專利名稱：萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測受體興奮劑的器具，特別是涉及一種萊克多巴胺(Ractopamine，簡稱RA)殘留快速檢測試紙條。
二、技術背景禁用獸藥在畜牧業及水產養殖業中的濫用，仍然是人們擔憂的重大問題，也是動物源性食品源頭污染的重要因素之一。在水產養殖、畜禽飼養過程中，禁用獸藥萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅(“瘦肉精”)、己烯雌酚、呋喃唑酮、安眠酮、氯丙嗪、氯霉素等的非法使用是造成蝦、蟹、魚、豬、禽等產品變為非安全的食品的重要因素之一。食品安全是人們生命安全的初級保障，事關人民的健康和社會穩定，是關系國計民生的大問題。目前我國食品安全監管工作已進入“攻堅破難”的關鍵階段，需要建立和完善我國的檢測方法標準體系，對有些違禁藥物殘留檢測目前還沒有國家標準或行業標準，有時難以對食品中的這些殘留實施有效監控，導致國內畜禽產品及水產品因禁用藥殘留超標而不能出口，國外殘留超標因我們檢測不出而進口，危害人們身體健康。目前亟待解決的問題是，如何用簡單的技術方法對集貿市場、批發市場上的菜和肉進行快速檢測，并及時發現和處理問題。
鹽酸克倫特羅(俗稱瘦肉精)被非法用作飼料添加劑，飼喂豬、雞、牛、羊、兔、鴨等動物，制造出許多不安全肉食品，給人們的健康帶來了很大的危害。由于我們已研制開發出“瘦肉精”快速檢測試紙條，在推廣應用過程中產生了巨大的威懾作用，因此，“瘦肉精”的非法使用得到了有效的控制。但“瘦肉精”快速檢測試紙條無法檢測萊克多巴胺的殘留，因此，隨著“瘦肉精”快速檢測試紙條的推廣應用，“瘦肉精”的非法使用逐步減少，而“瘦肉精”的替代品萊克多巴胺的非法應用逐漸增加。農辦牧 70號文件，2004年下半年全國飼料質量安全監測結果的通報檢測養殖企業(戶)和屠宰場的“飼料/水”、豬尿樣品2824批次，檢出含有鹽酸克侖特羅和萊克多巴胺等違禁藥品55批次，違禁藥品檢出率1.95％。其中，萊克多巴胺呈陽性的豬尿和豬配合飼料樣品28批次，含有鹽酸克侖特羅的豬飼料和尿液樣品2批次，與2003年相比，違禁藥品檢出率有所上升，主要原因是添加萊克多巴胺、地西泮等其他違禁藥品現象增加。浙江省農業廳的通報2005上半年，浙江省農業廳對全省的生豬養殖場和屠宰場的生豬尿樣進行了例行監測。監測人員共隨機抽取了105家生豬養殖場的330份尿樣，鹽酸克侖特羅(“瘦肉精”)陽性檢出率為0.6％(2例陽性)萊克多巴胺陽性檢出率為2.7％(9例陽性)。針對萊克多巴胺的殘留檢測，2005年上海市質量技術監督局發布了〔2005〕64號文，制定了檢測萊克多巴胺的地方標準，但我國目前尚無統一檢測標準。
萊克多巴胺與“瘦肉精”屬同類的化學合成藥物，均屬β-腎上腺素受體激動劑(β-激動劑)，大劑量飼喂造成動物組織殘留，中毒癥狀癥狀主要表現為破壞快縮肌纖維與慢縮肌纖維的協調性，心率失常、心動過速、肌肉疼痛，行走不穩，頭暈頭痛、惡心、嘔吐，肌肉不自主震顫等癥狀，甚至有生命危險，長期過量攝入會積蓄中毒，還有導致染色體畸變的可能。1997年3月25日，我國農業部發布了《關于嚴禁非法使用獸藥的通知》，嚴禁將β-激動劑等藥物作為動物促生長劑使用。2002年3月5日，農業部發布了《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》，萊克多巴胺名列其中，要求對飼料生產、經營、使用和動物飲用水中非法使用違禁藥物的違法行為嚴厲打擊。萊克多巴胺現有的檢測方法主要有高壓液相色譜法、氣相色譜法、氣質連用法以及ELISA等。色譜技術是非常有效、準確、敏感的方法，但是待檢樣品需經一系列的預處理，繁瑣費時，從樣品預處理到得出檢驗結果至少需2～3天時間，檢測費用很高。另一方面這種檢測方法還必須有昂貴的儀器設備。只有特定的專業人員才能應用，而且每次檢測的樣品有限，不適應大批樣品的篩查，嚴重阻礙了該檢測方法的推廣應用，更不適應于現場檢驗。ELISA也是一種常用的檢測技術，它是以竟爭性酶聯反應為檢測原理，檢測全過程約需2-4小時。由于ELISA是一種敏感性很強的檢測方法，不同的操作者往往會出現不同的結果，所以該方法常常造成人為的誤檢和漏檢。因此在實際生產中急需一種快速檢測萊克多巴胺的檢測方法。目前各級食品檢驗部門和外貿出口單位，都加強對萊克多巴胺的檢測力度，以確保人民群眾吃上放心肉。因此研制靈敏、快速，準確的萊克多巴胺檢測方法，檢測家畜組織及飼料中是否含萊克多巴胺有著十分重要的意義。
發明內容
本發明的目的研制出特異、敏感、快速、簡便的萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條。
本發明的技術方案一種萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條，含有底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為纖維層，吸附金標抗體纖維層，纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯萊克多巴胺的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“‖”。
不吸水的支撐層薄片層用硬質塑膠片條，或不吸水的硬紙條制成。
測試端纖維層用玻璃棉、或尼龍膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯膜制成，優選玻璃棉。吸水材料層用吸水紙制成。
纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜，或羧化纖維素膜制成。
金標抗體纖維層用吸附萊克多巴胺的金標抗體玻璃棉，萊克多巴胺金標抗體為膠體金標記萊克多巴胺的單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯萊克多巴胺的載體蛋白溶液為萊克多巴胺與載體蛋白偶聯的復合溶液。
