專利名稱：：功能阻斷性抗-ed-b-纖連蛋白抗體的鑒別與鑒定的制作方法功能阻斷性抗-ED-B-纖連蛋白抗體的鑒別與鑒定發明描述本發明要求2005年7月ll日提交的US臨時申請60/697，565的申請日，所述文獻包含在此作為申請。本發明涉及重組多肽，特別是結合纖連蛋白的ED-B-同種型并可阻斷其功能的抗體或抗體片段。另外，本發明揭示了所述多肽的診斷和藥物學應用。在腫瘤發生和進展期間，其中生長有腫瘤的胞外基質(ECM)通過已經存在的ECM的蛋白酶解降解而被修飾。這個過程產生腫瘤誘導的基質，其與正常組織中存在的ECM不同。腫瘤誘導的ECM看起來是腫瘤生長和腫瘤血管發生的最佳環境(l-4)。在腫瘤血管發生中，新血管從現有的血管中形成。這個過程需要ECM的蛋白酶解，新血管結構中內皮細胞的靶向生長和分化，這是為腫瘤進一步生長所必需的(5)。纖連蛋白是基質糖蛋白的一個重要類別。其主要作用包括促進細胞與眾多不同的胞外基質粘附。纖連蛋白在培養的未轉化細胞表面上的存在以及其在轉化細胞上的不存在的事實使得可以鑒別纖連蛋白為重要的粘附蛋白。其與眾多不同分子例如膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和纖維蛋白相互作用，并因此調節細胞形態及細胞骨架的產生。另外，其與胚胎發生期間的細胞遷移和細胞分化相關。再者，其對于創傷愈合很重要，其使得巨噬細胞及其它免疫細胞可以在所述的區域內遷移，并且通過使得血小板可以與血管損傷區域粘附而形成血凝塊。纖連蛋白是兩個相似肽的二聚體，從而每個鏈的長度均為大約60-70nm。目前已經鑒別了至少20條不同的纖連蛋白鏈，其均是通過對單一纖連蛋白基因的RNA轉錄體進行可變剪接而產生的。纖連蛋白是高分子量且調節粘附的糖蛋白，在脈管系統中發揮重要作用。另外，纖連蛋白在血管發生期間對于內皮細胞具有趨化作用，調節生長因子的功能并支持內皮細胞的線性生長(6-9)。對纖連蛋白的蛋白酶解產物進行的分析示出所述多肽由6個重度折疊的結構域(heavilyfoldeddomains)組成，每個結構域均含有所謂的重復序列("重復")，其氨基酸序列的相似性使得可以將其分為3個類型(1、n和m型)。所述二聚體兩個鏈的中心區域由所謂的III型重復節段組成，平均長度為90個氨基酸(10)。結構研究表明每個III型重復均由7個P鏈組成，其折疊成2個反平行的折疊層，較短的環形區域暴露作為潛在的蛋白質-蛋白質相互作用的位點(ll)。這些m型重復使得纖連蛋白可以作為粘附分子，與稱作"整聯蛋白"的細胞表面分子相互作用。術語"整聯蛋白"在1987年首次使用(12)，用于描述在胞外基質與胞內細胞骨架之間作為介質并因此誘導細胞粘附和遷移的一組相關的異源二聚體細胞表面分子。這些異源二聚體受體"整合"或介導來自胞外環境的具有特異性細胞功能的信號。到目前為止，已知可以與20種以上a亞單位特異性且非共價相互作用的17種p亞單位，特別是形成20個不同家族(13)。在m型纖連蛋白第10個重復(m-10)中發現的序列RGDS特別介導纖連蛋白與至少8種不同整聯蛋白的相互作用。此外，已經示出至少4種整聯蛋白可以RGDS-非依賴性途徑與纖連蛋白特異性相互作用(13)。除了III7-、1118-、III9-和III10序列之外，m型的重復序列還包含EIIIB和EmA(ED-B和ED-A)重復。ED-B-纖連蛋白在成人的正常組織中不能檢測到(唯一的例外是繁殖期子宮內膜)，但是除了ED-B在間質局部表達之外，其在胎兒組織和腫瘤生長中強烈表達。此外，ED-B-纖連蛋白局部定位于血管周圍，在血管發生期間新形成。為此，ED-B-纖連蛋白是(腫瘤)血管發生過程的一種特異性標記蛋白(14)。ED-B結構域是高度保守的完全的m型同源成分，由91個氨基酸組成。人與大鼠之間的同源程度為100%，人與雞之間的同源程度為96%。在文獻中，對于ED-B結構域的功能所知甚少。有幾個出版物(15-17)推測其對于不同細胞的一般粘附介導作用。迄今為止仍未揭示對于內皮細胞的特異功能。在WO02/20563中，揭示了重組ED-B示出在體外的特異性促血管發生作用(i)bFGF-刺激的人皮膚微血管內皮細胞(HDMVEc)的增殖由重組ED-B增強，(ii)所述蛋白質介導HDMVEC的粘附，及(m)重組ED-B刺激膠原凝膠中HDMVEc的侵潤和分化(管形成)。另外，這些ED-B介導的作用可以被衍生自ED-B結構域的合成肽特異性阻斷。因此所述肽序列代表內皮細胞表面上ED-B特異性受體的結合區，利用a^-整聯蛋白的親和層析方法鑒別。0C2pr整聯蛋白與ED-B結構域之間的特異性相互作用在先前的文獻中未描述。在WO02/20563中還揭示了由ED-B-纖連蛋白結構域特異性調節的蛋白質，其包含0C2Pp整聯蛋白、局部粘附激酶和CD6配體(ALCAM)、玻連蛋白受體的a鏈、整合的oc-8亞單位或者卵泡抑素相關蛋白的前體。具有部分重疊性質的許多整聯蛋白受體由內皮細胞表達(lit.:D.G.StupackandD.A.Cheresh,SciSTKE，2002Feb12;2002)。這些表達方式示出不同的整聯蛋白(例如avP3和oc5pl)介導相似的生物學現象(粘附、遷移和存活)，并因此代表內皮細胞的維護其行為和存活的冗余系統。先前已知a2pi與其天然配體膠原相互作用。這種相互作用的阻斷可導致抗血管發生作用(Y.Funahashietal.CancerRes.62:6116-6123,2002)。本發明的一個目的因此是制備功能阻斷性結合分子，例如特異性阻斷ED-B結構域的受體結合位點的抗體。這些結合分子對于(腫瘤)內皮細胞具有抗血管發生作用。與相對廣泛表達的(X2Pr整聯蛋白相反，所述ED-B結構域代表這種結合分子的理想及特異性的靶分子。ED-B的結構難以產生單克隆和多克隆抗體，因此認為ED-B在體內免疫原性較低。抗體BC-1(J.CellBiol.108(1989),1139-1148)與纖連蛋白的隱蔽表位反應，其僅當存在ED-B時存在，因此不直接與ED-B反應。抗體L19(Tarlietal.Blood94(1999)，192-198及WO01/62800)是利用重組ED-B作為免疫原產生的，其無生物學活性，即其不能在有效程度識別細胞粘附ED-B。令人驚奇地，現在發現可以產生功能阻斷性ED-B結合分子，例如阻斷ED-B功能的抗體MOR03255，其極大程度抑制細胞粘附ED-B，且使得體內腫瘤生長顯著降低。本發明的結合分子產生的ED-B阻斷顯然不能代償膠原-整聯蛋白的代償機制。利用HuCAI^-GOLD抗體文庫-具有例如1.6x10E10個Fab片段形式的不同抗體的抗體文庫，從HuCAL-共有序列(WO97/08320;Knappik，A.;Ge,L.;Honegger,A.;Pack,P.;Fischer,M.;Wellnhofer,G.;Hoess，A.;Wolle,J.;Plunckthun,A.andVirnekas,B.(2000)J.Mol.Biol.296:57-86)中通過相應于所有六個CDR區域中的人抗體多樣性的多樣化方式產生，通過噬菌體展示方法加以變化的CysDisplay方法(WO01/05950)嚴密測試—在本發明的試驗中鑒別了選擇性結合ED-B結構域的功能阻斷性Fab抗體片段。這些抗體片段的效力可以在體外粘附測試中示出，所述測試反應了重組ED-B與分離的HDMVEc之間的特異性相互作用。與ED-B結構域的結合親和性可以通過結合分子中的特異性改變而顯著改良。在動物模型中也示出所述結合分子在體內抑制腫瘤的生長。本發明的第一方面因此是一種多肽，其(i)特異性結合纖連蛋白的ED-B結構域，并且(ii)抑制ED-B結構域與其受體之間的相互作用。本發明的多肽要選是抗體或抗體片段。本發明所用術語"抗體"包含多克隆、單克隆、嵌合、人化或人抗體，以及重組抗體例如單鏈抗體，或者結合抗原的抗體片段例如單價抗體片段，例如Fab片段或scFv片段，或者二價抗體片段，例如F(ab')2片段。在文中為本發明所必需的是所述抗體含有符合上述條件的一或多個抗原結合位點，即特異性結合ED-B結構域并抑制ED-B結構域與其受體、特別是其內皮細胞上的受體之間的相互作用。這些抗原結合性質優選通過組合VH和VL區而實現，其中這些區域形成所謂的骨架區(FR1、FR2、FR3和FR4)以及介導抗原結合的CDR區(對于VH區為H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3;對于VL區為L國CDR1、L國CDR2、L國CDR3)。本發明的多肽優選與ED-B結構域具有親和性，相應于KD值《l^m,優選Ko值《100nM、10nM、1nM、最優選KD值《0.1nM，所述親和性可以利用實施例中所述81八《^6@系統確定。本發明的多肽特征在于其特異性結合纖連蛋白的ED-B結構域，例如其與其它纖連蛋白結構域、特別是與纖連蛋白結構域6(FN6)和域纖連蛋白結構域7-8-9(7-8-9)以明顯較低的親和性結合。