流感與普通感冒的鑒別及流感抗體檢測方法

專利名稱：流感與普通感冒的鑒別及流感抗體檢測方法
技術領域：
本發明屬流感病毒抗原的表位及其變異表位在快速診斷中的應用，特別涉及流感病毒膜蛋白M1蛋白和M2蛋白的N端的高度保守的抗原表位及其抗體、變異表位及其抗體在流感與普通感冒的鑒別及流感抗體檢測中的應用，屬疾病診斷領域中體外快速檢測法。
背景技術：
流感與普通感冒是完全不同的兩種傳染病。
普通感冒，俗稱“傷風”，以鼻咽部炎癥為主要表現。大約有150種以上的病毒可以引起感冒，所以我們一生中才會不斷地感冒。一般來說，小孩平均每年感冒約5～8次，成年人每年患感冒約2～5次。
流行性感冒，簡稱流感。是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，病原體為甲、乙、丙三型流行性感冒病毒。尤其以甲型多見，好發于冬、春季。流感病毒通常由打噴嚏或咳嗽的飛沫傳播。人得了流感后，癥狀會突然發生且在數小時內惡化，發高燒，體溫可達39℃以上。兩眼脹痛，四肢疼痛，疲乏，有時眼結膜充血，鼻塞、流鼻涕，咽喉干痛。兒童常有腹痛、腹脹、腹瀉、嘔吐等消化系統癥狀，甚至發生驚厥。流感的癥狀對嬰幼兒、老年人和患有慢性病者的生命更是威脅。世界上每年因流感死亡的人數以千計，但我國臨床中往往以流感引起的并發癥為死因，而忽略了流感是發病的罪魁禍首。基于以上問題，加強科學研究，加快建立更加快速、敏感、準確的診斷方法并長期應用于流行病學監測和臨床診斷，以期早期發現流感，及早采取措施進行控制。
流感病毒(Influenza virus)屬正黏病毒科，流感病毒屬。按照病毒核蛋白(NP)和基質蛋白(M)的不同可分為A、B、C三個型。A型流感病毒又可根據病毒粒子血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同分為不同的亞型。B、C型流感病毒只可感染人類，但A型流感病毒除感染人類外還可以感染禽類和馬、豬及其他哺乳動物；并且目前研究發現，僅有A型流感病毒可以造成大流行。
典型的流感病毒粒子呈球狀，直徑80～120nm。流感病毒的核酸是負鏈單股RNA，其基因組共有8個獨立的RNA片段(分別以片段1～8命名)組成，核酸總長度約為13.6kb。
病毒RNA片段4編碼流感病毒的主要膜蛋白血凝素(HA)。該片段的變異率很高，不同亞型的毒株或同一亞型的不同毒株均有差異，自然狀態下以棒狀三聚體形式存在于雙層類脂層上。HA蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白。A型流感病毒的HA有15個亞型。在HA和NA介導的抗體的選擇壓力下，HA基因極易發生變異，從而引起流感病毒的抗原漂移和抗原轉變。
病毒RNA片段5編碼的是流感病毒的主要結構蛋白核衣殼蛋白(NP)。NP蛋白是保守的結構蛋白，在病毒進化過程中變異率很低。NP蛋白和M蛋白決定流感病毒的型特異性，是病毒分型的依據。
編碼基質蛋白(M)的片段總長約1027個核苷酸，分別翻譯為M1、M2和M3蛋白。M3蛋白與M1由相同的讀碼框轉錄，其編碼的氨基酸長度只有9個，目前這一肽段尚未分離到，功能未知。目前對M2蛋白免疫學特性研究主要集中在對M2的膜外區域(M2e)區的研究。M2e較為保守，在感染的細胞表面表達豐富。其N端的最初9個氨基酸高度保守，而且M1蛋白N端也有和M2e相同的9個保守氨基酸。
Liu等(FEMS Immunol Med Microbio，2003，3514121460)根據A型流感病毒株M2e區的氨基酸序列合成四條肽段疫苗免疫兔子，結果只有含整個M2e和含N未端最初9個保守氨基酸的肽段疫苗產生的抗體可以明顯抑制A、B型流感病毒株在MDCK細胞上的復制，而相對應于M2e中部和C未端氨基酸序列的合成肽疫苗產生的抗體卻不能有效抑制。推測M2e的N未端含有能誘導在體外抑制流感病毒復制的抗體的表位。
本發明綜合前人研究發現流感病毒共有10種蛋白，分別為PB1，PB2，PA，HA，NP，NA，M1，M2，NS1，NS2。其中含量最多的是M1，它構成病毒的基質膜。免疫原性最強為HA和NA，抗原變異率最高的也是HA和NA。這兩種抗原的變異可獨立發生也可同時發生，是流感病毒常見的一種自然變異。
這些巨大的變異給流感的診斷帶來極大的不便，本發明分析了幾乎所有的公開的流感病毒序列，找到了流感病毒的種屬特異性抗原表位即大多數致病性流感病毒基質蛋白M1和M2所共有的一段保守氨基酸序列MSLLTEVET。
