專利名稱：：用于檢測與膜通道相互作用的分子的分析系統和方法
技術領域：
：本發明涉及用于檢測與細胞膜通道相互作用的分子的分析系統和方法。更具體地，本發明涉及用于檢測離子通道的調節劑的閃爍迫近分析(SPA)系統和方法。
背景技術：
：細胞膜包括很多分子例如營養物、廢棄物和小分子可以通過的通道。離子通道是在所有細胞的膜中都可以發現的膜通道的一個例子。典型的離子通道包括跨膜蛋白或一組選擇性地使離子通過膜的脂雙層的蛋白質。按照通過通道的主要離子，離子通道的例子包括鈉離子(Na+)通道、鉀離子(K+)通道、氯離子(Cl-)通道、和鈣離子(Ca2+)通道。離子通道可以是一直開放的，例如在鉀離子滲漏通道中發現的那樣。離子通道也可以是電壓門控性的，一個例子是鈉離子通道。可替代地，離子通道可以是配體門控性的。配體門控性通道是離子的滲透性對于與特定配體例如神經遞質的結合敏感的離子通道。神經遞質的例子包括但不限于，乙酰膽堿、谷氨酸、甘氨酸、或γ-氨基丁酸。膜通道的類別可以包括非離子傳導，但卻允許其他分子通過來進入和/或透出細胞的膜通道。在通道家族中，離子通道的結構是相同的。每個通道包括不同的蛋白質亞單位，其中該蛋白質亞單位是由可以選擇性地在某些細胞類型中或在生物體發展和生長的某個時期表達的不同基因編碼的。離子通道在形成神經和肌肉細胞的電活動性，以及控制神經遞質和激素的分泌方面發揮關鍵性的作用。由于在脊椎動物中與各種生理過程，例如肌收縮、胰島素從胰臟中的釋放和神經系統中神經遞質的釋放之間的相關性，離子通道的研究對于制藥工業越來越重要。特別地，鈣通道是近來研究的重要靶點，因為它們是特定地調節Ca2+進出細胞的普遍存在的離子通道。Ca2+通過電壓控制進入細胞，Ca2+通道發揮電信號的第二信使的作用起始事件例如收縮、分泌、突觸傳遞和基因表達。鈣通道可以分類為L-型(長效)、T-型(短暫)、N-型(既不是長效也不短暫，或者用于神經元)、P-型(浦肯野細胞)、Q-型和R-型(抗性的)，這是根據各種因素例如激活和失活動力學、離子特異性和對藥物和毒素的敏感性分類的。除了低電壓激活(LVA)通道-T-型通道外，L-、N-、P-、Q-、和R-型通道都是高電壓激活的(HVA)。換句話說，HVA通道的激活閾值一般在-40mv以上。盡管據報道L-型和T-型Ca2+電流是范圍廣泛的細胞類型，但是在神經元中N-、P-、Q-、和R-型電流才是最主要的。設計分析法來鑒定對離子通道特異性調節的新藥物會受到下列事實的干擾離子通道是由多種蛋白質亞單位構成的，僅僅是在通道處于膜的脂雙層中時才能評價離子通道的功能。特別地，該離子通道調節的化合物鑒定分析法會由于下列的因素而變得復雜1)低密度的天然通道表達；2)通過經典的電壓箝位法難以固定(由于它們復雜的內折結構，許多候選的用于研究的離子通道占據了難以鉗住的細胞，這些細胞的例子包括樹突狀細胞、神經末稍細胞和肌細胞)；和3)許多其他通道的電流會掩蔽離子通道較小的電流。現有的鑒定離子通道調節劑的技術是產量、生理學關聯性、敏感性和堅韌性之間妥協的產物。研究離子通道的一種廣泛接受的分析法是膜片鉗位術(Neher(1992)，Neuron，8605-612)。盡管一些公司試圖將膜片鉗過程自動化，但由于當前該實驗程序的電流復雜性和再現性使得其不適合用于高效篩選(HTS)應用。使用電壓敏感性染料或放射性同位素的光學記錄法在電壓門控性離子通道包括鈣通道的研究中變得越來越流行。這些方法更容易自動化，并且為藥物篩選應用提供了更高的效率(當前，高達每天100,000個化合物)，可以為離子通道活性提供更靈敏的分析法(Xu，等人(2001)，DrugDiscoveryToday，61278-12887)。但是，這些分析經常要求藥理學介入以激活所研究的通道，導致可能產生假陽性結果(Denyer等人(1998)，DrugDiscoveryToday，3323-332)。適合HTS的另一種分析技術是競爭性結合測定。典型地，真空過濾法用于定量放射性標記的特定配體與離子通道的結合。配體與留在過濾器上的通道結合，用沖洗緩沖液洗去未結合的游離配體。該方法是比較麻煩的，因為它花費了較長的時間，而且需要較大體積的沖洗緩沖液。