在一個優選的實施方案中，本發明的多肽與纖連蛋白ED-B結構域以與FN6和域7-8-9的親和性高至少2倍、特別是至少5倍、尤其是至少10倍的親和性結合，可以例如通過實施例所述的結合測試方法確定。在另一個優選的實施方案中，本發明的多肽示出在體外抑制重組ED-B與HDMVEc細胞的粘附，優選在每種情況中以10Kig/ml濃度抑制至少50n/。，優選至少75%。此外，優選本發明的多肽示出在體內抑制腫瘤生長，所述腫瘤是在實驗動物例如無毛小鼠中植入F9-畸胎癌細胞(ATCCCRL-1720)而產生的腫瘤。本發明的多肽優選選自包含如下結構的抗體和抗體片段(a)VH區(i)其由核酸序列SEQIDNO.l(MOR02610)、SEQIDN0.5(MOR02611)、SEQIDNO,9(MOR02613)、SEQIDNO.l3(MOR02614)、SEQIDN0.17(MOR02616)、SEQIDN0.21(MOR02618)、SEQIDN0.25(MOR02619)、SEQIDN0.29(MOR02622)、SEQIDN0.33(MOR02715)、SEQIDN0.37(MOR02718)、SEQIDN0.41(MOR02721)、SEQIDN0.45(MOR02722)編碼，或者上述VH區之一的至少一個H-CDRl-、H-CDR-2-禾口/或H-CDR3區，或者(ii)通過至少一個H-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區，和/或(b)VL區(i)其由核酸序列SEQIDN0.3(MOR02610)、SEQIDNO.7(MOR02611)、SEQIDNO.11(MOR02613)、SEQIDNO.15(MOR02614)、SEQIDN0.19(MOR02616)、SEQIDNO.23(MOR02618)、SEQIDNO.27(MOR02619)、SEQIDNO.31(MOR02622)、SEQIDN0.35(MOR02715)、SEQIDNO.39(MOR02718)、SEQIDNO.43(MOR02721)、SEQIDNO.47(MOR02722)編碼，或者上述VL區之一的至少一個L-CDRl-、L-CDR2-和/或L-CDR3-區，或者(ii)通過至少一個L-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區。優選VL區中L-CDR3區改變和/或VH區中H-CDR2區改變。例如，本發明的多肽具有衍生自所述VL區且由核酸序列SEQIDNO.27(MOR02619)或SEQIDNO.35(MOR02715)編碼的VL區。特別優選的是包含VH區的多肽，所述VH區(i)由核酸序列SEQIDNO,25(MOR02619)或SEQIDNO.33(MOR02715)編碼，或者上述VH區之一的至少一個H-CDR1、H-CDR-2和/或H-CDR3區，或者(ii)通過至少一個H-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區。所述多肽優選具有通過H-CDR2區中的改變衍生且由核酸序列SEQIDNO.25(MOR02619)或SEQIDN0.33(MOR02715)編碼的VH區。這種情況特別優選的是這樣的多肽，其包含(a)VH區(i)其由核酸序列SEQIDNO.63(MOR03243)、SEQIDNO.67(MOR03245)、SEQIDN0.71(MOR03246)、SEQIDNO.75(MOR03251)、SEQIDNO.79(MOR03252)、SEQIDNO.81(MOR03253)、SEQIDNO.83(MOR03255)、SEQIDNO.85(MOR03257)、SEQIDNO.87(MOR03258)編碼，或者上述VH區之一的至少H-CDR2區，或者(ii)通過至少一個H-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區，和/或(b)VL區(i)其由核酸序列SEQIDN0.65(MOR03243)、SEQIDN0.69(MOR03245)、SEQIDN0.73(MOR03246)、SEQIDNO.77(MOR03251aswellasMOR03252、MOR03253、MOR03255andMOR03257)、SEQIDNO.89(MOR03258)編碼，或者上述VL區之一的至少L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區，或者(ii)通過至少一個L-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區。本發明多肽的具體例子如下所述—種多肽，其包含由SEQIDNO.l編碼的VH區及由SEQIDNO.3(MOR02610)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.5編碼的VH區及由SEQIDNO.7(MOR02611)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.9編碼的VH區及由SEQIDNO.ll(MOR02613)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.13編碼的VH區及由SEQIDN0.15(MOR02614)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.17編碼的VH區及由SEQIDN0.19(MOR02616)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDNO,21編碼的VH區及由SEQIDN0.23(MOR02618)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDNO,25編碼的VH區及由SEQIDNO,27(MOR02619)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDNO,29編碼的VH區及由SEQIDN0.31(MOR02622)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.33編碼的VH區及由SEQIDN0.35(MOR02715)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.37編碼的VH區及由SEQIDN0.39(MOR02718)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.41編碼的VH區及由SEQIDN0.43(MOR02721)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDNO,45編碼的VH區及由SEQIDN0.47(MOR02722)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.25編碼的VH區及由SEQIDN0.49(MOR03055)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.25編碼的VH區及由SEQIDN0.51(MOR03066)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQID>3.25編碼的\01區及由5￡0IDNO,53(MOR03075)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDNO,25編碼的VH區及由SEQIDN0.55(MOR03069)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.25編碼的VH區及由SEQIDN0.57(MOR03071)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.33編碼的VH區及由SEQIDN0.59(MOR03064)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.33編碼的VH區及由SEQIDN0.61(MOR03062)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.63編碼的VH區及由SEQIDN0.65(MOR03243)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.67編碼的VH區及由SEQIDN0.69(MOR03245)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.71編碼的VH區及由SEQIDN0.73(MOR03246)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.75編碼的VH區及由SEQIDN0.77(MOR03251)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDN0.79編碼的VH區及由SEQIDN0.77(MOR03252)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.81編碼的VH區及由SEQIDN0.77(MOR03253)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDNO,83編碼的VH區及由SEQIDN0.77(MOR03255)編碼的VR區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。