專利名稱：免疫結合直接法或免疫沉淀分離法測定脂蛋白殘粒中膽固醇濃度的制作方法
技術領域：
本發明涉及測定血清或血漿中脂蛋白殘粒(RLP)濃度的方法，具體的涉及采用免疫結合直接法或免疫沉淀分離法來測定血清或血漿中脂蛋白殘粒(RLP)濃度，作為臨床判斷動脈粥樣硬化性疾病和冠心病以及與動脈粥樣硬化性有關的代謝性疾病程度及療效評估、預后判斷的參考依據。
背景技術：
脂蛋白殘粒(remnant lipoprotein，RLP)又稱富含甘油三酯(triglyceride，TG)脂蛋白殘粒(TRL)，是乳糜微粒(chylomicron，CM)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)經脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)水解逐漸失去甘油三酯、磷脂、載脂蛋白A(apoprotein A，apoA)和apoC后，轉變成的富含膽固醇、膽固醇脂和apoE的較小顆粒。
近年來，隨著對脂蛋白殘粒的深入了解，RLP測定的臨床意義日趨受重視。大量研究表明，RLP濃度在動脈粥樣硬化性疾病及動脈粥樣硬化相關的疾病(如2型糖尿病、III型高脂血癥和慢性腎功能衰竭及肥胖患者)中顯著增加。另外，從人動脈粥樣斑塊中分離的脂蛋白在結構上與富含TG脂蛋白殘粒相似。因此，血漿脂蛋白殘粒膽固醇(RLP-C)水平升高是動脈粥樣硬化性疾病和冠心病(coronary heart disease，CHD)以及與動脈粥樣硬化性有關的代謝性疾病的重要危險因素。所以，準確、快速測定RLP非常重要。
然而，現有技術中測定RLP的傳統方法多用超速離心法和凝膠電泳法。脂蛋白殘粒是一組在大小、密度、電泳遷移率、化學組成及受體識別等方面呈高度異質性的顆粒，現有的分離方法主要是根據其不同的物理和化學特征來測定脂蛋白殘粒。超速離心是脂蛋白分離的參考方法，先前常用LDL(1.006<d>11.009kg/L或Sv12~20)反映殘粒狀態，后來有學者提出Sv12~60的脂蛋白反映殘粒狀態比Sv12~20的脂蛋白好，但是在此范圍的脂蛋白包括LDL(1.006<d>11.009kg/L或Sv12~20)和介于d＜1.006kg/L組分中的小VLDL顆粒，因此，此法并不能作為分離脂蛋白殘粒的參考方法；而聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)法根據分子大小來分離脂蛋白，用LDL來反映脂蛋白殘粒狀態，包括大小在VLDL和LDL的任何脂蛋白顆粒。但是，此兩種方法因需特殊儀器，費時或操作繁瑣，均難于在普通實驗室開展。
因此，需要一種簡單、廉價、快速的檢測血清或血漿中脂蛋白殘粒膽固醇的方法。
發明內容
本發明滿足了上述要求，提供了兩種快速準確檢測血清或血漿中脂蛋白殘粒的方法。具體地，本發明采用免疫結合直接法或免疫沉淀分離法分離脂蛋白殘粒，從而快速準確地檢測血清或血漿中脂蛋白殘粒。
本發明的檢測方法包括a)將試劑I與樣品混合，以使試劑I中的抗體與樣品充分反應；b)用本領域公知的方法檢測所得溶液中的膽固醇濃度，即為脂蛋白殘粒濃度其中，該試劑I包括ApoB100抗體、ApoA I抗體，以及任選的促進劑、TRIS-HCL緩沖液、膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和過氧化物酶。樣品是血清或血漿。
任選地，在步驟b)之前，可以對待檢測血清或血漿加ApoB100、ApoA I抗體，包括多克隆抗體和/或單克隆抗體充分反應后進行離心，取上清液。