在測試端吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向測試端纖維層一側約0.5cm處。
偶聯萊克多巴胺的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，或為雞卵清白蛋白(OVA)，或為鐵蛋白，或為血藍蛋白。
本發明的萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條具有以下優點(1)特異性強，敏感性高。RA快速檢測試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體(W1)為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標對單克隆抗體(W1)特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，快速檢測試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到0.1納克的微量RA殘留。
(2)操作簡便快速。使用本發明試紙條時無需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品10秒左右，在2分鐘內即可判定檢測結果。
(3)結果顯示形象、直觀、準確。本發明測試紙條以顯示紅棕色“|”及“‖”印跡作為檢測的陽性和陰性標記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“|”印跡表示在被檢測樣品液中含有RA，兩條棕紅色“‖”印跡表示在被檢樣品中不含RA，結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性誤判。
(4)成本低，投資少。使用快速檢測試紙條，不需另配儀器設備及其它試劑，隨時隨地進行檢測，費用低廉，節省大量貴重儀器及設備費用。
(5)應用范圍廣，便于推廣應用。本發明快速檢測試紙操作簡單，能滿足不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、畜產品加工、集約化養殖到個體養殖等，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
四
圖1為萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條結構示意圖。
圖2為萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條俯視結構示意圖。
五具體實施例方式要制成萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條，首先需制備偶聯RA的載體蛋白和金標抗體，從而制備檢測印跡和金標抗體纖維；其次需制備羊抗或兔抗小鼠IgG抗體，用于制備對照印跡。
1.萊克多巴胺RA與載體蛋白Xi的偶聯采用碳化二亞胺法、重氮化法或戊二醛法，將RA與載體蛋白進行偶聯制備免疫抗原。將5mg萊克多巴胺溶解于預冷(2～8℃)的稀鹽酸(pH3.0)中，加入10mg亞硝酸鈉(重量比為2∶1)，室溫避光攪拌6小時，溶液顏色變為黃色。將載體牛血清白蛋，或雞卵清白蛋白或鐵蛋白，或血藍蛋白溶于PBS緩沖液中，按摩爾比25∶1加入上反應中，溫室攪拌過夜。將反應液用PBS緩沖液透析即可。
2.抗萊克多巴胺RA單克隆抗體(W1)的制備以50μg～100μg/只的偶聯RA的載體蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次間隔15～30天；第三次加強免疫后3～4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，于75％酒精浸泡5～10min，無菌取其脾細胞；剪碎并經100目尼龍網過濾，1000r/min離心10min，收集脾細胞；將1×108的脾細胞與2～5×107的NSO漿細胞瘤細胞混合，1000r/min離心10min棄上清，細胞沉淀于37℃的水溶中緩緩加入0.7～1ml的40～50％PEG4000(pH 8.5～9.0)作用1min，然后緩慢加入無血清1640培養基15ml，以終止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min離心10min棄上清，將細胞沉淀重懸于HAT選擇培養基中，并加入96孔培養板(100μl～200μl/孔)，置于37℃5％CO2培養箱中培養。培養7～10天后，以5μg～10μg/ml的偶聯RA的載體蛋白包被酶標板(40孔/塊)，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測雜交瘤的培養上清，挑取強性細胞克隆(OD492＝0.8以上)，進行連續三次的有限稀釋法克隆化，所生產的雜交瘤細胞染色體數為92～98，其分泌的單克隆抗體(W1)特異地與RA反應，而不與其它蛋白發生交叉反應，親和力常數達109～10，輕鏈亞型為κ或λ，重鏈亞型為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，針對RA特異抗原決定簇的單克隆抗體(W1)，用于制備金標抗體。
3.萊克多巴胺RA金標抗體(W1)和金標抗體(W1)玻璃棉的制備以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在50～100ml沸騰的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4ml的0.5～2％檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體金。以0.1mol/L的K2CO3調膠體金pH至8.5～9.5，置于以1∶1000～1300的標記比將待標記的RA單克隆抗體(M1)加入pH8.5～9.5的金溶膠中，標記10min后，加20％PEG10000至終濃度0.05％，4℃、1500～3000rpm離心20min，除去未結合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲初步純化金標抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標蛋白，獲得RA膠體金標記抗體。將1∶(100～500)稀釋的膠金標記抗體吸附于精制玻璃棉中，4℃低溫真空干燥，制備RA金標抗體棉。