一種多肽，其包含由SEQIDN0.85編碼的VH區及由SEQIDN0.77(MOR03257)編碼的VR區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。—種多肽，其包含由SEQIDNO,87編碼的VH區及由SEQIDN0.89(MOR03258)編碼的VR區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。本發明多肽的VH和VR鏈的產生方法如下所述VH鏈>l區構架從第l-78位核苷酸延伸(即26個氨基酸)；FR1的最后一個密碼子(氨基酸)總是TCC(Cys)。>所述"CDR1區"可以是兩種不同長度，即30個核苷酸(10個氨基酸)(可能存在于VH1A、VH1B、3、4和5家族)或者36個核苷酸(12個氨基酸)(可能存在于VH2、VH4和VH6家族)。>2區構架總是具有33個核苷酸(即1l個氨基酸);FR2的第一個密碼子(氨基酸)總是TGG(Trp);最后兩個密碼子總是CTC.GAG(LeuGlu)。>所述"CDR2區"可以是三種不同長度，即57個核苷酸(19個氨基酸)(可能存在于VH2和VH4家族)、60個核苷酸(20個氨基酸)(可能存在于VH1A、VH1B、3和5家族)，或者63個核苷酸(21個氨基酸)(可能存在于VH6家族)。>3區構架總是具有96個核苷酸(即32個氨基酸);FR3的第三個密碼子(氨基酸)總是ACC(Thr);最后五個密碼子總是TAT.TAT.TGC.GCG.CGT(TyrTyrCysAlaArg)。>所述"CDR3區"可以是幾種不同長度，艮Pl2-69個核苷酸(4-23個氨基酸)(在VH2和VH4所有家族中)、60個核苷酸(20個氨基酸)(可能存在于VH1A、VH1B、3和5家族)，或者63個核苷酸(21個氨基酸)(可能存在于VH6家族)。>4區構架總是具有33個核苷酸(S卩11個氨基酸)，且在所有七個家族中是相同的TGG.GGC.CAA.GGC.ACC.CTG.GTG.ACG.GTT.AGC.TCA。VLK鏈>l區構架從第l-69位核苷酸延伸(即23個氨基酸)；FR1的最后一個密碼子(氨基酸)總是TGC(Cys)。>所述"CDR1區"可以是4種不同長度，即24個核苷酸(8個氨基酸)(可能存在于Vk1和Vk3家族)、27個核苷酸(9個氨基酸)(可能存在于Vk3家族)、39個核苷酸(13個氨基酸)(可能存在于Vk2家族)，或者42個核苷酸(14個氨基酸)(可能存在于Vk4家族)；第一個密碼子(氨基酸)總是AGA(Arg);CDRl區的倒數第二個密碼子(氨基酸)總是CTG(Leu)。>2區構架總是具有33個核苷酸(即11個氨基酸);FR2的前兩個密碼子(氨基酸)總是TGG.TAC(TrpTyr);倒數第二個密碼子總是CCG(Pro)。>所述"CDR2區"總是具有33個核苷酸(即11個氨基酸)，其中前三個密碼子(氨基酸)總是CTA.TTA.ATT(LeuLeuIle)。>3區構架總是具有96個核苷酸(即32個氨基酸);FR3的前三個密碼子(氨基酸)總是GGG.GTC.CCG(GlyValPro);最后三個密碼子總是TAT.TAT.TGC(TyrTyrCys)。>所述"CDR3區"總是具有24個核苷酸(g卩8個氨基酸)，其中第二個密碼子(氨基酸)總是CAG(Gln)。>4區構架總是具有39個核苷酸(g卩13個氨基酸)，且在所有四個家族中是相同的ACC.TTT.GGC.CAG.GGT,ACG,AAA.GTT.GAA.ATT.AAA.CGT.ACG。>l區構架從第l-66位核苷酸延伸(即22個氨基酸)；FR1的最后一個密碼子(氨基酸)總是TGT(Cys)。>所述"CDR1區"可以具有三種不同長度，即33個核苷酸(11個氨基酸)(可能存在于VA3家族)、39個核苷酸(13個氨基酸)(可能存在于VX1家族)，或者42個核苷酸(14個氨基酸)(可能存在于VX1和V人2家族)。>2區總是具有33個核苷酸(g卩ll個氨基酸)；FR2的前兩個密碼子(氨基酸)總是TGG.TACCTrpTyr》第三個密碼子總是GCG(Ala)。>所述"CDR2區"總是具有33個核苷酸(g卩ll個氮基酸)，其中第三個密碼子(氨基酸)總是ATT(Ile)，最后三個密碼子總是CGT.CCC.TCA(ArgProSer)。>3區構架總是具有96個核苷酸(即32個氨基酸)，其中FR3的第一個密碼子(氨基酸)總是GGC(Gly)，最后四個密碼子總是GAT.TAT.TAT.TGC(AspTyrTyrCys)。>所述"CDR3區"可具有三種不同長度，即24個核苷酸(8個氨基酸)、27個核苷酸(9個氨基酸)或者30個核苷酸(10個氨基酸)。>4區構架總是具有39個核苷酸(即13個氨基酸)，且在所有三個家族中是相同的GTG.TTT.GGC.GGC.GGC.ACG.AAG.TTA.ACC.GTT,CTT.GGC.CAG.為了治療或診斷目的，例如在體外或體內診斷中，可以使用本發明的多肽。對于治療性應用，本發明多肽可以是與治療活性成分結合的形式，所述治療活性成分例如選自放療劑或者化療劑，例如低分子量的活性成分或者生物學抑制細胞的活性成分或者胞毒性活性成分。所述治療活性成分與所述多肽的結合可以根據已知方法進行，優選通過與所述蛋白質的反應性氨基、羧基、羥基和/或硫醇基團共價結合，任選根據己知方法使用同源-或者異源-雙官能團接頭。此外，所述多肽也可以是融合蛋白形式，除了抗體例如IgG分子或其片段形式，所述多肽含有與其融合的細胞因子，例如IL2、1112或TNF(x-多肽。另外，所述融合蛋白可以是雙特異性抗體形式，其中除了結合ED-B結構域之外，優選結合另一種抗原。雙特異性抗體的其它抗體特異性是結合針對螯合劑的結構域，所述螯合劑是以下物質的螯合劑診斷或治療相關的放射性核素，例如a-、B-或者Y-發射體，如^Y，診斷性NIR(近紅外線)-染料，具有治療效力的染料，免疫學效應細胞上的表面分子(例如NK細胞、胞毒性T細胞或者NKT細胞)，血管發生相關的整聯蛋白、特別是阻斷其功能的結合結構域(例如a"B3、a^3、a;^、a2B2)，滅活型抗VEGF-結合結構域和針對VEGF受體1、2和3的滅活型結合結構域。對于診斷性應用，所述多肽可以是與診斷性可檢測的標記基團結合的形式，所述標記基團例如是迸行體外或體內診斷的標記基團。所述標記基團的例子是放射性標記基團、NMR-、染料-、酶-及熒光-(例如近紅外光譜中的熒光)標記基團。對于治療性應用，所述多肽優選被配制為藥物組合物，其含有本發明多肽作為活性成分，任選含有另外的活性成分以及藥物學常用載體、佐劑和/或稀釋劑。所述藥物組合物含有治療有效量的活性成分，所述治療有效量可以由本領域技術人員通過簡便的體外測試方法確定，例如在合適的細胞培養物或動物模型中測試。所述組合物的給予優選通過注射或輸注方式進行，但是也可以采用其它類型的給予方式。優選靜脈內和/或皮下注射給予方式。給予的活性成分的劑量依賴于疾病的類型和嚴重性以及治療患者的狀況。所述治療組合物優選在一段較長時間例如至少2-4周內分幾次給予。給予抗體或抗體結合物的相關已知方法參見例如Ferarra,N.etal.,NatureReviewsDrugDiscovery,Volume3，May2004,391-400andSalgaller，M丄.,CurrentOpinioninMolecularTherapeutics20035(6):657-667所述，或者參見現有的給予藥物抗體如Rituximab,CAMPATH,Remicade等的方法。本發明的另一方面提供了包含本發明多肽作為診斷試劑的診斷組合物。另外，所述診斷組合物仍可含有另外的常用診斷試劑、載體、佐劑和/或稀釋劑。所述診斷組合物含有足夠量的所述多肽，以使得可以通過各自的方式例如體內或體內診斷方式進行診斷檢測。