公知地，ApoB100抗體含有ApoB48和ApoB52兩個亞基，因此，ApoB48抗體或ApoB52抗體也可以用于本發明或代替ApoB100來實施本發明。
特別地，本發明提供了兩種用于分離脂蛋白殘粒的方法，以快速準確地檢測血清或血漿中脂蛋白殘粒，該方法包括方法一將試劑I直接與樣品混合，任選反應時間，加入試劑II。用膽固醇酶法測定樣品中膽固醇濃度，即為脂蛋白殘粒濃度。方法二樣品經離心分離后，將試劑I與離心后的上清液混合，任選反應時間，加入試劑II。用膽固醇酶法測定樣品中膽固醇濃度，即為脂蛋白殘粒濃度。
本發明的檢測方法能快速準確地檢測血清或血漿中脂蛋白殘粒，作為臨床判斷動脈粥樣硬化性疾病和冠心病以及與動脈粥樣硬化性有關的代謝性疾病程度及療效評估、預后判斷的參考依據。
因此，本發明的一方面，提供了分離脂蛋白殘粒的方法，其特征在于采用了免疫分離方法。本發明的另一方面，提供了一種用于分離脂蛋白殘粒的免疫結合直接方法，該方法包括將一定量試劑I與檢測的樣品混合，混勻并反應完全后進行測定。
在上述方法中，所述試劑I含有ApoB100抗體與ApoA I抗體。所述樣品是血清或血漿，更進一步地是人血清或血漿。如上所述，可以用ApoB48和/或ApoB52來代替ApoB100或與ApoB100一起來實施本發明。
試劑I中的抗體的是用來結合血清或血漿樣品中的相應抗原，因此，可以理解，這些抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。在一些優選具體實施方案中，所述抗體是兔或羊抗人多克隆抗體或單克隆抗體。
因此，本發明提供了兩種分離脂蛋白殘粒的方法，方法一將一定量的含有兔或羊抗人ApoB100多克隆抗體或單克隆抗體、兔或羊抗人ApoA I多克隆抗體或單克隆抗體的試劑I與待檢測的樣品混合，混勻后在37℃中放置5-10分鐘，讓ApoB100、ApoA I抗體和相應抗原充分結合；方法二將樣品與抗體完全反應后進行離心。其中，該樣品是血清或血漿，離心是以4000轉/分離心。
可選擇地，上述試劑I還含有促進劑。可選擇地，該促進劑是聚乙二醇500-20000，優選聚乙二醇6000。
一般地，加入的試劑I的量根據所測樣品量不同而不同。在一些具體實施方案中，加入的試劑I的量足以去除樣品中所有的ApoB100抗原與ApoA I抗原。本領域的普通技術人員可以用各種公知的方法檢測樣品中的抗原是否被完全結合。另外，向本發明的方法中加入促進劑可以促進混合物反應的快速進行，一般地，其所加入的量為使所述反應在可控范圍內的任何量，在一些具體實施方案中，用ApoB48和/或52代替ApoB100，加入的促進劑的量為0.5-4.0g/L；優選地為2.0g/L。
因此，本發明的另一方面，提供了一種快速分離脂蛋白殘粒的免疫結合直接法，該方法包括將足量含有ApoB100抗體、ApoAI抗體和促進劑的試劑I與檢測的樣品混合，混勻后在37℃中放置5-10分鐘，讓ApoB100、ApoA I抗原和抗體充分結合；反應完全后進行測定。其中，該樣品是血清或血漿，該促進劑是聚乙二醇6000。ApoB100抗體選自兔或羊抗人ApoB100多克隆抗體或單克隆抗體，ApoA I抗體選自兔或羊抗人ApoA I多克隆抗體或單克隆抗體，這些抗體可以用常規免疫方法獲得(1、童明慶，孫南雄，主譯.實用免疫化學.南京南京出版社，1990.42-59.2、陶義訓，主編.免疫學和免疫學檢驗.第二版.北京人民衛生出版社，1997.96-116.3、梁國棟，主編.最新分子生物學實驗技術.北京科學出版社，2001.62-100.)。