此外，分離方法包括用沖洗緩沖液反復洗滌，依次產生了大量的放射性液體廢棄物，不僅處理昂貴，而且對于進行實驗的人也有潛在的健康危險。發明簡述本發明提供一種用于檢測預細胞膜通道相互作用的分子的分析系統和方法。更具體地，本發明涉及一種檢測離子通道的調節劑的閃爍迫近分析系統和方法。在優選的實施方案中，本發明的分析系統和方法可以提供下列優點，例如較高效、降低所需來源和試劑的成本，和減少廢物。在優選的實施方案中，本發明提供可以在單個反應混合物中進行的同質分析。此外，本發明優選提供一種系統，其減少了假陽性結果和/或背景，因此產生了可靠的和可再現的分析結果。在一個方面，本發明提供一種檢測與細胞膜通道相互作用的分子的分析系統，該分析系統包括a.包括一種或多種膜通道的細胞膜；b.載體，包含閃爍體和與細胞膜連接的偶聯劑；c.選擇與膜通道結合的配體，該配體包含激活閃爍體的標記物，其中載體與細胞膜的連接和配體與膜通道的結合導致了從載體的閃爍體中發射，其中，當與膜通道相互作用的受試分子存在時，改變了從載體的閃爍體中的發射。另一方面，本發明提供一種鑒定與細胞膜通道相互作用的分子的方法，該方法包括下列步驟a.提供包括一種或多種膜通道的細胞膜；b.在允許偶聯劑與細胞膜結合的條件下，培養細胞膜和包含閃爍體和偶聯劑的載體；c.在允許配體和膜通道結合的條件下，培養細胞膜和包含激活閃爍體的標記物的配體；d.培養細胞膜和懷疑與膜通道相互作用的受試分子；e.在受試分子存在時和在受試分子不存在時，測定載體的閃爍體中的發射；和f.比較當受試分子存在時從載體的閃爍體中的發射和當受試分子不存在時從載體的閃爍體中的發射。附圖簡述加入并構成本說明書一部分的附屬的附圖對本發明的若干方面進行了解釋說明，其與優選實施方案的描述一起，用于解釋本發明的原理。對附圖的簡要描述如下附圖1的曲線圖，說明的是在各小時里(X-軸)培養時間對于[125I]GVIA與離子通道結合的影響，用每分鐘計數(cpm)來表示(Y-軸)，其中離子通道是在從大鼠腦中分離的細胞膜中，空方格非特異性結合(NSB)；填充格總結合。附圖2的曲線圖，說明的是mg/孔(X-軸)的珠濃度對于[125I]GVIA與離子通道結合的影響，用cpm來表示(Y-軸)，其中離子通道是在從大鼠腦中分離的細胞膜中，空方格非特異性結合(NSB)；填充格總結合。附圖3的曲線圖，說明的是μg//孔(X-軸)的細胞膜濃度對于[125I]GVIA與離子通道結合的影響，用cpm來表示(Y-軸)，其中離子通道是在從大鼠腦中分離的細胞膜中，空方格非特異性結合(NSB)；填充格總結合。附圖4的曲線圖，說明的是微微摩爾，pM(X-軸)的配體濃度對于[125I]GVIA與離子通道結合的影響，用cpm來表示(Y-軸)，其中離子通道是在從大鼠腦中分離的細胞膜中，空方格非特異性結合(NSB)；黑方格總結合；黑三角背景(BKG)。附圖5的曲線圖，說明的是pM(X-軸)的配體濃度對于[125I]GVIA與離子通道結合的影響，用cpm來表示(Y-軸)。該附圖中的數據是附圖4數據的重繪圖。附圖6的曲線圖，說明的是競爭性配體的存在對于[125I]GVIA與離子通道結合的影響，其中離子通道是在從大鼠腦中分離的細胞膜中。競爭性配體濃度的log值在X-軸中表示，[125I]GVIA的結合，單位為cpm在Y軸表示，方格CTX-GVIA；圓CTX-MVIIA；黑三角CTX-MVIIC；空三角ω-Agatoxin。附圖7的曲線圖，說明的是GVIA與細胞膜中[125I]的膜通道的總結合(用方格表示)，和從大鼠中分離的細胞膜的非特異性結合(用三角表示)，用z因素來評價。樣本數在X軸表示，[125I]GVIA的結合，單位為cpm在Y軸表示。附圖8的曲線圖，說明的是使用本發明的一個實施方案，[125I]MVIIA或[125I]MVIIC與離子通道的結合，其中離子通道是在從大鼠腦中分離的細胞膜中。總結合用灰色條來表示，非特異性結合用白色條來表示。附圖9的曲線圖，說明的是使用本發明的一個實施方案，[125I]GVIA或[125I]MVIIA與離子通道的結合，其中離子通道從IMR32細胞中分離出來的。總結合用灰色條來表示，非特異性結合用白色條來表示。附圖10的曲線圖，說明的是[125I]MVIIA與細胞膜中的離子通道的結合，其中該細胞膜與用麥胚凝集素(WGA-Ysi)或聚賴氨酸(PL-Ysi)包被的硅酸釔珠預偶聯。總結合用灰色條來表示，非特異性結合用白色條來表示。發明詳述將引用的所有出版物都通過參考引入本文。除非另有說明，本文使用的所有技術和科技術語都與本發明所屬