編碼基質蛋白(M)的片段分別翻譯為M1、M2和M3蛋白。編碼M1和M2的ORF間存在71個核苷酸的重疊，分別位于1～26位，715～759位。M1由252個氨基酸組成，是病毒的主要結構蛋白。M1蛋白具有型特異性，和NP蛋白一起成為病毒分型的依據。M2由97個氨基酸殘基組成，為穿膜蛋白。其膜外區(M2e)、穿膜區、胞漿區分別由24、19和54個氨基酸組成。M2蛋白主要以四聚體的形式存在感染細胞的細胞膜上。M2蛋白的離子通道活性可被抗流感病毒藥物(如鹽酸金剛烷胺)特異性地抑制。M2蛋白在所有A型流感病毒中保守，可潛在地為所有A型流感病毒提供交叉保護。
目前，對M2蛋白免疫學特性研究主要集中在對M2的膜外區域(M2e)區的研究M2e較為保守，在感染的細胞表面表達豐富；其N端的最初9個氨基酸高度保守，而且M1蛋白N端也有和M2e相同的9個保守氨基酸。
Wainright PO報道，在感染禽流感病毒的雞群中，非常容易分離到耐鹽酸金剛烷胺的禽流感病毒。在細胞培養上對耐藥株的篩選結果同體內及雞胚內篩選結果不同(WainrightPO et al，1991)。但現有耐鹽酸金剛烷胺毒株的顯著特點是基質蛋白M2跨膜域第27，30，31位氨基酸發生突變。在這些毒株中，沒發現有N端的最初9個氨基酸突變的。
所有研究資料顯示，大多數致病性流感病毒基質蛋白上含有一段保守九肽MSLLTEVET，除A/Vietnam/1196/04序列為MSLLTEVPT同MSLLTEVET在第8位氨基酸上有差異外，其它A型流感病毒全部具有該序列；也未見除流感病毒外的其他病毒具有該序列，且大多數其它型流感病毒具有MSLLTE氨基酸序列。同時，基質蛋白M在流感病毒表面的含量豐富，并且MSLLTEVET或其變異表位位于膜外，給診斷提供了方便。
目前，市場上非常缺乏科學簡便、易于推廣普及的流感與普通感冒鑒別及流感抗體檢測試劑。大部分疫病防治單位缺乏必要的檢測手段，導致流感的傳播難以控制；同時流感的非典型化、多種病原的混合感染使疾病疫情復雜，診斷更加困難。由于疫病不能及時檢測與確診，免疫接種也帶有極大的盲目性和投機性。
隨著防疫意識的加強，人們也必定會在禽類和其它動物引種、畜禽商品流通及制定合理的免疫計劃時加強流感病毒及其抗體水平的檢測，因此快速、敏感、特異、價廉且適合基層使用的商品化禽流感診斷試劑的需求量將會越來越大。

發明內容
本發明的目的是提供流感病毒的種屬特異性抗原表位、變異表位用于對流感、普通感冒的鑒別；提供流感病毒的種屬特異性抗原表位、變異表位的高特異性抗體用作流感病毒抗體水平檢測。
本發明所提供的流感病毒的種屬特異性抗原表位是大多數致病性流感病毒基質蛋白M1和M2所共有的一段保守氨基酸序列，該序列為以下九肽MSLLTEVET。本發明所提供的流感病毒的種屬特異性抗原表位的變異表位是少數(尤其是耐藥性)流感病毒基質蛋白M1和M2所共有的一段保守氨基酸序列，該序列的特征為前六個多肽為MSLLTE，后邊三個肽為任意氨基酸的組合。本發明所提供的流感病毒的種屬特異性抗原表位抗體是可以識別MSLLTEVET和/或MSLLTE的抗體。
本發明利用人工合成的MSLLTEVET和MSLLTE制備出高特異性單抗，利用雙抗體夾心法檢測流感病毒的基質蛋白的存在進而確定流感病毒的存在。利用本發明制作成的流感快速診斷試劑可快速、準確的區分普通感冒和流感，為臨床用藥提供科學的依據。利用本發明制作成流感抗體檢測試劑盒為流感抗體水平檢測、接種免疫及免疫評價提供科學依據。
本發明是這樣實現的流感病毒檢測試劑盒可采用兩種方式實現可以利用人工合成的方法合成MSLLTEVET和MSLLTE多肽，經高壓液相純化得到高純度的MSLLTEVET和MSLLTE。然后，利用化學的方法將MSLLTEVET和MSLLTE分別和載體蛋白相偶聯得到可用于免疫的復合物，同佐劑混合后免疫動物制備MSLLTEVET和MSLLTE的高特異性抗體。然后利用該抗體制備用于流感與普通感冒鑒別的快速診斷試劑盒。該試劑盒的特征為包被和標記的均為MSLLTEVET和/或MSLLTE抗體，用于檢測流感病毒的存在。
還可以通過基因工程的手段，直接表達多肽MSLLTEVET和MSLLTE，或者MSLLTEVET和MSLLTE的融合蛋白，免疫動物制備MSLLTEVET和MSLLTE的高特異性抗體。然后利用該抗體制備用于流感與普通感冒鑒別的快速診斷試劑盒。該試劑盒的特征為包被和標記的均為MSLLTEVET和/或MSLLTE抗體，用于檢測流感病毒的存在。