在這方面，參考已知的使用標記抗體的體內和體外診斷方法。所述藥物和診斷組合物可以用于治療和診斷ED-B表達例如基質和/或血管周圍ED-B表達相關的所有疾病。這種疾病的例子是過度增殖性疾病，例如與血管發生相關的疾病，特別是癌癥、眼底病、增生性瘢痕等，與肌成纖維細胞功能失調相關的疾病，例如子宮內膜異位癥、動脈硬化斑等，或者炎癥疾病，例如銀屑病、Crohn's病、風濕性關節炎或者多發性硬化。本發明的藥物或診斷組合物可以含有一或多種活性多肽，例如結合ED-B結構域的不同區域的多肽的組合。所述組合物適用于人和獸醫藥領域。本發明另一方面提供了編碼本發明的肽或融合多肽的核酸。這個核酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。所述核酸優選與表達監測序列可操縱地連接，從而可以在合適的宿主細胞或者合適的宿主生物體中表達。所述核酸可以存在于適于導入宿主細胞或宿主生物體中的載體上。所述載體可以例如是適于導入原核細胞中的原核細胞載體，例如質粒或噬菌體。相反，所述載體也可以是適于導入真核宿主細胞或宿主生物體中的真核細胞載體，例如質粒、人工染色體或病毒載體。合適的載體為本領域技術人員所已知，例如Sambrooketal.(1989)，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress禾口Ausubeletal.(1989)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons所描述。本發明另一方面提供了用本發明的核酸或載體轉化的細胞，例如原核細胞或真核細胞，例如人細胞。本發明再一方面提供了用本發明的核酸或載體轉化的非人生物體，例如轉基因動物。在這種情況中，本發明范圍內術語"轉化"的含義包含將外源核酸導入細胞或生物體的所有可能方式，包括轉染或說明書第16/30頁感染。通過在所述多肽表達的條件下培養本發明的細胞或非人生物體，然后從例如所述細胞、培養基、生物體或生物體的排泄物中獲得所述表達的多肽。另外，通過如下的附圖和實施例對本發明加以解釋。圖l圖示出鑒別功能活性抗體的抑制試驗。將得自皮膚微血管的人內皮細胞(人真皮微血管內皮細胞，HDMVEc)與ED-B特異性Fab抗體片段一起保溫。結合的細胞數通過結晶紫染色法觀測并在光度計中測量。高顯色強度是指有較多的粘附細胞且無結合阻斷抗體。低顯色強度是指有較少的粘附但具有結合阻斷抗體。圖2示出通過Fab片段展示法鑒別ED-B-纖連蛋白-功能阻斷抗體的掃描圖。第一步，用重組ED-B進行淘選程序。對以此方式獲得的抗體片段進行特異性試驗(ELISA)、功能性粘附試驗以及免疫組織化學研究。然后，確定進行這些試驗的抗體的親和性。接著，對CDR結構域進行改變以改良親和性，其中親和性成熟1是指L-CDR3結構域中的改變，親和性成熟2是指H-CDR2結構域中的改變。將通過親和性成熟之后獲得的抗體進行上述試驗，然后測試體內效力。圖3示出使用通過用重組ED-B淘選產生的抗體Fab片段進行ELISA特異性試驗的結果。ED-B是指與重組ED-B結合，6-FN是指與重組纖連蛋白-結構域6結合，結構域7-8-9是指與重組纖連蛋白結構域7-8-9(無ED-B)結合，結構域7-EDB-8-9是指與重組纖連蛋白結構域7-8-9(有ED-B)結合。ED-B與6-FN或7-8-9的比率產生所研究抗體的特異性。AP-39是指生物學失活的抗-ED-BscFv抗體L19的共價二聚體。圖4示出用所研究的抗體進行粘附試驗的結果。所述試驗測試了25pg/ml濃度的所述Fab片段或者0.4ng/ml濃度的Fab對于HDMVEc細胞與ED-B包被的平板粘附的抑制作用。所示值是3次確定的結果。圖5示出在MOR02616的實施例中，功能阻斷性抗ED-B-Fab片段的免疫組織化學反應模式。圖5A和5C示出了陰性對照組(陰性HuCAL-Fab)的結果，圖5B和5D示出了抗體MOR02616對于人成神經細胞瘤細胞-IRM異體移植物(圖5A和5B)以及對于小鼠F9-畸胎癌細胞(圖5C和5D)的結果。將細胞的冰凍切片(厚度10pm)通風干燥，然后置于冰凍的丙酮中IO分鐘。接著，將該切片于PBS中洗滌，與2嗎/m啲MOR02616或者陰性對照在室溫保溫60分鐘。將二抗-過氧化物酶標記的多克隆山羊抗人F(ab)2抗血清(于PBS中1:100稀釋，Dianova)與作為生色底物的二氨基聯苯胺(SigmaChemicals)組合使用。圖6示出通過成熟優化的抗體Fab片段的ELISA特異性試驗的結果。所述試驗的實施程序在圖3中描述。圖7示出了通過成熟優化的抗體Fab片段MOR03255于F9-畸胎癌細胞的冰凍切片上(圖7A)及于無毛小鼠中SKMEL-28人黑素瘤細胞異體移植物上(圖7B)的免疫組織化學反應模式。所述試驗的實施程序在圖5中描述。圖8示出本發明的抗體Fab片段與對照抗體L19和Ly60.3的粘附試驗結果。所述試驗的實施程序與在圖4中所述程序非常相似。所述抗體濃度為lpl/ml、10nl/ml或20pl/ml。圖9示出本發明的抗體-Fab片段在人血漿或PBS中在37。C保溫4小時后的穩定性。免疫反應性在ELISA中確定，濃度范圍是0.039-5pg/ml。將在不保溫的條件下人血漿中濃度0.62pg/ml的信號作為100Q/。值。圖10示出抗ED-B功能阻斷性Fab抗體片段于MOR03255實施例中的治療效力。圖11示出編碼本發明抗體的VH和VL區的核苷酸序列。實施例l.材料和方法l.l蛋白質與抗體根據標準方法(例如Sambrooketal.，MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourPress),產生純化的重組纖連蛋白結構域ED-B(His)6、纖連蛋白結構域6(6FN)、纖連蛋白結構域7-8-9及結構域7-ED-B-8國9。根據標準方法產生小鼠抗純化的ED-B受體的抗體，即給予在Freimd's完全佐劑中的50嗎純化的受體，3周后給予在Freund，s不完全佐劑中的25ng純化的受體，再3周后所有應用在不完全佐劑中經腹膜內給予。在第三次免疫接種后14天，經框后竇(postorbitalsinus)取血樣。血漿纖連蛋白購自Sigma公司。1.2ED-B特異性噬菌體的選擇根據HuCAL^GoldPhage選擇方案進行選擇。將HuCAI^GoldLibrary再分為6個構架特異性集合。所述ED-B-特異性噬菌體在固定于96孔平板(Maxisorb，Nunc,Rochester,NY，USA)中的重組蛋白質的三次連續的選擇循環中濃縮。為了淘選A，將所述平板用1嗎/孔的ED-B(His6)(10pg/ml于紐1^&@中)在37。C包被2小時。為了淘選B，將所述平板用于PBS中相同濃度的ED-B(pH7.2，具有lmmol的MgCl2/lmmol的CaCl2)在4。C包被過夜。將所述平板用在PBS中的5%脫脂奶粉溶液、0.05%Tween20(Sigma,St丄ouis,MO,USA)(封閉液)封閉，與預先已經與l體積的封閉液保溫的lX1013HuCALGold噬菌體一起保溫。為了淘選B，將所述噬菌體另外與0.5pg/ml纖連蛋白-結構域6預保溫，以減少特異于纖連蛋白3型結構域重復的保守結構的結合分子的選擇。在與所述噬菌體在室溫保溫2小時之后，將孔用PBS、0.05。/。Tween20洗滌5次，并再用PBS洗滌5次。剩余的噬菌體用于10mmol的tris/HCl(pH8.0)中的20mmol的二硫蘇糖醇(DTT)在室溫洗脫10分鐘。然后，與大腸桿菌TG-1(Stratagene,OD6Q(^0.5)—起保溫以進行感染。接著，將孔與大腸桿菌TG-1—起保溫作為另外的洗脫步驟。1.3噬菌粒回收，噬菌體擴增和純化將DieHuCALGold噬菌體在具有34jig/ml氯霉素和1。/。葡萄糖的2XTY培養基(2XTY-CG)中擴增。在用輔助噬菌體(VCSM13)在37。C及大約為0.5的OD60()條件下感染后，離心并再懸浮于2XTY-CG/50pg/ml卡那霉素中，將細胞用0.2511111101的1丁0誘導并在22°<:培養過夜。利用聚乙二醇從上清中沉淀出噬菌體(Ausubeletal.(1998),CurrentProtocolsofMicrobiology),將其再懸浮于PBS中并用于隨后的選擇循環。1.4選擇的Fab片段的亞克隆及可溶的Fab片段的表達將選擇的HuCAI^Gold噬菌體的Fab編碼插入體亞克隆在表達載體pMORPHx9-FS中。選擇的HuCALGold克隆的質粒-DNA制品用限制酶XbalI/EcoRI切割，從而切掉所述Fab編碼插入體(ompA-VL和phoA-Fd)。在這個載體中表達的Fab分子含有兩個C末端標記(FLAGTM和Strep-tag11)，以進行檢測和純化。