專利名稱：快速檢測霍亂弧菌01群0139群及霍亂毒素的試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種一次操作即可同時快速檢測霍亂弧菌01群、0139群及霍亂毒素的試紙條。
背景技術：
霍亂是由產霍亂毒素的霍亂弧菌引起的一種急性腸道傳染病，由于霍亂發病急、傳播快、波及范圍廣，故被我國傳染病法列為甲類傳染病，人類歷史上有七次霍亂大流行，波及一百多個國家，奪取了上千萬人的生命，01血清群是引發這七次大流行的主要血清群。1992年11月，一種新型的、非01血清群的霍亂弧菌在印度和孟加拉國家被發現，被命名為0139血清群，0139群霍亂弧菌很快波及到十幾個國家和地區，被預測很可能會繼01群霍亂弧菌后引發新的世界大流行。霍亂毒素是由致病的霍亂弧菌分泌的一種蛋白質。它由A、B兩個亞單位構成，其中A亞單位是霍亂毒素的產毒部分，它進入小腸細胞內，通過酶的作用，改變腸粘膜細胞的分泌功能，導致人體水分和電解質的大量喪失，嚴重時危及人的生命。歸根結底，產毒型霍亂弧菌才是引起霍亂爆發、流行的罪魁禍首。如果分離到霍亂弧菌01型和0139型后，必須對分離的霍亂弧菌進行是否產毒的檢測，如果不產生霍亂毒素，依現行法令不采取防疫措施。
鑒于霍亂帶給人類如此嚴重的威脅，國家相關部門已將霍亂的早期診治工作作為霍亂的防治重點，因此，快速、簡易、靈敏、特異、安全的檢測霍亂弧菌就顯得尤為重要。
目前對霍亂01群和0139群的確診多采用的是病原體的分離鑒定法，雖說特異性強，但耗時長，一般在十幾個小時以上，不利于及時早期確診，還有一些常規的輔助診斷方法如血清凝集試驗、制動試驗等，但這些方法存在特異性差、靈敏度低等問題，還有一種高靈敏度的方法，即聚合酶鏈反應(PCR)，但使用這種方法所需的儀器昂貴且操作復雜，還極易因操作污染導致假陽性出現，不適宜在臨床上推廣使用，目前也有報道介紹應用免疫層析法檢測霍亂弧菌，但該方法使用的是抗霍亂弧菌的多克隆抗體，其特異性就不如使用單克隆抗體的特異性強，且容易發生01群和0139群的交叉反應。
現有的檢測霍亂毒素的方法多采用聚合酶鏈反應(PCR)，對其產毒的基因片斷進行擴增，雖說靈敏度較高，但該方法耗時長，費用高，對操作人員的要求較嚴格，不利于病人樣品的快速篩選及檢測的普及。
發明內容
針對上述情況，本發明之目的就是提供一種新的快速檢測霍亂弧菌01群0139群及霍亂毒素的試紙條，可快速一次解決檢測霍亂弧菌01群、0139群及霍亂毒素的多聯免疫層析問題，其解決的技術方案是，該試紙條是在PVC板載體上，自下而上依次連接有樣品墊、膠體金結合物墊、硝酸纖維素膜(即N.C膜)和吸收墊，硝酸纖維素膜貼裝在PVC板載體上面，膠體金結合物墊上分別疊加標記著一株抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、一株抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和一株抗霍亂毒素單克隆抗體，或是其三者的混合，硝酸纖維素膜上有T1區、T2區、T3區和C區，T1區、T2區、T3區上分別包被有與膠體金結合物墊上的單克隆抗體相匹配的另外一株抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、一株抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和一株抗霍亂毒素單克隆抗體，C區包被有抗鼠免疫球蛋白的抗體，本發明結構獨特，使用方便，檢測結果準確，不與其他腸道細菌產生交叉反應，特異性強，靈敏度高，快速、經濟、安全，特別適用于現場和臨床標本的快速檢測和鑒定，對霍亂的早期診斷有著重要的價值和意義。
四
圖1為本發明的結構側視圖。
圖2為本發明的結構主視圖。
五具體實施例方式
以下結合附圖對本發明的具體實施方式
作詳細說明。
由圖1、圖2給出，本發明是在PVC板載體1上，自下而上依次連接有樣品墊2、膠體金結合物墊3、硝酸纖維素膜4和吸收墊5，硝酸纖維膜4貼裝在PVC板載體1上面，膠體金結合物墊3上分別疊加標記著一株抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、一株抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和一株抗霍亂毒素單克隆抗體或是其三者的混合，硝酸纖維素膜4上有T1區、T2區、T3區和C區，T1區、T2區、T3區上分別包被有與膠體金結合物墊上的單克隆抗體相匹配的另外一株抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、一株抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和一株抗霍亂毒素單克隆抗體，C區包被有抗鼠免疫球蛋白的抗體。
為了保證使用安全和使用效果，所說的硝酸纖維素膜一端被吸收墊5的凸沿7壓裝在PVC板載體1上，另一端經膠體結合物墊3由樣品墊2的凸沿6壓裝在PVC板載體1上。