流感病毒抗體檢測試劑盒可以利用人工合成和/或基因工程的方法獲得MSLLTEVET和/或MSLLTE多肽、MSLLTEVET和/或MSLLTE多肽偶聯復合物、基因工程獲得的MSLLTEVET和/或MSLLTE的融合蛋白進行包被和標記制成試劑盒。該試劑盒的特征為包被物和標記物均為MSLLTEVET和/或MSLLTE多肽、MSLLTEVET和/或MSLLTE多肽偶聯復合物、MSLLTEVET和/或MSLLTE的融合蛋白，可用于檢測流感病毒抗體的抗體水平。
本發明的積極效應為1.本發明可用于鑒別普通感冒和流感，為控制流感的蔓延和臨床用藥提供科學依據；2.本發明可以用于檢測流感抗體水平，為流感疫苗的接種、免疫效果評價提供科學依據；3.本發明不僅可以用于人流感及其抗體的檢測，還可以應用于其它動物流感及其抗體的檢測，使諸如禽流感之類的嚴重傳染病得到有效防制，從而減少疾病所造成的損失和撲滅的花費。
具體實施例方式
本發明利用人工合成的MSLLTEVET和MSLLTE(純度不低于95％)與載體蛋白相偶聯，免疫小鼠，制備并篩選單抗，進而完成流感診斷試劑的研制。具體實施實例如下1.多肽的獲得與偶聯采用人工合成的方法合成多肽MSLLTEVET和MSLLTE，并與牛血清白蛋白(BSA)偶聯。
2.MSLLTEVET和MSLLTE單克隆抗體的制備以MSLLTEVET和MSLLTE的偶聯物作為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，將免疫小鼠的脾臟淋巴細胞與骨髓瘤細胞相融合，然后用有限稀釋方法獲得單克隆。
具體步驟如下取健康MSLLTEVET和MSLLTE的偶聯物，加入弗氏完全佐劑稀釋到10mg/ml免疫小鼠，0.1ml/點，共四點。2周后第二次免疫，劑量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，腹腔注射(5～7天后采血測其效價)。再過2～3周后加強免疫，劑量0.5ml，腹腔注射。最后一次加強免疫，劑量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養液洗一次，將脾臟研碎，過不銹鋼篩網，離心，細胞用培養液洗2次，計數，取1×107脾淋巴細胞懸液備用，準備融合。
將6～10周大的BALB/C小鼠拉頸處死，浸泡在75％酒精內，3～5min，用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液(嚴禁刺破腸管)反復沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min，用20％小牛血清(NCS)的培養液混懸，調整細胞數至1×107/ml，加入96孔板，100μl/孔放入37℃CO2孵箱培養，制得飼養細胞。
將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm，8min；棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。90s內加入37℃預溫的1ml 45％PEG(分子量4000)溶液，邊加邊輕微搖動，37℃水浴作用90s，加37℃預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml，離心，800rpm，6min。棄上清，用含20％小牛血清HAT選擇培養液重懸細胞。將上述細胞加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養板置37℃、5％CO2培養箱中培養，完成融合。
在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天后應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始篩選所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。最后進行有限稀釋得到單克隆克隆前1天制備飼養細胞層(同上)；將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹下，計數，調整細胞為3～10個細胞/ml；取前一天準備的有飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl，孵育于37℃、5％CO2孵箱中；在第7天換液，以后每2～3天換液1次。8～9天可見細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。挑取效價高于8×107的特異性單克隆凍存，并復蘇傳代，挑取穩定的細胞株凍存備用。