技術領域：
普通技術人員的一般理解具有同樣的含義。本文使用的術語“包含”、“含有”、“具有”和“包括”都是開放的和非限制性的。本文使用的“受試分子”是指懷疑與細胞膜通道相互作用的分子，將其用于本文所描述的分析系統和方法。“受試分子”、“受試化合物”、和“懷疑與膜通道相互作用的分子”在本文中是可以互換使用的。本發明的分析系統和方法可以用于檢測與膜通道以任何方式相互作用的受試分子，其中該方式影響了膜通道結合配體的能力，根據對該教導的回顧上述含義將是可以理解的。本文使用的離子通道“調節劑”包括以影響離子通道活性的方式與離子通道相互作用的分子。調節劑的示范性例子包括降低、阻斷、阻止、延遲激活，使其失活，失敏或向下調節通道活性，或者加速或增強離子通道失活的分子，例如通道抑制劑或阻滯劑。調節劑的其他示范性例子包括增加、開放、激活、促進、增強激活，敏化或向上調節通道活性，或延遲或減緩通道失活的分子，例如通道激活劑或開放劑。離子通道“調節劑”與感興趣的膜通道的相互作用可以是直接或間接的。直接相互作用的例子包括分子與膜通道的配體結合位點的結合。間接相互作用包括以影響膜通道與配體結合的方式，與膜通道的其他任意位點之間的相互作用。這些間接的相互作用可以包括例如具有抑制劑或激活劑功能的分子。本文使用的“載體”是包含閃爍體和偶聯劑的物理顆粒。可以提供任意適當結構的載體以摻入閃爍體和偶聯劑，使得閃爍體可用于接受和發射能量，偶聯劑可用于與細胞膜連接。載體的例子是閃爍迫近分析珠(SPA珠)、其可以是商業購買的，例如來自PharmaciaAmersham。也可以考慮其他形式的載體，例如乳膠顆粒或其他結構。任選地，載體可以進一步包括波長移動劑，例如1，4-二(5-苯基-2-唑基)苯；9，10-二苯基蒽；1，4-二(2-甲基苯乙烯基)-苯等等。當存在時，波長移動劑的功能是吸收閃爍體發射的光，和再發射波長更長的光，其可以與在閃爍計數器中使用的光敏監測器更好地匹配。載體的“閃爍體”是一種對射線敏感的試劑，其在射線照射下會閃爍(例如，發射光能)。閃爍體可以是物理或化學地摻入到載體中的。當用放射標記的反應試劑刺激時，受激的閃爍體釋放出可以由閃爍計數器或其他監測裝置例如光電倍增管檢測的光能。閃爍體的例子包括但不限于，載有鈰的玻璃，基于稀土鯨蠟醇的物質例如硅酸釔、鑭系稀土金屬化合物，或閃爍聚合物例如聚(乙烯基甲苯)。閃爍體的例子也包括熒光物質，當將其與放射性標記的反應試劑緊密靠近時，其會被刺激而發出光能。在本發明中有用的熒光材料包括在閃爍計數領域公知的任意的有機熒光物。一般地，可以選擇適當的熒光物質，例如從OrganicScintillationDetection，E.SchramandR.Lombaert，ElsevierPublishingCo.，1963的“有機熒光物”和“有機閃爍體”中選擇。熒光物質的例子包括2，5-二苯唑(PPO)；唑和1，3，4-二唑的衍生物，例如2-(4-叔丁基苯基)-5-(4-聯二苯基)-1-3，4-二唑和2，5-二苯基唑；蒽；9，10-二苯基蒽；對-聯三苯基、對四聯苯基和它們的衍生物；2-(4-聯二苯基)-5-(4-叔丁基-苯基)-1，3，4-二唑(丁基PBD)；PBD；2-(1-萘基)-5-苯基唑(α-NPO)；等等。可以與β射線形式(例如從14C、35S、33p和125I中發射的)的射線使用的優選閃爍體的例子是二苯基唑(PPO)。許多物質可以為載體的閃爍體提供粘合劑、基質或其他載體。適當的粘合物質的例子包括聚丙烯酰胺、丙烯酰胺、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、Sepharose等等。珠，例如Sepharose4B珠是商業可用的(來自PharmaciaFineChemicals，Uppsala，Sweden)。