更進一步地，上述試劑I還含有Tris-HCL緩沖液、膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和過氧化物酶。在一具體實施方案中，試劑I中的Tris-HCL緩沖液的濃度為40-60mmol/L；膽固醇酯酶的濃度為45-75U/L；膽固醇氧化酶的濃度為45-75U/L；過氧化物酶的濃度為＞150U/L，優選為150U/L-250U/L。在另一優選具體實施方案中，試劑I中的Tris-HCL緩沖液的濃度為50mmol/L，膽固醇酯酶的濃度為60U/L，膽固醇氧化酶的濃度為60U/L，過氧化物酶的濃度為150mmol/L。
在上述方法中，將試劑I與樣品混勻，去除了樣品中含ApoB100的幾乎所有的低密度脂蛋白(LDL)和多數VLDL及含ApoA I的幾乎所有的高密度脂蛋白(HDL)，剩下的是未結合的部分，主要是CM殘粒和較小的VLDL殘粒，總稱RLP。經測定，上清液中是該未結合的CM殘粒和較小的VLDL殘粒，即RLP。
RLP的濃度主要是依據脂蛋白殘粒表面和載脂蛋白來分離測定。因此，本發明的另一方面，還提供了兩種測定脂蛋白殘粒膽固醇(RLP-C)的方法，該方法包括用膽固醇酶法測定上述未結合的CM殘粒和較小的VLDL殘粒部分的膽固醇的濃度，該濃度即是RLP的濃度。
所述的膽固醇酶法測定是本領域公知的，如化學法包括抽提法和直接測定法。化學測定法種類多，由于顯色反應的特異性不同，其結果有一定的差異。目前公認的參考方法是Abell-Kendall(L-B反應)法和三氯化鐵-硫酸反應法(Zak法)，其中Zak法具有顯色穩定法、操作簡便、靈敏度約5倍于L-B反應法。另外，另一種公知的膽固醇檢測方法是酶法測定，該方法敏感特異快速，并能自動化分析，已被廣泛采用，國產試劑已能滿足臨床的需要。膽固醇測定用的標準品，按美國國家標準局(NBS)出品純度達99.8％，是國際公認的參考物，國內李健齋等已純化制成符合這一要求的膽固醇純品，已供臨床檢測血清膽固醇使用。
優選地，本發明采用酶法測定法來檢測膽固醇的濃度。其反應原理是膽固醇酯在脂蛋白酯酶的作用下水結成膽固醇和脂肪酸，膽固醇再經膽固醇氧化酶氧化成膽甾-4-烯-3-酮和H2O2，分別定量氧氣的消耗或者H2O2的生成量，或者膽甾-4-烯-3-酮的生成量，作為膽固醇的定量依據。特定地，本發明采用Allain等的方法(Nakajima K，Saito T，Tamura A，et al.Cholesterol in Remnant-like lipoproteins in human serum usingmonoclonal anti apo B-100 and anti apo A-I immunoaffinity mixed gels.Clin Chim Acta，1993，223(1-2)53-71.)，該方法是基于如下反應
其中，LPL是膽固醇酯酶，CO是膽固醇氧化酶，POD是過氧化物酶。
上述反應生成的醌亞胺色素為紅色，其與樣品中的膽固醇濃度成正比，可在505-550nm波長出進行吸收光度測定，從而計算出膽固醇的濃度。
明顯地，為了測定樣品中的脂蛋白殘粒的濃度，必須向用上述分離方法分離的RLP部分(或離心后的上清液)中加入試劑II，該試劑II含有過氧化物酶和4-氨基安替比林。可選擇地，在試劑I不含膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的情況下，試劑II還含有含膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