先注射0.5ml Pristane(降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠腹腔，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多而小鼠瀕于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲2～5ml腹水。
將蛋白A-Sepharose置于50倍體積的Tris緩沖液(pH8.6)中(超過介質50倍v/v)，充分溶脹，在室溫下將其裝入直徑2.5cm的玻璃層析柱中，用Tris緩沖液洗以平衡；腹水樣品經三倍體積Tris緩沖液稀釋、過濾后，以1-5ml/min速度上樣，用Tris緩沖液洗至未結合的蛋白全被洗脫(以A280進行監測)；依次用檸檬酸緩沖液、乙酸鹽緩沖液以及甘氨酸--HCl緩沖液連續洗脫結合蛋白；將分部收集的洗脫的蛋白直接裝入有中和緩沖液的試管中(所加有的中和緩沖液應為洗脫液的1/4體積)；分部收集的各管洗脫液；用超濾器濃縮所得的單克隆抗體至1-5mg/ml，將濃縮的抗體置-20℃儲存。
3.流感病毒鑒別試劑的研制金標試紙條的研制將MSLLTEVET和/或MSLLTE的單克隆抗體利用PBS(PH7.8，0.02MPB，0.17MNaCl)稀釋到4mg/ml，以點或線的形式包被到NC膜或其他類似性質的膜上；同時將MSLLTEVET和/或MSLLTE的單克隆抗體包被到金、硒等顯色物質上制成試紙條，將可疑性患者的鼻腔分泌物、口腔分泌液、血液等稀釋一倍后取50ul點到加樣膜上，過10-15分鐘如果包被MSLLTEVET和/或MSLLTE的單克隆抗體的包被線顯色即可認為該患者感染流感病毒。
酶免檢測試劑的研制將MSLLTEVET和/或MSLLTE的單克隆抗體利用CB稀釋到1mg/ml，以每孔100ul的量包被到酶標板上；同時將MSLLTEVET和/或MSLLTE的單克隆抗體同辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶相偶聯，制成雙抗體夾心檢測試劑。將可疑性患者的鼻腔分泌物、口腔分泌液、血液等稀釋一倍后后取100ul加到加樣孔，37℃溫浴30分鐘，洗板五次后，將MSLLTEVET和/或MSLLTE的單克隆抗體同辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶相偶聯的偶聯物稀釋到10ug/ml加入到加樣孔中，37℃溫浴30分鐘，洗板五次后，加入顯色劑顯色，如果顯色即可認為該患者感染流感病毒。
4.流感病毒抗體鑒別試劑的研制金標試紙條的研制將含MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物用PBS稀釋到4mg/ml，以點或線的形式包被到NC膜或其他類似性質的膜上；同時將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物包被到金、硒等顯色物質上制成試紙條，將可疑性患者的口腔分泌液、血液等稀釋一倍后取50ul點到加樣膜上，過10-15分鐘如果包被MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物的包被線顯色即可認為該患者流感病毒抗體陽性。
酶免檢測試劑的研制將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物利用CB(PH9.5，0.05MCB)稀釋到0.01mg/ml，以每孔100ul的量包被到酶標板上；同時將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物同辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶相偶聯，制成雙抗體夾心檢測試劑。將可疑性患者的口腔分泌液、血液等稀釋一倍后加100ul于加樣孔，37℃溫浴30分鐘，洗板五次后，將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物同辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶相偶聯的偶聯物稀釋到酶的濃度為1ug/ml時加入到加樣孔中，每孔加100ul，37℃溫浴30分鐘，洗板五次后，加入顯色劑顯色10分鐘，如果顯色即可認為該患者流感病毒抗體陽性。