將閃爍體摻入到載體中的方法將取決于下列因素，例如用于形成載體的物質、閃爍體、在載體中需要的閃爍體的負載密度等等。在一種摻入方法中，例如，將閃爍體吸附到形成載體的物質中。根據該特別的實施方案，可以選擇閃爍體的可溶性溶劑。優選地，閃爍體在水中是不溶的，在這些實施方案中，所選擇的溶劑與水是可混溶的。形成載體的物質在溶劑中培養，以使該物質脫水。然后，在能將閃爍體吸附到該物質的條件下，該物質可以在包含閃爍體的溶劑中培養，因此形成了包含閃爍體的載體。排出過量的溶劑，加入水或緩沖鹽水溶液使閃爍體沉淀出來，因此，將閃爍體固定在載體的物質中。將閃爍體集中到載體例如珠中的適當方法在U.S.4,568,649和EP154,734中進行了描述。載體的“偶聯劑”是與細胞膜，例如通過與細胞膜結合而連接的分子。這些連接可以是非特異性的或特異性的。例如，當連接是非特異性時，該連接依賴于細胞膜的一般性質，例如其負電荷。在非特異性連接的一個例子中，聚-L-賴氨酸可以與帶負電荷的細胞膜結合。當是特異性連接時，該連接取決于，例如位于細胞膜表面內或上的特異性蛋白質。例如，麥胚凝集素與在膜表面包含低聚糖的N-乙酰基-β-D-葡糖胺結合；抗生物素蛋白鏈菌素與生物素化的蛋白質、肽和寡核苷酸結合；金黃色釀膿葡萄球菌蛋白A可以用于與抗體-抗原絡合物結合；和可以選擇在細胞膜的特異性位點結合的抗體。偶聯劑的例子包括聚-L-賴氨酸、麥胚凝集素、抗生物素蛋白鏈菌素、金黃色釀膿葡萄球菌蛋白A、抗體等等。盡管文獻已經報道了偶聯劑與細胞膜結合的能力，但本發明并不要求在偶聯劑和細胞膜本質上有結合作用。相反，在偶聯劑和在其表面保留有載體的細胞膜之間任意連接，以進行本發明的分析，對于本發明都是合適的。在優選的實施方案中，偶聯劑與細胞膜的親和力的范圍是約50nM到約1pM。可以用任意適當的方法將偶聯劑與載體連接，這取決于下列因素例如用于形成載體的物質、閃爍體、所選擇的特定偶聯劑、偶聯劑的需要的負載密度等等。在一些實施方案中，用連接劑例如溴化氰、碳二亞胺、鞣酸、戊二醛、或聚乙二醇將偶聯劑摻入到載體中。可以將連接劑摻入到載體中，以與需要的偶聯劑共價結合。在摻入偶聯劑后，可以使用阻滯劑(例如甘氨酸)來阻斷珠上剩余的激活位點，因此減少了細胞膜與載體的直接結合，而不是與偶聯劑的結合。可以將偶聯劑摻入到載體的物質中。所述摻入可以是物理(例如，嵌入)或化學的(例如，化學結合)。可替代的，偶聯劑可以包被到載體的表面。將偶聯劑摻入到載體中的方式并不是關鍵性的，只要根據本發明的分析方法，偶聯劑可以有效地與細胞膜連接即可。在一個說明性的實施方案中，用溴化氰激活Sepharose4B珠，通過將載體置于包含蛋白A或抗體的溶液和適當的緩沖液中，以便將金黃色釀膿葡萄球菌蛋白A或細胞膜蛋白質的特異性抗體形式的偶聯劑摻入到載體中。然后，洗去過量的蛋白A(或抗體)，用適當的阻滯劑例如甘氨酸阻斷沒有與蛋白A(或抗體)連接的載體剩余的激活位點。本文中使用的“激活閃爍體的標記物”是一種能激活閃爍體并與膜通道的配體連接的的試劑。根據在載體中包括的閃爍體的類型來選擇激活閃爍體的標記物。例如，激活閃爍體的標記物可以包含放射性同位素。優選的放射性同位素在水中僅有有限的放射性，以使得在大部分情況下僅僅是結合到膜通道的標記的配體上的放射性同位素在實際上激活了在其上結合的載體的閃爍體。適當的放射性同位素的例子包括125I、3H、14C、59Fe、33P、35S、38Sr等等。在一個優選的實施方案中，當所選擇的閃爍體是PPO時，可以使用發射β射線的同位素或γ射線發射中的俄歇電子。用適當的方法將激活閃爍體的標記物摻入到配體中，該方法基本上不會影響配體結合膜通道的能力(例如特異性)。用于標記的方法可以根據所使用的激活閃爍體的標記物的類型而不同。例如，放射性同位素的標記可以通過用相應的放射性同位素取代配體的一個原子而實現。根據該特別的實施方案，例如用氘(3H)取代一個或多個氫原子，用碳-14(14C)取代一個或多個碳原子，或用鍶-38(Sr)取代一個或多個鍶原子。在另一個實施方案中，與在配體中取代原子相反，可以將同位素加入到配體中。一般使用的放射性同位素的例子是碘-125(125I)和鐵-59(59Fe)。