在一些具體實施方案中，試劑II中的過氧化物酶的濃度為≥150U/L，4-氨基安替比林的濃度為0.05-0.20mmol/L。在優選的具體實施方案中，試劑II中的過氧化物酶的濃度為150U/L，4-氨基安替比林的濃度為0.06mmol/L。
因此，本發明提供了兩種測定血清或血漿樣品中的RLP的方法，該方法包括a)將試劑I與樣品混合，以使試劑I中的抗體與樣品充分反應；b)用本領域公知的方法檢測所得溶液中的膽固醇濃度。
任選地，在進行步驟b)之前，可以將待檢測血清或血漿與試劑I充分反應后的混合物離心，取血清或血漿上清液。
因此，更具體地，本發明提供了兩種測定血清或血漿樣品中的脂蛋白殘粒的方法，該方法包括a)取一定量的ApoB100抗體與ApoA I抗體，任選的促進劑，任選的TRIS-HCL緩沖液，任選的膽固醇酯酶，任選的膽固醇氧化酶和任選的過氧化物酶混合液與待檢樣品混合，混勻后在37℃中放置5-10分鐘，以使ApoB100、ApoA I抗原和抗體充分結合；b)任選地，取一定量的ApoB100抗體、ApoA I抗體、任選的促進劑與待檢樣品混合，混勻后在37℃中放置30分鐘后，用4000轉/分離心10分種，取上清液；c)用膽固醇酶法試劑測定所得溶液中的膽固醇濃度。
更具體地，上述方法的步驟c)包括向上清液中加入試劑II，該試劑II含有過氧化物酶、4-氨基安替比林和任選的膽固醇酯酶和任選的膽固醇氧化酶；反應完全后，在505-550nm處進行吸收光度測定，從而計算出膽固醇的濃度。
實驗表明，用免疫結合直接法或免疫沉淀分離法分離的脂蛋白殘粒的量能夠代表TRL中潛在致動脈粥樣硬化的脂蛋白，同時RLP也顯示具有致動脈粥樣硬化脂蛋白殘粒的生物學特征，即抑制內皮依賴性血管舒張、增強血小板聚集和不經修飾可被巨噬細胞攝取等。另外，本發明的方法可以直接在樣品溶液中進行，而省去離心等步驟，從而簡化了步驟，利于操作。
具體實施例方式
實施例1 用免疫結合直接法檢測RLP使用試劑I和試劑II，試劑I含有50mmol/L Tris-HDL緩沖液、60U/L膽固醇脂酶、60U/L膽固醇氧化酶、150mmol/L過氧化物酶、2g/L聚乙二醇6000、11.3mL兔抗人ApoB100抗血清、7.5mL兔抗人ApoA I抗血清，試劑II含有150mmol/L過氧化物酶、0.06mmol/L 4-氨基安替比林和50mmol/L Tris-HDL緩沖液。將試劑I和II的各組分按照其組分含量加入到緩沖液中，混勻，過濾掉沉淀，將所得到的溶液在4℃下保存備用。
從受試個體中取出24uL血清或血漿，將225uL試劑I加入到血清或血漿中，混合均勻，37℃下放置5分鐘。讓ApoB100、ApoA I抗原與抗體充分結合。在722型分光光度計上，用505nm波長，1cm光徑比色皿，以蒸餾水校零，測定其吸光度值A1。
隨后，再向其中加入75uL試劑II，37℃保溫5分鐘，在722型分光光度計上，用505nm波長，1cm光徑比色皿，以蒸餾水校零，測定其吸光度值A2。
以已知濃度c.f.a.s.膽固醇校準品為校準液，取24uL按照上述相同的步驟得到光吸收值A1’和A2’。
根據公式膽固醇濃度(mmol/L)＝(A2-A1)/A2’-A1’)×校準液濃度(mmol/L)。
實施例2 用免疫沉淀分離法檢測RLP使用113uL兔抗人ApoB100抗血清、71uL兔抗人ApoA I抗血清與30uL血清或血漿放置在室溫或37℃混勻30分鐘，4000轉/分離心取上清液，將所得到的上清液保存備用。