1.5HuCALGold抗體在大腸桿菌中的表達和純化在具有0.751的2XTY培養基和34pg/ml氯霉素的搖瓶中進行pMORPHx9-FS-編碼的Fab片段在大腸桿菌TG-lF細胞中的表達。在用0.75mmol的IPTG誘導后，將細胞在30。C培養16小時。或者，將得自第二成熟集合2的Fab克隆用0.1mmol的IPTG誘導，然后在22。C培養。通過滲透休克法從細胞沉淀中產生周質提取物，Fab片段通過Strep-Tacti^層析法(IBA,G6ttingen，Germany)分離。表觀分子量通過具有校準標準的大小排阻層析法(SEC)確定。濃度通過UV光譜法確定。1.6通過ELISA鑒別ED-B結合的Fab片段將96孔MaxisorbELISA平板用IOOnl的ED-B溶液(10嗎/ml于包被緩沖液(PBSpH7.4，lmmol的CaCl2，1mmol的MgCl2)中)在4。C包被過夜。加入粗溶解產物或者純化的Fab分子；未結合的Fab分子通過用洗滌緩沖液(PBSpH7.4，0.05%Tween20)洗滌5次而除去。通過與抗人Fab抗體-過氧化物酶結合物(Dianova)保溫，隨后用可溶的過氧化物酶底物(Roche)顯色及在370nm測量而檢測所述Fab片段。表達ED-B特異性Fab分子的克隆通過固定的ED-B上陽性ELISA信號對應在6FN的較弱或無信號而鑒別。1.7在生理學溫度條件下通過ELISA確定血漿穩定性基本如上述用ED-B(2.5ng/ml)進行包被。將Fab片段在人血漿(GermanRedCross;Batch9985550)中在50嗎/ml濃度下37。C保溫4小時。在保溫后，根據ELISA所需，將Fab分子稀釋為濃度為在具有P/。牛血清白蛋白的PBS中5.0、2.5、1.25、0.62、0.31、0.156、0.078和0.039pg/ml，以確定信號強度的線性區域。使用抗-FlagM2抗體(SigmaF3165)和二級抗小鼠抗體-堿相結合物確定功能性Fab分子，隨后用Attophos(Roche)顯色，并在535nm進行測量。1.8HDMVEc細胞培養及細胞粘附試驗將分離自幼兒包皮的人真皮微血管內皮細胞(HDMVEc)在用0.1。/。凝膠(Sigma)包被的容器中的EGM-MV培養基(Clonetics,Inc.)中培養，所述培養基中添加了10%胎牛血清、2mmol谷氨酰胺、20嗎/ml肝素和3ng/ml的bFGF。為了進行粘附試驗，使用經培養傳代不超過8代的細胞。在96孔ELISA平板中，將ED-B(10嗎/ml)或血漿纖連蛋白(2.5pg/ml)在PBS(pH7.4)、0.9mmol的CaCl2、0.5mmol的MgCl2中在4。C固定過夜，并用在PBS(pH7.4)中的l。/。RSA、0.9mmol的CaCl2、0.5mmol的MgCl2在37。C封閉l小時。將細胞用0.15嗎/ml鈣黃綠素在37。C標記30分鐘，于粘附培養基(MCDB131，2mmol谷氨酰胺，0.1%RSA，20pg/ml肝素)中洗滌一次。將lX105個細胞與在每種情況中指定濃度的抗體在37。C保溫20分鐘，于粘附培養基中稀釋(終體積為100pl)。在37'C將細胞懸浮液加入在的ED-B-包被的平板2小時。將細胞在PBS(pH7.4)、0.9mmol的CaCl2、0.5mmol的MgCl2中洗滌2次后，利用平板熒光計(激發485nm;發射530nm)檢測粘附細胞。作為對照，(A)確定不添加特異性抗體條件下與配體包被的平板結合的細胞，(B)確定無配體包被的條件下與孔粘附的細胞，在最后提及的對照中獲得的值作為細胞粘附的最小值。1.9通過逐步CDR盒置換選擇的Fab分子的親和性成熟為了增加選擇的抗體的親和性和生物學活性，使用三核苷酸定點誘變方法通過盒誘變方法優化CDR區。為此，將來自噬菌粒載體pMORPH-23中表達載體pMORPHx9的Fab片段使用EcoRI/Xbal限制位點克隆。為了優化選擇的Fab片段的親和性，對每個成熟集合進行兩個連續步驟。第一步，產生抗體片段-噬菌體文庫，其中起始克隆的L-CDR3區通過7X108(集合1)和3.8X108(集合2)各個輕鏈-CDR序列的庫(repertoire)而改變。然后，將通過第一個成熟步驟親和性得以改良的衍生物暴露于第二個成熟循環，H-CDR-2區域由多種多樣的元件置換。在這種方式中，每種情況產生具有lX108個單獨克隆的兩個噬菌體文庫。通過轉化進大腸桿菌TOP10F中產生親和性成熟文庫。噬菌體如上述產生。在嚴格條件下第一次成熟進行三次循環，第二個步驟進行兩次循環，以選擇具有改良的親和性的Fab片段。1.10通過表面等離子共振(BIAcore芍確定親和性為了確定KD值，使用Fab片段的單體部分(至少80n/。單體含量，通過分析性SEC確定；Superdex75,AmershamPharmacia)。使用標準的EDC-NHS-胺-結合化學方法，將Fl-芯片(Biacore,Sweden)用大約200RU的ED-B(30嗎/ml，10mmol乙酸鹽緩沖液，pH4.0)包被，參考流動池用相應量的人血清白蛋白(20Mg/ml，lOmmol乙酸鹽緩沖液，pH4.5)包被。抗原密度降低為大約IOORU以進行二次成熟的Fab鑒定。使用10mmo1的HC1進行再生。所有動力學測量均在PBS緩沖液(136mmol的NaCl，2.7mmol的KCl，10mmol的Na2HP04，1.76mmol的KH2P04.pH7.4)中迸行，流速為20pl/分鐘，使用1.5-500nmol濃度的Fab。在每種情況中注射時間為l分鐘。利用BIA評估軟件3.1評估所有sensogramso縮寫EDC:l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺；NHS:N-羥基琥珀酰亞胺；RU:共振單位。2.結果2.1人ED-B抗體的產生進行兩種不同的淘選分析。第一種分析(淘選方法A)中的ED-B包被是根據從其中ED-B以使得HDMVEc細胞與固定的抗原粘附的構象存在的生物學試驗已知的條件進行。在第二種淘選分析(B)中，進一步加入過量的6FN阻斷噬菌體，以避免選擇與纖連蛋白-結構域6交叉反應的結合分子。總之，從1315個原始采樣中發現23個不同的HuCAL-Fab分子，其符合與ED-B結合但是與6FN不結合的標準。另外，檢測抗體結合重組表達的纖連蛋白的能力，所述重組表達的纖連蛋白在其天然排列中包含結構域7、8和9，有和無插入的ED-B結構域(見圖3)。所有檢測的抗體均示出特異性識別7-ED-B-8-9構建體，但是與無ED-B結構域的相應構建體不反應。2.2ED-B特異性結合分子的功能鑒定對在ELISA中特異性鑒別的抗體進行純化并測試其阻斷HDMVEc細胞與ED-B包被的平板粘附的能力。檢測在存在兩種濃度的ED-B特異性Fab片段的條件下HDMVEc細胞的粘附，與非特異性HuCAL-對照Fab分子和陽性小鼠對照血清進行對比。在2.1段落中描述的23個Fab分子中的12個分子示出在固定的ED-B中細胞粘附受抑制。六個最有效的Fab分子的代表性選擇示于圖4。在25iig/ml濃度，細胞粘附被抑制50%至幾乎100%抑制。在0.4pg/ml濃度，僅幾個Fab分子例如MOR02610、MOR02616、MOR02715和MOR02718示出可再現的細胞粘附抑制作用。功能阻斷性Fab抗體片段通過免疫組織化學方法針對其在F9-小鼠-畸胎癌細胞和人IRM30成神經細胞瘤-異體移植冷凍切片上的定位加以鑒定。所有測試的抗體均示出在兩個組織切片上的血管定位，但是在正常組織上無血管染色(例如在正常的和硬化的肝臟和皮膚上)。在圖5B和5D中，示出了通過MOR02616的血管周圍近腔染色、增殖的內皮和腫瘤基質。可以檢測到指數生長中的腫瘤的新血管結構附近ED-B的集合，但是在正常血管附近未檢測到這種情況。使用相同濃度的溶菌酶陰性對照抗體未觀測到染色(圖5A和5C)。12個選擇的結合分子的性質通過BIAcore分析加以確定(見表l)。親和性(Kon)為15-500nmol。二價L19衍生物AP39(ED-B的無生物學活性的比較抗體)的親和性經確定為2.4nmol。表l還示出了CDR序列(僅L-CDR3和H-CDR3)及構架組合。對不同批次的Fab分子進行至少兩次單獨測量蛋白質表達和蛋白質純化。所述Fab分子的結合率(Kon)和解離率(Koff)在獨立的縱列中示出。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>2.3通過優化L-CDR3和H-CDR2區對功能阻斷性ED-B抗體進行親和性成熟以兩個步驟進行Fab分子的親和性成熟。首先，使L-CDR3序列多樣化，然后置換在第一步中獲得的改良的Fab分子的H-CDR2序列。產生進行每個步驟的兩個親和性成熟文庫。在兩個單獨的集合中進行優化。具有7X108個元件程度多樣性的L-CDR3文庫l含有4個起始Fab分子MOR02610、MOR02616、MOR02619和MOR02622。