在生物學有機體或者這些有機體的一部分能合成蛋白質時，可以通過將有機體和適當的放射性標記前體例如蛋氨酸-35(35S)一起培養來進行標記，以使得有機體將同位素摻入到其產物中。本發明提供檢測與膜通道相互作用的分子的系統和方法，在優選的實施方案中，本發明涉及檢測與離子通道相互作用的分子的系統和方法。為了解釋說明，本發明也將其描述成了離子通道調節劑。但是，根據本發明的顯而易見地，利用所述技術，本發明的分析系統和方法可以用于鑒別許多不同類型的分子，其與任意類型的膜通道相互作用。本發明的分析系統和方法用于檢測與細胞膜通道相互作用的分子。在優選的實施方案中，本發明的分析系統和方法用于鑒定離子通道的調節劑。本發明提供一種鑒定與膜通道相互作用的分子的方法，該方法包括下列步驟(a)提供包括一種或多種膜通道的細胞膜；(b)在允許偶聯劑與細胞膜結合的條件下，培養細胞膜和包含閃爍體和偶聯劑的載體；(c)在允許配體和膜通道結合的條件下，培養細胞膜和包含激活閃爍體的標記物的配體；(d)培養細胞膜和懷疑與膜通道相互作用的受試分子；(e)在受試分子存在時和在受試分子不存在時，測定載體的閃爍體中的發射；和(f)比較當受試分子存在時從載體的閃爍體中的發射和當受試分子不存在時從載體的閃爍體中的發射。收集步驟(f)的信息用于評價與感興趣的細胞膜相互作用的分子。在優選的實施方案中，本發明用于檢測膜通道的調節劑。一般說來，一方面，本發明利用了2個部分，載體和配體，它們優選在細胞膜上相互作用，來輸出指示受試化合物與膜通道相互作用的信息。利用摻入到載體中并包含閃爍體的偶聯劑將載體與細胞膜連接。配體與細胞膜的膜通道特異性結合，并包含激活閃爍體的標記物。設計該分析，以利用(載體的)閃爍體和(配體的)激活閃爍體的標記物之間的空間間隔來確定調節劑與感興趣的膜通道之間的相互作用。在一個說明性的實施方案中，配體的激活閃爍體的標記物是放射性同位素，例如125I。125I-標記的配體與膜通道結合，載體與細胞膜結合。當125I發射波長為λ1的射線時，載體就接收到了該射線，然后載體的閃爍體發射可以檢測的波長為λ2的熒光輻射。由于在水中125I射線的平均范圍相對較短，懸浮著的反應物的任何水性介質都可以作為發射的有效吸收體。結果，未結合的125I將不能形成可檢測的信號輸出；相反，未結合的125I中的發射將會被水性介質吸收。可以用測定125I的能量門控的標準液體閃爍計數系統來進行輸出信號的檢測。一般地，當激活閃爍體的標記物發射的能量在水中具有有限范圍的距離時，未結合的配體典型地距離閃爍體太遠而不能刺激閃爍體。結果，在測定分析信號前就不需要洗去膜絡合物或除去包含激活閃爍體的標記物的未結合的配體。因此，該分析系統和方法提供了一種同質的系統，在分析結果讀數前避免了另外的洗滌和/或分離步驟。優選地，載體具有適合所述接近分析的大小。例如在優選的實施方案中，優化載體的典型直徑，以允許在載體中包含的閃爍體能足夠地物理接近標記的配體，當載體和標記的配體分別與細胞膜和膜通道連接時，使激活閃爍體的標記物發射的能量可以到達載體的閃爍體，和導致閃爍體發射能量。典型地，載體的直徑小于閃爍體的激活范圍。例如，聚(乙烯基甲苯)(PVT)珠的典型直徑是約5μm，而硅酸釔(YSi)的典型直徑是約2.5μm。在優選的實施方案中，載體的濃度范圍是分析反應溶液的約0.75-5mg/ml。優選地，載體與細胞膜培養的溫度范圍是室溫(20-25℃)到約37℃，pH條件是約4到約8。本發明提供競爭性結合測定來檢測與感興趣的膜通道相互作用的分子。如上述討論，標記的配體與感興趣的膜通道結合。當在分析混合物中存在分子和標記的配體并且存在與感興趣的膜通道相互作用的分子時，因此，兩個部分將獲競爭性地與膜通道結合。一般地說，如果該分子與膜通道相互作用(例如，結合或以其他方式影響與配體的結合)時，標記的配體將保留在溶液中。由于在水性溶液中激活閃爍體的標記物發射較短，因此溶液中標記物的發射將會在溶液中終止，并不能增加要檢測的任意輸出信號。換言之，根據下列的方法來測定配體與載體的接近當配合和載體都在激活范圍內時，配體誘導載體的閃爍體發射可檢測的能量。激活范圍是與反應溶液中激活閃爍體的標記物中發射的范圍相同的載體的距離。