取出24uL上清液，將225uL試劑I加入到上清液中，混合均勻，37℃下放置5分鐘。在722型分光光度計上，用505nm波長，1cm光徑比色皿，以蒸餾水校零，測定其吸光度值A1。
隨后，向其中加入75uL試劑II，37℃保溫5分鐘，在722型分光光度計上，用505nm波長，1cm光徑比色皿，以蒸餾水校零，測定其吸光度值A2。
以已知濃度c.f.a.s.膽固醇校準品為校準液，取24uL按照上述相同的步驟得到光吸收值A1’和A2’。
根據公式膽固醇濃度(mmol/L)＝(A2-A1)/A2’-A1’)×校準液濃度(mmol/L)。
實施例3本發明檢測方法的線性、反應進程、精度、回收率和干擾性試驗一、線性分析取一低值標本(RLP-C為0.08mmol/L)和一高值標本(RLP-C為2.00mmol/L)等量混勻后制備中值標本的RLP-C為1.04mmol/L，中值標本分別與高、低值標本等量混勻又制備兩個水平標本的RLP-C，分別為1.52mmol/L和0.56mmol/L。5個不同水平的標本分別用兩種清除法按由高到低的順序分別用實施例1的方法測定4次，按NCCLS EP6-P文件進行線性分析。結果線性回歸分析方程為Y＝0.986X+0.019，r＝0.992，表明該法在2.00mmol/L以內線性關系良好。
二、批內精度取高、中、低值3個不同水平RLP-C(0.50mmol/L、0.20mmol/L和0.08mmol/L)樣品，按照實施例1的方法進行測量，其重復次數為20次。按美國國家臨床實驗室標準化委員會(National Committee for ClinicalLaboratory Standards，NCCLS)EP5-T2文件進行精密度評價。三濃度水平的批內CV分別為1.76％、2.64％和3.76％三、批間精度取高、中、低值3個不同水平RLP-C(0.50mmol/L、.0.20mmol/L和0.08mmol/L)樣品，按照實施例1的方法進行測量。每天上下午各測定1次，連續測定10天，第次測定均作雙份，按美國國家臨床實驗室標準化委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)EP5-T2文件進行精密度評價。三濃度水平的批間CV分別為2.99％、3.14％和3.81％。
四、干擾試驗取一份混合血清(RLP-C為0.22mmol/L)分別加入不同濃度血紅蛋白(以Hb濃度表示)、膽紅素、抗壞血酸和脂肪乳劑(以TG濃度表示)，LDL(以LDL-C表示)和HDL(以HDL-C表示)，按照實施例1的方法分別測定RLP-C，結果顯示，TG＜15.3mmol/L、Hb＜5g/L、LDL-C＜7.0mmol/L、HDL-C＜3.0mmol/L、膽紅素＜342μmol/L、抗壞血酸＜150mmol/L時對方法無顯著干擾。
實施例4 本發明方法的臨床應用效果應用實施例1的測定方法測定了200例正常人以及60例冠心病、102例2型糖尿病、40例III型高脂蛋白血癥患者血漿RLP-C水平。正常組、冠心病組、2型糖尿病組、III型高脂蛋白血癥組血漿RLP-C分別為(0.18±0.08)mmol/L、(0.403±0.331)mmol/L、(0.38±0.21)mmol/L、(0.91±0.58)mmol/L，冠心病組、2型糖尿病組、III型高脂蛋白血癥組均顯著高于對歸組，差異有顯著意義，P均小于0.001。正常組RLP-C濃度有顯著年齡和性別差異，55歲以下同年齡組男女參考值具有顯著區別，其中男性參考值各年齡組無顯著區別，而女性各年齡組有顯著區別；55歲以上同年齡組男女參考值無顯著區別。
