土壤生態系統的影響。目前有大量關于P450用作工業污染物如多氯聯苯，多環芳烴以及重金屬等環境污染的生物標志物的研究報道，但尚未見其用于土壤砷污染的研究。7-甲氧基-3-異吩噁唑酮-O-脫芐基酶(MROD)是CYP450酶系中的一種，即CYP4501A2。經研究發現蚯蚓體內該酶對土壤砷污染較敏感，而且在一定范圍內該酶被抑制的程度與土壤砷含量具有相關性。可以用該酶的活性變化程度來監測土壤砷污染。
經對現有技術的查新，尚未發現與本發明主題砷污染的生物標記監測方法相同或者類似的文獻報道。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種環境砷污染的生物標記監測方法，使其可以監測含砷的豬排泄物進入養豬場周圍環境，或者施用于農田土壤而作為肥料后，引起的土壤砷污染。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明首先根據要監測的地點，設計土壤采樣方案；然后在各個采樣點采集蚯蚓，將其裝入含有采樣地土壤的容器中；取采得的蚯蚓，先進行清腸，然后勻漿，離心，得上清液即為所需的含P450的提取液；在熒光分光光度計中測定MROD的活性；根據MROD活性計算土壤總砷含量，從而監測土壤的砷污染程度。
所述的首先根據要監測的地點，設計土壤采樣方案，具體為首先要了解監測地點的背景資料，確定污染來源與養殖場的液體排放或糞便施肥情況。前者可以先了解排出含砷制劑殘留的污染源距監測點的距離，后者可以先了解監測點施肥的方案。然后確定采樣的具體方法當污染為點源污染時，可在沿污染方向的不同距離布置采樣點；當污染為面源污染時，可均勻布置采樣點。
所述的采集蚯蚓，具體為先采集采樣點的土壤，裝入容器中；然后將采出的蚯蚓放入該容器中，帶回實驗室，以保證蚯蚓的生活環境不發生變化，實驗結果更具可靠性。
所述的含P450的提取液，其具體制備為將容器中的蚯蚓取出，放在濕濾紙上，在室溫下放置1至2天，以排出腸內容物；取清腸后的蚯蚓，用濾紙吸干水分，置于玻璃勻漿器中，倒入在4℃冰箱中預冷的蚯蚓勻漿緩沖液，勻漿；將勻漿液轉移入1.5ml離心管中，離心30min。棄去沉淀，上清液即為所需的含P450的提取液。
所述的測定MROD的活性，具體為在熒光比色杯中加入各反應成分，濃度分別為三羥甲基氨基甲烷(Tris)100mmol/L，煙酰胺二核苷酸磷酸(NADPH)0.5mmol/L，7-甲氧基異吩噁唑酮約10μmol/L，約0.5mg蛋白的含P450的樣品提取液。反應時NADPH最后加入，加入后反應立即開始。準確進行10min后，加入0.5ml甲醇中止反應，將比色杯放入熒光比色池內，在激發波長Ex為581nm，發射波長Em為593nm條件下測定相對熒光強度。用標準曲線定量。
所述的根據MROD活性計算土壤總砷含量，具體為首先建立土壤砷含量與MROD活性的關系式，此后即可根據酶活性，計算土壤砷含量，從而監測土壤的砷污染程度。
本發明通過蚯蚓體內MROD活性的測定來監測土壤砷污染狀況，既可了解土壤砷污染程度，又可以了解砷污染的生化效應，以及生物體對砷污染的反應。比直接測定土壤砷含量更具有實用價值，而且靈敏度高，適于長期監測。
圖1為本發明方法流程圖具體實施方式
如圖1所示，本發明實施例實施步驟如下1.首先了解監測地點的背景資料，確定污染來源與養殖場的液體排放或糞便施肥情況。然后確定采樣的具體方法。
2.先采集采樣點的土壤，裝入容器中；然后將采出的蚯蚓放入該容器中，帶回實驗室。
3.將容器中的蚯蚓取出，放在濕濾紙上，在室溫下放置1至2天，以排出腸內容物；取清腸后的蚯蚓，用濾紙吸干水分，置于玻璃勻漿器中，倒入在4℃冰箱中預冷的蚯蚓勻漿緩沖液，勻漿；將勻漿液轉移入1.5ml離心管中，離心30min。棄去沉淀，上清液即為所需的含P450的提取液。
4.在熒光比色杯中加入各反應成分，使各種反應物的濃度分別達到Tris100mmol/L，NADPH 0.5mmol/L，7-甲氧基異吩噁唑酮約10μmol/L，約0.5mg蛋白的含P450的樣品提取液。反應時NADPH最后加入，加入后反應立即開始。準確進行10min后，加入0.5ml甲醇中止反應，將比色杯放入熒光比色池內，在激發波長Ex為581nm，發射波長Em為593nm條件下測定相對熒光強度。用標準曲線定量。