該分析是根據對發生兩個事件形成的絡合物的測定(1)標記的配體與膜通道的結合和(2)載體與細胞膜的結合，形成了配體/膜通道-載體/細胞膜絡合物。可以利用該測定來檢測一種或多種分子，其通過相互性作用，競爭性地取代標記的配體至激活范圍以外的位置。如果一種或多種分子與膜通道相互作用(例如，結合)，取代的標記的配體將不能與膜通道結合，因此保留在溶液中和激活范圍之外。因此，水性的反應溶液將會吸收標記的配體中的發射。從載體的閃爍體中的輸出信號也相應地減少。另一方面，如果一種或多種分子沒有與膜通道相互作用，將會有更多的標記的配體與膜通道結合，因此在激活范圍之內。從載體的閃爍體中的輸出信號也相應地增加。優選地，可以通過到達監測器的λ2帶輻射的強度(或通過與標準曲線比較來確定)來推斷形成的標記的配體/膜通道-載體/細胞膜絡合物的程度。在本發明的實施方案中，反應介質是含水的，分析期間pH的范圍是約3到約9，介質的溫度范圍是約25℃到約37℃。根據本發明，在允許偶聯劑與細胞膜連接的條件下，培養細胞膜和包含閃爍體和偶聯劑的載體。該細胞膜包含一種或多種通道。根據本發明，細胞膜可以包含完整細胞，部分的細胞膜，和/或膜囊。可以從任意適當類型的動物細胞，包括人、大鼠等等中獲得細胞膜。可以分離完整細胞，并用細胞制備領域已知的方法來處理，包括全組織的機械或酶分裂，或細胞培養。在一些實施方案中，例如當細胞膜制備方法可能破壞或使細胞受體失活時，優選可以利用完整細胞作為細胞膜的來源在一些優選的實施方案中，可以在可控的條件下破壞膜，得到部分的細胞膜和/或膜囊。在一些實施方案中，部分的細胞膜和/或囊可以為本發明的分析和方法提供更簡單的形式，因為在分析期間不用過多地關注細胞溶解和/或切力。細胞膜可以來自組織和/或培養的細胞。破壞細胞膜并使它們穩定的方法是本領域已知的。處理組織得到細胞膜的方法也是本領域已知的。包含在細胞膜內的膜通道可以是通過細胞內源性表達的天然膜通道，或誘導進入細胞的外源性DNA重組表達的膜通道。細胞膜的分離是本領域已知的，用于膜通道(例如離子通道)的構建重組宿主細胞的方法也是本領域已知的。在另一個實施方案中，可以把膜通道摻入到人造膜中(參見Cornell，BA等人(1997)，Nature387，580-583)。例如，這些人造膜可以包括拴在包含離子通道的類脂膜上的電極，并形成離子儲庫。本發明的分析系統和方法可以用于各種的膜通道。這些膜通道包括離子通道、配體門控通道等等。當本說明書用一個特定種類的通道，例如離子通道描述本發明時，顯而易見地本文的技術也可以用于在細胞膜中存在的各種膜通道。在本發明優選的實施方案中，在每200μl分析反應溶液中存在0.5μg或更多的細胞膜。優選地，在每200μl分析反應溶液中存在約0.5到約20μg的細胞膜。在另一個方面，細胞膜優選的濃度是約2.5mg/ml或更大，優選范圍是分析反應溶液的約2.5到約100mg/ml。在細胞膜中包含的膜通道的量將根據細胞膜的來源而不同。例如，在天然產生的細胞膜中，細胞膜制品中通道的濃度可以根據種類而不同(例如人與大鼠膜)。當確定在分析中包含的細胞膜的量時，可以考慮膜的來源，以達到需要的膜通道濃度。根據本發明，在允許配體和膜通道結合的條件下，培養細胞膜和包含激活閃爍體的標記物的配體。為了本文的討論，包括激活閃爍體的標記物的配體也可稱作“標記的配體”。選擇該配體來與感興趣的膜通道結合，在一些特別的實施方案中，該配體甚至能阻斷貫穿膜通道的電導性。除了當它們靠近時能夠刺激閃爍體的激活閃爍體的標記物外，本發明的配體基本上是生物學和化學鑒定的未標記的配體。在上句中，“基本上生物學和化學鑒定”是指以與未標記的配體(也就是說，缺乏激活閃爍體的標記物的配體)相似的方式將包含激活閃爍體的標記物的配體配制成可以與感興趣的膜通道相互作用。換言之，激活閃爍體的標記物的摻入不會顯著干擾配體的結構或功能，特別地，不會顯著干擾配體和感興趣的膜通道之間的相互作用。根據本發明，適當的配體的例子包括抗體、肽、或小分子。適當的抗體的例子包括與感興趣的膜通道特異性結合的任意抗體。根據本發明，抗體可以是單克隆或多克隆的，其可以包含完全長度的蛋白質或片段(例如，Fc或F(ab)’)。