權利要求
1.測定血清或血漿樣品中的脂蛋白殘粒的方法，該方法包括步驟a)將一定量的含有ApoB100抗體和ApoA I抗體的試劑I與樣品混合，以使試劑I中的抗體與樣品中的相應抗原充分反應，得到反應完全的溶液；b)用膽固醇酶法檢測所得溶液中的膽固醇濃度，即為脂蛋白殘粒濃度
2.如權利要求1的方法，其中在使用膽固醇酶法檢測之前將所述反應完全的溶液離心，得上清液。
3.如權利要求1的方法，其中的ApoB100抗體可以用ApoB52抗體或ApoB48抗體代替。
4.如權利要求1、2或3的方法，其中所述的抗體選自兔或羊抗人多克隆抗體或單克隆抗體。
5.如權利要求1、2或3的方法，其中所述的試劑I還含有促進劑。
6.如權利要求4的方法，其中所述的促進劑是聚乙二醇6000。
7.如權利要求1、2或3的方法，其中步驟c)包括向上清液中加入一定量的試劑II進行反應，該試劑II含有過氧化物酶、4-氨基安替比林、任選的膽固醇酯酶和任選的膽固醇氧化酶；反應完全后，在505-550nm處進行吸光度測定，從而計算出膽固醇的濃度。
8.如權利要求1、2或3的方法，其中所述的試劑I還含有膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶。
9.如權利要求8的方法，其中步驟c)包括向上清液中加入一定量的試劑II進行反應，該試劑II含有過氧化物酶和4-氨基安替比林；反應完全后，在505-550nm處進行吸收光度測定，從而計算出膽固醇的濃度。
10.分離血清或血漿樣品中的脂蛋白殘粒的免疫沉淀分離方法，該方法包括將含有ApoB100抗體與ApoA I抗體的試劑I與該樣品混合，混勻并反應完全后進行測定。
11.如權利要求10的方法，其中的ApoB100抗體可以用ApoB52抗體或ApoB48抗體代替。
12.如權利要求10或11的方法，其中所述的抗體選自兔或羊抗人單或多克隆抗體。
13.如權利要求10的方法，其中所述的試劑I還含有促進劑。
14.如權利要求13的方法，其中所述的促進劑是聚乙二醇6000。
15.如權利要求10-13任一項所述的方法，其中所述的試劑I還含有膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶。
16.測定血清或血漿樣品中的脂蛋白殘粒的方法，該方法包括步驟a)取一定量的ApoB100抗體和ApoA I抗體，任選的加速促進劑，任選的TRIS-HCL緩沖液，任選的膽固醇酯酶，任選的膽固醇氧化酶和任選的過氧化物酶混合液與待檢樣品混合，混勻后在37℃中放置5-10分鐘，以使ApoB100、ApoA I抗原和抗體充分結合；b)任選地，取一定量ApoB100抗體和ApoA I抗體與待檢品混合，混勻后在37℃放置30分鐘，4000轉/分離心10分種后，取待檢樣品上清液c)用膽固醇酶法試劑測定所得溶液中的膽固醇濃度，即為脂蛋白殘粒濃度。
全文摘要
本發明涉及測定血清或血漿中脂蛋白殘粒(RLP)濃度的方法，具體地涉及采用免疫結合直接法或免疫沉淀分離法來測定血清或血漿中脂蛋白殘粒(RLP)濃度，作為臨床判斷動脈粥樣硬化性疾病和冠心病以及與動脈粥樣硬化性有關的代謝性疾病程度及療效評估、預后判斷的參考依據。
文檔編號G01N33/68GK1880956SQ20061002392
公開日2006年12月20日 申請日期2006年2月17日 優先權日2006年2月17日
發明者劉穎冰, 朱劍鋒, 劉穎成, 劉中令 申請人:上海北加生化試劑有限公司, 劉穎冰, 朱劍鋒, 劉穎成, 劉中令