所說的抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和抗霍亂毒素單克隆抗體是采用常規的通用技術小鼠脾臟細胞和骨髓瘤細胞的融合技術分別制備的，并通過對所有單克隆抗體的配對，篩選，最終選定一對抗霍亂弧菌01群、一對抗霍亂弧菌0139群和一對抗霍亂毒素的三對(六株)強勢單克隆抗體，將選下的單克隆抗體經過常規純化技術純化后，分別置于膠體金結合物和T1區、T2區及T3區上即可。
本發明的使用情況是A、直接用吸管取病人的水樣便標本或堿性蛋白胨水增菌后的病人標本約150ul，加入到試紙條的樣品墊端。
B、5-15分鐘內觀察結果。
C、結果判定如果只有C區出現紅色條帶，則為陰性；如在C區、T1區出現兩條紅色條帶，則為01群霍亂弧菌感染但不產毒；如在C區及T1、T3區出現三條紅色條帶，則為01群霍亂弧菌感染且產毒；如在C區、T2區出現兩條紅色條帶，則為0139群霍亂弧菌感染但不產毒；如在C區及T2、T3區出現三條紅色條帶，則為0139群霍亂弧菌感染且產毒。
此外，為了防止操作過程中造成病原菌的污染，最好再為該發明配備檢測卡，樣品直接加入到樣品槽內，可在顯示窗內讀結果，由于檢測卡密封性好，便于安全操作，使用后也便于處理。
本發明使用的生物原材料為特異性強的兩株抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、兩株抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和兩株抗霍亂毒素單克隆抗體。
經試驗，該試紙條與以下高濃度細菌均無交叉反應，這些細菌包括大腸桿菌、痢疾桿菌、副溶血性弧菌、擬態弧菌、小腸結腸性耶爾森氏菌、麥氏弧菌、沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌、變形桿菌、志賀氏桿菌、河弧菌、枸櫞酸桿菌和雙岐桿菌等，試驗方法是先將上述細菌分別稀釋至109個/ml，各取150μl，滴加到本發明試紙條的樣品墊上，5-15分鐘，觀察結果，均為陰性，表明本發明試紙條與以上細菌無交叉反應，特異性強，此外，經過120例試驗，該試紙條檢測結果準確率非常高，準確率高達98％以上，而且經河南省疾病預防控制中心鑒定，該試紙條檢測霍亂弧菌的最低檢出率為104-105個/ml，非常突出的具有特異性強，靈敏度高，快速，經濟，安全之特點，有效克服了現有檢測霍亂弧菌時間長、效率低，貽誤最佳治療時間的問題，特別適用于現場和臨床標本的快速檢測，解決了長期人們想解決而又未解決快速準確檢測霍亂弧菌的問題，有巨大的經濟和社會效益。
權利要求
1.一種快速檢測霍亂弧菌01群0139群及霍亂毒素的試紙條，其特征在于是，在PVC板載體(1)上，自下而上依次連接有樣品墊(2)、膠體金結合物墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸收墊(5)，硝酸纖維膜(4)貼裝在PVC板載體(1)上面，膠體金結合物墊(3)上分別疊加標記著一株抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、一株抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和一株抗霍亂毒素單克隆抗體或是其三者的混合，硝酸纖維素膜(4)上有T1區、T2區、T3區和C區，T1區、T2區、T3區上分別包被有與膠體金結合物墊上的單克隆抗體相匹配的另外一株抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、一株抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和一株抗霍亂毒素單克隆抗體，C區包被有抗鼠免疫球蛋白的抗體。
2.根據權利要求1所述的快速檢測霍亂弧菌01群0139群及霍亂毒素的試紙條，其特征在于，所說的硝酸纖維素膜一端被吸收墊(5)的凸沿(7)壓裝在PVC板載體(1)上，另一端經膠體結合物墊(3)由樣品墊(2)的凸沿(6)壓裝在PVC板載體(1)上。
3.根據權利要求1所述的快速檢測霍亂弧菌01群0139群及霍亂毒素的試紙條，其特征在于，所說的抗霍亂弧菌01群單克隆抗體、抗霍亂弧菌0139群單克隆抗體和抗霍亂毒素單克隆抗體是采用常規的通用技術小鼠脾臟細胞和骨髓瘤細胞的融合技術分別制備的，并通過對所有單克隆抗體的配對，篩選，最終選定一對抗霍亂弧菌01群、一對抗霍亂弧菌0139群和一對抗霍亂毒素的三對強勢單克隆抗體，將選下的單克隆抗體經過常規純化技術純化后，分別置于膠體金結合物和T1區、T2區及T3區上。
全文摘要
本發明是快速檢測霍亂弧菌01群、0139群及霍亂毒素的試紙條，有效解決檢測霍亂弧菌01群、0139群及霍亂毒素的多聯免疫層析問題，該試紙條是在PVC板載體上自下而上依次連接有樣品墊、膠體金結合物墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，硝酸纖維素膜貼裝在PVC板載體上面，膠體金結合物墊上分別疊加標記著一株抗霍亂弧菌01群單抗、一株抗霍亂弧菌0139群單抗和一株抗霍亂毒素單抗，或是其三者的混合，硝酸纖維素膜在T
文檔編號G01N33/52GK1866021SQ20061001778
公開日2006年11月22日 申請日期2006年5月16日 優先權日2006年5月16日
發明者楊書豪, 周蕾, 鄭篷舉, 王玉珠, 楊艷艷, 劉昊旻, 張晨 申請人:鄭州理利生物工程有限公司