半定量酶免檢測試劑的研制將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物利用CB(PH9.5，0.05MCB)稀釋到0.001mg/ml，以每孔100ul的量包被到酶標板上；并用20％的小牛血清進行封閉，同時將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物同辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶相偶聯，將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽的多抗稀釋到500ng/ml、100ng/ml、10ng/ml作為標準對照，制成雙抗體夾心檢測試劑。將可疑性患者的口腔分泌液、血液等稀釋一倍后和三組標定物一起各加100ul于加樣孔，37℃溫浴30分鐘，洗板五次后，將MSLLTEVET和/或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物同辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶相偶聯的偶聯物稀釋到酶的濃度為0.5ug/ml時加入到加樣孔中，每孔加100ul，37℃溫浴30分鐘，洗板五次后，加入顯色劑顯色10分鐘，作光吸收曲線來定量。
權利要求
1.一種用于流行性感冒與普通感冒的快速鑒別及流感病毒抗體水平檢測的方法，其特征為用基因工程或化學合成的方法將含流感病毒膜蛋白M1蛋白和M2蛋白的N端的高度保守的表位MSLLTEVET及其變異表位(MSLLTE保守，后三個氨基酸可變)的多肽或蛋白及其抗體得到，并用于流感病毒及其抗體水平的快速檢測。
2.如權利要求1所述流感，不僅包括人感染流感病毒所引起的感冒，而且包括其他動物感染流感病毒所引起的感冒。
3.如權利要求1所述的這種用于流行性感冒與普通感冒的快速鑒別及流感病毒抗體水平檢測的方法，所用的檢測方法包括一切可用于病毒及其抗體檢測的方法，包括且不限于利用金標記、硒標記、過氧化物酶標記、堿性磷酸酶標記、化學發光基團標記的檢測方法。
4.如權利要求1所述的這種用于流行性感冒與普通感冒的快速鑒別及流感病毒抗體水平檢測的方法，不僅可以用于人流感的診斷，而且可以用于其他動物流感的診斷。
5.如權利要求1所述的含流感病毒膜蛋白M1蛋白和M2蛋白的N端的高度保守的表位MSLLTEVET及其變異表位(MSLLTE保守，后三個氨基酸可變)的多肽或蛋白，包括利用基因工程的手段得到的含MSLLTEVET或MSLLTE的多肽或融合蛋白，包括利用化學和成的手段得到的含MSLLTEVET或MSLLTE的多肽或多肽偶聯物，包括利用其他技術手段獲取的天然的含MSLLTEVET或MSLLTE的多肽或蛋白。
6.如權利要求1所述的MSLLTEVET及其變異表位(MSLLTE保守，后三個氨基酸可變)的抗體，包括可以同MSLLTEVET或MSLLTE特異性結合的單克隆抗體、多克隆抗體及其修飾產物。
7.如權利要求6所述單克隆抗體、多克隆抗體及其修飾產物，包括用任何方式修飾的產物，包括且不限于經胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶等蛋白酶及各類還原劑氧化劑修飾后的單克隆抗體、多克隆抗體產物。
全文摘要
本發明屬疾病診斷領域中體外病毒及其抗體快速檢測法。涉及使用流感病毒膜蛋白M1蛋白和M2蛋白的N端的高度保守保守九肽MSLLTEVET及其變異表位，經過修飾后做成診斷試劑盒，進行流感抗體水平檢測；使用MSLLTEVET及其變異表位的抗體，經過修飾后做成診斷試劑盒，進行流感病毒檢測。本發明可用為流感監測、接種免疫、臨床用藥提供科學依據。
文檔編號G01N33/577GK101017167SQ20061001740
公開日2007年8月15日 申請日期2006年2月8日 優先權日2006年2月8日
發明者李晨陽, 李玉林, 陳小科, 李智濤, 王云龍 申請人:河南省生物工程技術研究中心