L-CDR3文庫2具有3.8X108個元件程度的多樣性，僅含有MOR02715和MOR02718的衍生物。在每種情況中根據其在粘附試驗中的親和性及生物學活性組合Fab分子。在選擇程序期間，所述兩個文庫單獨進行選擇。在這種情況中，進行兩種淘選方法。淘選方法I使用固定于maxisorb平板上的ED-B進行三次循環，如先前所述。淘選方法n是在溶液中選擇生物素酰化的ED-B。在這種情況中，噬菌體-抗原復合物在第一次循環中通過鏈親和素包被的顆粒回收，在隨后的兩次循環中在中性抗生物素蛋白平板上回收。在選擇程序中使用嚴格條件。通過在BIAcore系統中確定Kof^i篩選優化的Fab分子。總之，鑒定了文庫l的ll個衍生物。具有最高親和性的5個衍生物示于表2。在這種情況中，全部改良的克隆均是MOR02619的衍生物，親和性增加直至7倍。在克隆MOR03075中，發現親和性為2.4nmo1。從文庫2中，詳細分析了MOR02715的兩個衍生物。對于克隆MOR03062，發現親和性增加15倍，因此獲得單體親和性為2.4nm。L-CDR3區的氨基酸序列中的改變示于表2a和2b。表2a淘選集MOR0初始克隆LCDR3Kon1/MsKoff1/sjKD[nml相對于親代克隆合l改良倍數KonKoffKDAP39-生QQTGRI陽-PP6.6E+051.49E-0032.4±0.6物素2619QSWDGAS-TG7.8E+051.2E-0215.4±0.6固體30552619QAWTRAHRYP1.8E+065.1E-033.0±0.52.22.65.4溶解的30662619SSYD-T()VTRUE+064.7E-034.2±0.61.42.83.8溶解的30752619QSWDP-RSFTUE+062.6E-032.4±0.31.45.06.8溶解的30692619WTGM--SYHF1.2E+064.1E-033.3±0.21.53.24.8溶解的30712619LAYK)S-KGH1.9E+065.7E-033.1±0.82.32.35.1表2b淘選集MORO親代克隆LCDR3Kon1/MslKoff[1/s]KDlnml相對于親代克隆合2改良倍數KonKofTKDAP39-生物QQTGRI--PP6.75E+051.49E-032.4±0.6素271SQAWDNQGMKY9.9E+054.7E-0253.7±1.7固體30642715QSWDLLAPSV1.5E+061.4E-0210±3.51.73.55.3固體30622715QSWDLSVHQV3.5E+0.61.1E-023.4±0.84.04.215.8經過第一次成熟循環，所有衍生物對于ED-B的特異性(通過ELISA、免疫組織化學和細胞粘附試驗)未改變。選擇示于表2a和2b的Fab分子進行隨后在兩個集合中的H-CDR2成熟。在集合1中，五個Fab分子活性相似，但是在H-CDR2中具有不同的L-CDR3區(文庫大小為7X107個元件)。對于集合2(文庫大小為8.5X1(T個元件)，選擇兩個Fab分子。如上述單獨選擇所述文庫。親和性增加的結合分子通過在嚴格條件下在溶液中進行兩次淘選循環加以濃縮。三個Fab分子選自集合l。對于衍生物MOR03243和MOR03245，發現大約為0.7nmol的親和性。對于衍生物MOR03246，發現0.6nmol的親和性。相應克隆的H-CDR2序列及親和性數據示于表3a。表3a<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>[注Sequenz-序列]2.4髙親和性功能阻斷性ED-B抗體的鑒定為了測試通過親和性成熟獲得的抗體是否仍然總是特異于ED-B，進行ELISA形式的特異性測試(圖6)、免疫組織化學研究(圖7)和粘附試斷圖8)。在所有這三個試驗中，發現親和性成熟的Fab分子對于ED-B的特異性保持不變。另外，從圖8中看出，兩個親代克隆例如MOR02715和通過親和性成熟產生的克隆如MOR03062、MOR03255、MOR03064和MOR03259比已知抗體L19具有明顯更高的生物學活性(粘附抑制)。另外，測試了人血漿中Fab分子的熱穩定性。為此，將所述Fab分子與人血漿在37。C保溫4小時，通過ELISA確定發現免疫反應性未明顯喪失(圖9)。所有選擇的Fab分子均能以劑量依賴性方式阻斷ED-B上的受體與人微血管內皮細胞的相互作用，這是已知的ED-B抗體L19不具有的性質。由于HDMVEc與胞外基質的粘附是腫瘤血管發生中的早期步驟之意，因此通過本發明的結合分子阻斷這個過程可以產生抑制新血管的形成和抑制腫瘤生長的治療劑。2.5體內作用將F9-畸胎癌細胞(l()6/小鼠，于Matrigel中，有/無100pg的FabMOR03255)經s.c.植入無毛小鼠的側腰部。3天后，在每種情況中每只小鼠用IOOpg的MOR03255對小鼠進行連續7天治療。與溶劑對照相對比，兩個治療組均示出腫瘤生長抑制42-64%。試驗結果示于圖IO。無需進一步詳細描述，確信本領域技術人員可以通過前文描述內容最大程度地利用本發明。因此，前述優選的特定實施方案只是例證本發明而無任何限制本發明之意。在前文描述和實施例中，除非特別指出，則所有溫度均是攝氏度，所有份和百分比均是重量單位。本文引用的所有申請、專利和出版物的全部內容及相應的2005年10月14日申請的德國申請102004050101.7和2005年7月11日申請的美國臨時申請60/697，565的全部內容均并入本文作參考。通過取代本發明在前述實施例中使用的一般或特殊描述的反應物和/或操作條件重復進行所述實施例可獲得相似成功。從前面的描述中，本領域技術人員易于確定本發明的基本特征，在不偏離本發明精神和范圍的前提下，可以對本發明做各種改變和修改以適應不同的用途和條件。參考文獻(1)Browr^LF.;Guidi,A.J.;Schnitt,S.J.;VanDeWater,L.;Iruela-Arispe，M丄.；Yeo,T,K.;Tognazzi,K.;Dvorak,H.F.(1999)Clin.CancerRes.5:1041-1056。(2)Folkman,J.(l995)Nature(Med.)1:27-31。(3)Risau，W.andLemmon，V.(1988)Develop.Biol.125:441-450。(4)VanDenHoff，A.(1988)Adv.CancerRes.50:159-196。(5)Folkman,J.andShing,Y.(1992)J.Biol.Ghem.267:10931-10934。(6)George,E丄.；Baldwin,H.S.;Hynes,R.O.(1997)Blood卯3073-3081。(7)Bowersox,J.C.andSorgente，N.(1982)CancerRes.42:2547-2551。(8)Madri，J.A.;Pratt,B.M.;Tucker,A.M.(1988)J.CellBiol.106:1375-1384。(9)Nicosia,R.F.;Bonnano,E.;Smith,M.(1993)J.Cell.Physiol.154:654-661。(10)Kornblihtt,A.R.;Vibe-Pedersen,K.;andBaralle,F.E.，1983.IsolationandCharacterizationofcDNAClonesforHumanandBovinefibronectins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80，3218-22(11)Leahy,D丄；Hendrickson，W.A.;Aukhil,LandErickson^H.P.,1992.StructureoffibronectinTypeIIIDomainfromTenascinPhasedbyMASAnalysisoftheSelenomethionylProtein.Science,258，987-91。(12)Hynes，R.O.,1987,Cell48,549-550。(13)Plow,E.F.etal.2000，J.Biol.Chem.，275,21785-21788。(14)Castellani,P.;Viale,G.;Dorcaratto,A.;Nicolo,G.;Kaczmarek,J.;Querze,G.;Zardi，L.(1994)Int.J.Cancer59:612-618。(15)Hashimoto畫Uoshima,M.;Yan,Y.Z.;Schneider,G,;Aukhil，1.(1997)J.CellScience110:227-2280。(16)Chen,W.andCulp,L.A.(1996)Exp.CellRes.223:9-19。(17)Chen,W.andCulp,L.A.(1998)Clin.Exp.Metastasis16:30-42。權利要求1.