4.羊抗或兔抗小鼠IgG的制備以飽和硫酸銨提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS(pH 7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨混勻，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min離心15min，棄上清；以適量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨至終濃度33％，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min離心15min，棄上清，以少量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱內用PBS(pH7.2)過夜透析，換液2～3次，4℃、12000r/min離心15min，收集上清，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度，以50μg～100μg/kg體重(小鼠血清IgG)經皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3～4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1∶2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨提取羊抗或兔抗小鼠IgG(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于RA快速檢測試紙條對照顯示印跡的制備。
5.萊克多巴胺RA快速檢測試紙條實施檢測反應原理當萊克多巴胺RA快速檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過虹吸帶動待檢RA及金標抗體棉中的金標抗體(W1)一起向硝酸纖維素膜擴散，并最終滲入手柄端濾紙中，擴散過程中待檢RA可與的金標抗體(W1)相結合，進而封閉金標抗體(W1)上RA的抗原結合點，阻止金標抗體(W1)與纖維素膜上偶聯RA的載體蛋白(Xi)的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，而羊抗或兔抗小鼠IgG(Y)則可與金標抗體(W1)結合，形成紅棕色對照印跡“|”，即一條紅棕色“|”印跡為陽性標記，反之樣品溶液中無RA則不能阻止金標抗體(W1)與纖維素膜上偶聯RA的載體蛋白(Xi)檢測印跡結合，顯示紅棕色檢測印跡“|”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG(Y)也與金標抗體(W1)結合，顯示紅棕色對照印跡“|”，形成兩條紅棕色“‖”為陰性標記，如果纖維素膜上沒有紅棕色標記顯示，則表明試紙條已失效。
6.萊克多巴胺RA快速檢測試紙條檢測操作方法檢測樣品液的制備，若檢測肉或肉制品可將樣品剪碎、研磨，以生理鹽制成1∶2～10待檢測樣品懸液；若檢測的對象是蛋或奶，可直接將蛋或奶用生理鹽水制成1∶2～10待檢測樣品懸液；若用動物的血液作為待測樣品，則提取血清，用血清作為待測樣品，或直接取動物的尿液作為檢測樣品。
將RA快速檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品液中，插入深度不超過標記線9，約10秒后取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結果。
檢測結果判斷如果在纖維素膜上有一條紅棕色標記“|”顯示，表示測檢結果呈陽性，說明在被檢測的樣品液中含有RA，即該動物飼喂過含有違禁的萊克多巴胺添加劑飼料，這樣的動物肉料和肉制品不能在市場上流通，人吃了上述肉類將會影響健康，甚至會發生食物中毒。如果RA快速檢測試紙條上的纖維素膜出現有兩條紅棕色標記“‖”，表示檢測結果呈陰性，即在待檢樣品中不含萊克多巴胺成份，則呈陰性結果的動物肉類和肉制品中不含RA成份，食用安全。
實施例一參見圖1和圖2。圖中1為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為測試樣品端的纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附有萊克多巴胺RA的金抗體(W1)纖維層，根據上述具體實施方式
3中所述的制備方法，制備吸附有萊克多巴胺單克隆抗體的金標抗體(W1)玻璃棉，4為纖維素膜層，本實施例采用硝酸纖維素膜，5為吸水材料層，用吸水濾紙制成，將編號2、3、4、5各層從左至右粘貼在塑膠薄片條1上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在硝酸纖維素膜層4上，6為用偶聯萊克多巴胺的載體蛋白BSA溶液印上檢測印跡“|”，7為用羊抗小鼠IgG(Y)溶液印上對照印跡“|”，兩條印跡帶平行排列形成組合印跡帶“‖”。8-1為覆蓋在纖維層2和金標抗體纖維層3上面的樣品端白色保護膜，在2和3交界處對應保護膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一側0.5cm處印有標記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，吸水層5(手柄端)上覆蓋有其它顏色(如黃色)保護膜8-2。待測樣品溶液的制備及檢測操作步驟，同具體實施方式