5.首先建立土壤砷含量與MROD活性的關系式，此后即可根據酶活性，計算土壤砷含量，從而監測土壤的砷污染程度。
以下結合本發明內容提供實施例，以某養豬場周圍長期施用含砷制劑殘留的豬糞肥的菜地為例，監測其中的砷污染狀況。
菜地常年種植蔬菜，供豬場員工食用。該豬場的飼料中含有砷添加劑，菜地以豬糞作肥料。根據菜地的大約為正方形的形狀，設計了中心1個點，周圍4個點共5個采樣點。采集其中的蚯蚓(為白頸環毛蚓)。帶回實驗室測定其體內MROD的活性。此前在實驗室以相同質地未污染土壤，進行人工污染實驗，建立土壤總砷含量和蚯蚓體內MROD活性的關系式A蚓＝-0.038C土+10.37其中C土為土壤總砷含量，A蚓為蚯蚓體內MROD的活性，該式適用于C土在20mg/kg～200mg/kg的范圍內。菜地樣品蚯蚓體內此酶活性的平均值為9.24±0.85p mol/mgprotein.min(未受污染土壤中蚯蚓體內該酶的活性為48.63±1.11p mol/mgprotein.min)，則土壤總砷含量為28.74mg/kg.而遠離豬場的未受洛克沙胂污染的土壤中總砷含量為8.75mg/kg，說明菜地土壤受到了高于原來自身含量3至4倍的砷污染。此結果同時表明，在砷污染的脅迫下，蚯蚓體內的P450酶受到了抑制，抑制率達81％。這有可能導致蚯蚓對其他物質代謝的改變。用該方法進行長期監測比較靈敏。
權利要求
1.一種環境砷污染的生物標記監測方法，其特征在于首先根據要監測的地點，設計上壤采樣方案；然后在各個采樣點采集蚯蚓，將其裝入含有采樣地上壤的容器中；取采得的蚯蚓，先進行清腸，然后勻漿，離心，得上清液即為所需的含P450的提取液；在熒光分光光度計中測定7-甲氧基-3-異吩噁唑酮-O-脫芐基酶的活性；根據其活性計算土壤總砷含量，從而監測土壤的砷污染程度。
2.根據權利要求1所述的環境砷污染的生物標記監測方法，其特征是，所述的根據要監測的地點，設計土壤采樣方案，具體為首先了解監測地點的背景資料，確定污染來源與養殖場的液體排放或糞便施肥情況，然后確定采樣的具體方法當污染為點源污染時，在沿污染方向的不同距離布置采樣點；當污染為面源污染時，均勻布置采樣點。
3.根據權利要求1所述的環境砷污染的生物標記監測方法，其特征是，所述的含P450的提取液，其制備為將容器中的蚯蚓取出，放在濕濾紙上，在室溫下放置1至2天，以排出腸內容物；取清腸后的蚯蚓，用濾紙吸干水分，置于玻璃勻漿器中，倒入在4℃冰箱中預冷的蚯蚓勻漿緩沖液，勻漿；將勻漿液轉移入1.5ml離心管中，離心30min，棄去沉淀，上清液即含P450的提取液。
4.根據權利要求1所述的環境砷污染的生物標記監測方法，其特征是，所述的測定MROD的活性，具體為在熒光比色杯中加入各反應成分，濃度分別為Tris 100mmol/L，NADPH 0.5mmol/L，7-甲氧基異吩噁唑酮10μmol/L，0.5mg蛋白的含P450的樣品提取液，反應時NADPH最后加入，加入后反應立即開始；準確進行10min后，加入0.5ml甲醇中止反應，將比色杯放入熒光比色池內，在激發波長Ex為581nm，發射波長Em為593nm條件下測定相對熒光強度，用標準曲線定量。
5.根據權利要求1所述的環境砷污染的生物標記監測方法，其特征是，所述的根據MROD活性計算土壤總砷含量，具體為首先建立土壤砷含量與MROD活性的關系式，再根據酶活性計算土壤砷含量，從而監測土壤的砷污染程度。
全文摘要
一種環保技術領域的環境砷污染的生物標記監測方法。本發明首先根據要監測的地點，設計土壤采樣方案；然后在各個采樣點采集蚯蚓，將其裝入含有采樣地土壤的容器中；取采得的蚯蚓，先進行清腸，然后勻漿，離心，得上清液即為所需的含P450的提取液；在熒光分光光度計中測定7－甲氧基－3－異吩噁唑酮－O－脫芐基酶的活性；根據其活性計算土壤總砷含量，從而監測土壤的砷污染程度。本發明既可了解土壤砷污染的程度，又可以了解砷污染的生化效應，以及生物體對砷污染的反應。比直接測定土壤砷含量更具有實用價值。而且靈敏度高，適于長期監測。
文檔編號G01N21/64GK1834645SQ20061002587
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月20日 優先權日2006年4月20日
發明者李銀生, 邱江平, 陳曉斌, 曾振靈, 陳杖榴 申請人:上海交通大學