一種多肽，其特征在于(i)其特異性結合纖連蛋白的ED-B結構域；(ii)其抑制ED-B結構域與其受體之間的相互作用。2.權利要求1的多肽，其是抗體或抗體片段。3.權利要求1或2的多肽，其呈現對ED-B結構域的親和性，相應于Ko值《lOOnmol。4.權利要求3的多肽，其呈現對ED-B結構域的親和性，相應于Ko值《10nmol。5.權利要求3的多肽，其呈現對ED-B結構域的親和性，相應于KD值《1nmol。6.權利要求l-5任一項的多肽，其對于纖連蛋白ED-B結構域的特異性比對纖連蛋白結構域6和/或纖連蛋白結構域7-8-9的特異性高至少5倍。7.權利要求l-6任一項的多肽，其示出在體外抑制ED-B與HDMVEc細胞、腫瘤細胞和/或基質細胞的粘附。8.權利要求l-6任一項的多肽，其示出在體內抑制腫瘤的生長，所述腫瘤是在測試動物中通過植入F9畸胎癌細胞而產生。9.權利要求l-8任一項的多肽，其選自包含如下結構的抗體或抗體片段(a)VH區(i)其由核酸序列SEQIDNO.l(MOR02610)、SEQIDNO.5(MOR02611)、SEQIDNO.9(MOR02613)、SEQIDNO.13(MOR02614)、SEQIDNO.17(MOR02616)、SEQIDNO.21(MOR02618)、SEQIDNO.25(MOR02619)、SEQIDNO.29(MOR02622)、SEQIDNO.33(MOR02715)、SEQIDNO.37(MOR02718)、SEQIDNO.41(MOR02721)、SEQIDNO.45(MOR02722)編碼，或者上述VH區之一的至少一個H-CDRl-、H-CDR-2-和/或H-CDR3-區，或者(ii)通過至少一個H-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區，禾卩/或(b)VL區(i)其由核酸序列SEQIDNO.3(MOR02610)、SEQIDNO.7(MOR02611)、SEQIDNO.ll(MOR02613)、SEQIDN0.15(MOR02614)、SEQIDNO.19(MOR02616)、SEQIDN0.23(MOR02618)、SEQIDN0.27(MOR02619)、SEQIDNO,31(MOR02622)、SEQIDNO.35(MOR02715)、SEQIDNO.39(MOR02718)、SEQIDNO.43(MOR02721)、SEQIDN0.47(MOR02722)編碼，或者上述VL區之一的至少一個L-CDRl-、L-CDR2-和/或L-CDR3-區，或者(ii)至少一個L-CDR區中的改變衍生自(i)所述VL區。10.權利要求9的多肽，其具有這樣的VL區，所述VL區通過L-CDR3區中的改變衍生自(b)(i)所述VL區。11.權利要求10的多肽，其具有這樣的VL區，所述VL區衍生自由SEQIDN0.27(MOR02619)或SEQIDNO.35(MOR02715)的核酸序列編碼的VL區。12.權利要求9-U任一項的多肽，其包含(a)VH區(i)其由核酸序列SEQIDNO.25(MOR02619)或SEQIDNO.33(MOR02715)編碼，或者上述VH區之一的至少一個H-CDR1、H-CDR-2和/或H-CDR3區；或者(ii)通過至少一個H-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區，和/或(b)VL區(i)其由核酸序列SEQIDNO.49(MOR03055)、SEQIDNO.51(MOR03066)、SEQIDN0.53(MOR03075)、SEQIDNO.55(MOR03069)、SEQIDN0.57(MOR03071)、SEQIDN0.59(MOR03064)、SEQIDN0.61(MOR03062)編碼，或者上述VL區之一的至少L-CDR3區，或者(ii)通過至少一個L-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區。13.權利要求9-12任一項的多肽，其具有這樣的VH區，所述VH區通過H-CDR2區中的改變衍生自(a乂i)所述VH區。14.權利要求13的多肽，其具有這樣的VH區，所述VH區衍生自由核酸序列SEQIDN0.25(MOR02619)或SEQIDNO.33(MOR02715)編碼的VH區。15.權利要求9-14的多肽，其包含<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(i)其由核酸序列SEQIDNO.63(MOR03243)、SEQIDNO.67(MOR03245)、SEQIDN0.71(MOR03246)、SEQIDNO.75(MOR03251)、SEQIDN0.79(MOR03252)、SEQIDN0.81(MOR03253)、SEQIDNO.83(MOR03255)、SEQIDN0.85(MOR03257)、SEQIDNO.87(MOR03258)編碼，或者至少其H-CDR2區，或者(ii)通過至少一個H-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區，和/或(c)VL區(i)其由核酸序列SEQIDNO.65(MOR03243)、SEQIDNO.69(MOR03245)、SEQIDN0.73(MOR03246)、SEQIDNO,77(MOR03251)、SEQIDNO.89(MOR03258)編碼，或者上述VL區之一的至少L-CDRl-、L-CDR2-或L-CDR3區，或者(ii)通過至少一個L-CDR區中的改變衍生自(i)所述VH區。16.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO.l編碼的VH區及由SEQIDNO.3(MOR02610)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。17.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.5編碼的VH區及由SEQIDNO.7(MOR02611)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。18.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,9編碼的VH區及由SEQIDNO.l1(MOR02613)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L曙CDR2或L國CDR3區。19.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,13編碼的VH區及由SEQIDNO.15(MOR02614)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。20.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.17編碼的VH區及由SEQIDNO.19(MOR02616)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L畫CDR3區。21.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.21編碼的VH區及由SEQIDNO.23(MOR02618)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。22.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,25編碼的VH區及由SEQIDNO.27(MOR02619)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。23.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,29編碼的VH區及由SEQIDNO.31(MOR02622)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。24.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,33編碼的VH區及由SEQIDNO.35(MOR02715)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L國CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。25.