6中的檢測操作方法，不重述。
實施例二萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于支撐層1用不吸水的硬紙條制成，測試端纖維層2用尼龍膜，RA金標抗體纖維層3吸附有膠金標記萊克多巴胺RA多克隆抗體，纖維素膜層4采用純纖維素膜，隱形檢測印跡帶6中偶聯RA載體蛋白溶液為鐵蛋白，隱形對照印跡帶7用兔抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制備而成。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均同具體實施方式
6中的操作方法，不重述。
實施例三、萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于測試端吸附纖維層2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，隱形檢測印跡帶6中偶聯RA載體蛋白溶液為雞卵清白蛋白(OVA)，隱形對照印跡帶7用羊抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制備而成。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均同具體實施方式
6中的檢測操作方法，不重述。
實施例四萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條結構和實施例一基本相同，不同之處在于測試端吸附纖維層2用聚酯膜，隱形檢測印跡帶6中偶聯RA載體蛋白溶液為血藍蛋白。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均同具體實施方式
6中的檢測操作方法，不重述。
權利要求
1.一種萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條，含有底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護層固定在吸附層上，其特征是吸附層從測試端依次為纖維層，吸附金標抗體纖維層，纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯萊克多巴胺的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“‖”。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是不吸水的支撐層薄片層用硬質塑膠片條，或不吸水的硬紙條制成。
3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是測試端纖維層用玻璃棉、或尼龍膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯膜制成。
4.根據權利要求3所述的試紙條，其特征是測試端纖維層用玻璃棉制成。
5.根據權利要求1所述的萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條，其特征是吸水材料層用吸水紙制成。
6.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜，或羧化纖維素膜制成。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是金標抗體纖維層用吸附萊克多巴胺的金標抗體玻璃棉，萊克多巴胺金標抗體為膠體金標記萊克多巴胺的單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯萊克多巴胺的載體蛋白溶液為萊克多巴胺與載體蛋白偶聯的復合溶液。
8.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是在測試端吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向測試端纖維層一側約0.5cm處。
9.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是偶聯萊克多巴胺的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，或為雞卵清白蛋白(OVA)，或為鐵蛋白，或為血藍蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種檢測受體興奮劑的器具，特別是涉及一種萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條。本發明萊克多巴胺殘留快速檢測試紙條含有底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護層固定在吸附層上，吸附層從測試樣品端依次為纖維層，吸附偶聯RA的金標載體蛋白Xi纖維層，纖維素膜層，手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上有用偶聯萊克多巴胺的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“‖”。該快速檢測試紙條，特異性強，敏感性高，操作簡便快速；檢測結果顯示形象，直觀，準確，成本低，投資少，不需專用儀器設備及專業人員，容易推廣實施。
文檔編號G01N33/544GK1847851SQ20061001759
公開日2006年10月18日 申請日期2006年4月3日 優先權日2006年4月3日
發明者李學伍, 張改平, 王自良, 楊艷艷, 鄧瑞廣, 肖治軍, 王選年, 趙東, 邢廣旭, 李青梅, 柴書軍, 楊繼飛, 李靈霞, 王建中 申請人:河南省農業科學院生物技術研究所