已經鑒定了許多與膜通道結合的肽，其中任意一個都可以根據本發明使用。例如，對于鈣通道，配體肽包括但不限于spider和conesnail肽毒素(參見例如Mintz等人，(1992)Neuron985-95；Randall等，(1995)J.Neurosci.152995-3012)。對于鈉通道，很好地研究過的特異性阻滯劑包括但不限于蝎毒和腔腸動物觸須的刺細胞中的肽毒素、熱帶蛙分泌的生物堿毒素、和其他從許多類型的植物的葉子中獲得的脂溶性、殺蟲性物質(參見Hille，Ionicchannelsofexcitablemembranes，2nded.，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，Mass)。對于鉀通道，適當的配體肽的離子包括但不限于，毒素，例如在下表中所列出的那些。適當的配體和它們相應的離子通道的例子概述于下表I中。當配體是天然產生時，也指明了配體的來源。表I.用于離子通道分析的示例性配體離子通道肽來源Ca2+通道N-型ω-芋螺毒素MVILAConusmagnusω-芋螺毒素GVIAConusgeographusω-芋螺毒素CVID(AM336)Conussp.ω-芋螺毒素CVIAConussp.ω-芋螺毒素CVIBConussp.ω-芋螺毒素CVICConussp.ω-芋螺毒素SVIBConusstriatusω-芋螺毒素TVIAConussp.ω-芋螺毒素CNVIIAConussp.ω-芋螺毒素PtHAConussp.ω-AgoIHAgelenopsissp.ω-芋螺毒素MVIICConusmagnusP/Q-型ω-agatoxin-IVAAgelenopsisapertaQ-型ω-芋螺毒素MVIICConusmagnusT-型咪拉地爾L-型1，4-二氫吡啶類苯烷基胺苯并噻氮類BAYK8644Na+通道河豚毒素Tetradonstellatus和Tetraodontiformesorder的其它魚類局部麻醉藥(例如利多卡因)μ-芋螺毒素GIIIB肽毒素Conusgeographustoxin抗驚厥藥(例如拉莫三嗪、苯妥英)抗心律不齊藥(例如奎尼丁、美西律)蛙毒Phyllobatesaurotaenia烏頭堿Aconitumsp.藜蘆定堿Veratumsp.蝎毒LeiurusquinquestriatusATXIIAnthopleuraxanthogrammicaPhyrethorids(殺蟲劑)Chrysanthemumsp.雙鞭甲藻神經毒素PtychodiscusbrevisK+通道Kv1.1，1.2，1.6α-樹突毒素肽DendroaspisangusticepsKv1.3北非蝎毒素LeiurusquinquestriatusHebreausKv1.3瑪格毒素CentruoidesmargaritatusKv1，Kv3，Kv4.24-氨基吡啶類Kv1.1，1.6，2.1，Kv3四乙銨離子Ca2+-激活的K+(BK/hslo)Paxilline生物堿毒素PenicilliumpaxilliIberiotoxin肽ButhustamulusNS1608特別地，首先從Conusgeographus毒液中分離出來的GVIA是一種27個氨基酸的肽，是N-型鈣通道的有效和選擇性阻滯劑(Whorlow等人，ClinExpPharmacolPhysiol。1996，23(1)16-21)。MVIIA(也稱作zincontide或SNX-111)是首先從Conusmagnus的毒液中分離出來的，其是一種25個氨基酸的肽，是有效的N-型鈣通道阻滯劑(Olivera等人，(1987)Biochemistry262086-2090)。從Conusmagnus的毒液中分離出來的MVIIC是一種26個殘基的肽，是N-型鈣通道的弱阻滯劑，是P/Q-型鈣通道有效的阻滯劑(Hillyard等人，(1992)Neuron969-77；Wheeler等人，(1994)Science264107-111；Sasaki等人，(2000)FebsLetters466125-129)。