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,37編碼的VH區及由SEQIDNO.39(MOR02718)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。26.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.41編碼的VH區及由SEQIDNO.43(MOR02721)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。27.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.45編碼的VH區及由SEQIDNO.47(MOR02722)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。28.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,25編碼的VH區及由SEQIDNO.49(MOR03055)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。29.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.25編碼的VH區及由SEQIDNO.51(MOR03066)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。30.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.25編碼的VH區及由SEQIDNO.53(MOR03075)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。31.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,25編碼的VH區及由SEQIDNO.55(MOR03069)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。32.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.25編碼的VH區及由SEQIDNO.57(MOR03071)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。33.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,33編碼的VH區及由SEQIDNO.59(MOR03064)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。34.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,33編碼的VH區及由SEQIDNO.61(MOR03062)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。35.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.63編碼的VH區及由SEQIDNO.65(MOR03243)編碼的VR區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。36.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.67編碼的VH區及由SEQIDNO.69(MOR03245)編碼的VR區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。37.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.71編碼的VH區及由SEQIDNO.73(MOR03246)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。38.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.75編碼的VH區及由SEQIDNO.77(MOR03251)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L國CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。39.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,79編碼的VH區及由SEQIDNO.77(MOR03252)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L畫CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。40.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.81編碼的VH區及由SEQIDNO.77(MOR03253)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。41.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDNO,83編碼的VH區及由SEQIDNO.77(MOR03255)編碼的VL區或者其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。42.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.85編碼的VH區及由SEQIDNO,77(MOR03257)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。43.權利要求9-14的多肽，其包含由SEQIDN0.87編碼的VH區及由SEQIDNO.89(MOR03258)編碼的VL區或者其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區。44.權利要求l-43任一項的多肽，其是與治療活性成分結合的形式。45.權利要求44的多肽，其中所述治療活性成分選自放療劑或者化療劑。46.權利要求l-43任一項的多肽，其是融合蛋白形式。47.權利要求46的多肽，其是與細胞因子融合的融合蛋白或者是雙特異性抗體。48.權利要求l-43任一項的多肽，其是與診斷學可檢測的標記基團結合的形式。49.權利要求46的多肽，其中所述診斷學可檢測的標記基團選自放射性、NMR-、染料、酶和熒光標記基團。50.藥物組合物，其包含作為活性成分的權利要求l-47任一項的多肽以及藥物學常用的載體、佐劑和/或稀釋劑。51.權利要求50的組合物，其用于預防或治療過度增殖性疾病。52.權利要求50或61的組合物，其用于預防或治療癌癥。53.診斷組合物，其包含作為診斷試劑的權利要求1-43、48或49任一項的多肽。54.權利要求53的組合物，其用于診斷過度增殖性疾病或其傾向。55.權利要求53或54的組合物，其用于診斷癌癥或其傾向。56.權利要求50-55任一項的組合物，其用于人的藥物。57.編碼權利要求l-43或46-47任一項的多肽的核酸。58.權利要求57的核酸，其與表達控制序列可操縱地連接。59.載體，其含有權利要求57-58任一項的核酸。60.細胞，其經權利要求57-58任一項的核酸或者權利要求59的載體轉化。61.非人生物體，其經權利要求57-58任一項的核酸或者權利要求59的載體轉化。62.生產權利要求l-43任一項的多肽的方法，其中將權利要求60的細胞或者權利要求61的非人生物體在使所述多肽表達的條件下培養，并獲得表達的多肽。63.權利要求l-47任一項的多肽在生產預防或治療ED-B-相關疾病的藥劑中的應用。64.權利要求62的方法用于生產預防或治療癌癥的藥劑的應用。65.權利要求1-43、48或49任一項的多肽在生產診斷ED-B相關疾病或其傾向的檢測試劑中的應用。66.權利要求65的應用，其用于生產診斷癌癥或其傾向的檢測試劑。全文摘要本發明涉及重組多肽，特別是結合纖連蛋白的Ed-B-同種型并可阻斷其功能的抗體或抗體片段。另外，本發明還揭示了本發明的多肽的診斷和藥物學應用。文檔編號G01N33/563GK101356271SQ200580052490公開日2009年1月28日申請日期2005年11月9日優先權日2005年11月9日發明者A·門拉德,A·魏德曼,J·普拉斯勒申請人:拜耳先靈醫藥股份有限公司;莫弗西斯股份公司