ω-AgatoxinTVA是從spiderAgelenopsisaperta中分離出來的，是一種48個氨基酸的肽，據報道可以與P/Q-型鈣通道結合(Mintz等人，(1992)Neuron985-95)。在進一步的實施方案中，該配體包含與感興趣的小分子結合的小分子。適當的小分子的離子包括拮抗類藥物(鈣通道)；以及四乙銨離子，和抗心律不齊藥例如硝苯地平和奎尼丁(鉀通道)；有機分子例如二磺基二苯乙烯類、芳基胺苯甲酸鹽和磺酰脲類化合物(氯通道)。此外，可以使用晶體生物堿辣椒辣素。對于配體門控通道，根據本發明的一些實施方案可以使用內源性特異性配體例如乙酰氯、谷氨酸、甘氨酸、或γ-氨基丁酸。配體與感興趣的膜通道的親和力可以影響分析的靈敏度。例如，高親和力的配體可以不會檢測到結合較弱的分子；兩一方面，低親和力的配體會導致檢測到的非特異性結合增加。因此，在優選的實施方案中，選擇配體的親和力在需要的范圍內，例如分析獲得的EC50值與傳統方法例如膜片鉗獲得的值具有良好的相關性。例如，配體對膜通道的親和力的優選范圍是約1pM到約50nM，更優選的范圍是約5pM到50pM。在優選的實施方案中，所存在的配體的量的范圍是約10pM到約50pM，優選約12pM到約20pM，最優選約15pM。許多配體是容易從各種商業來源得到的放射性標記的形式。在優選的實施方案中，控制反應試劑和反應條件的選擇，以減少標記的配體的非特異性結合。根據這些實施方案，這些不想要的非特異性結合包括標記的配體與任何感興趣的膜通道以外的位點的結合。例如，非特異性結合可以包括膜脂和位于膜中的其它蛋白質。在其它情況下，非特異性結合包括標記的配體與載體的直接結合，或者與分析容器本身的結合。非特異性結合是不可飽和的，但是與在樣品中存在的配體總濃度呈近似線性。當發生時，非特異性結合增加了背景計數，因此減少了分析中測定到的特異性信號。一般地，觀測到的總配體結合是配體與相應受體(在存在的情況下，膜通道)的可飽和的(雙曲線的)特異性結合和配體與各種位點(即感興趣的膜通道以外的位點)的非飽和(線性的)結合的和。該關系可以如下表達(總結合)＝(與膜通道的特異性結合)+(與其他位點的非特異性結合)。典型地，通過在過量非標記的配體存在下進行結合研究來間接地獲得特異性結合的組分值。非標記的配體與標記的配體競爭性地與膜通道結合。由于非標記的配體過量，特異性結合位點(膜通道結合位點)對于實驗的配體將是不可用的，因此其結合被限制于非特異性位點。減少非特異性結合，包括根據組分彼此之間的競爭性和/或分析方式選擇適當分析組分。在一個優選的實施方案中，例如，當ω-芋螺毒素用作配體時，優選的載體是用麥胚凝集素包被的PVT珠。在優選的實施方案中，非特異性結合維持在提供最佳信噪比的信號的水平。此外，可以優化分析條件例如緩沖液的pH，特異性離子或有機分子的存在，和/或培養時間來減少非特異性結合。在進一步的實施方案中，在緩沖液系統中可以包括添加物以減少非特異性結合。典型的NSB減少劑包括牛血清白蛋白(BSA)，聚乙烯亞胺(PEI)鹽和洗滌劑。此外，分析容器例如微量滴定板是由非結合表面(NBS)的材料構成的，這些材料可以減少配體與分析容器的非特異性結合。根據本發明，將細胞膜和懷疑與膜通道相互作用的受試分子培養。根據本發明，載體和細胞膜連接，包含激活閃爍體的標記物的配體與感興趣的膜通道結合。當這發生時，刺激包含在載體中的閃爍體來發射能量。然后比較當受試分子存在時閃爍體的發射和當沒有受試分子時閃爍體的發射。當受試分子存在時發射的改變(例如，減小)標明了受試分子與感興趣的膜通道的相互作用。如現在更詳細地說明的那樣，如果需要，可以改變分析的培養步驟的特定順序。例如，在一些實施方案中，細胞膜、包含閃爍體和偶聯劑的載體、包含激活閃爍體的標記物的配體和懷疑與膜通道相互作用的受試分子可以分別、連續加入到該分析中。換句話說，在該實施方案中，步驟(a)到(d)在分析中可以是分別、連續的步驟。優選該實施方案不需要任何分離或洗滌步驟，所有反應試劑都連續地直接加入到反應介質中。這些特別的實施方案可以提供很多優點，例如簡單化的方式和過程。進一步地，在分析前不需要預培養期，因此反應試劑可以在分析的當天重新溶解或融化。在一些實施方案中，該特別的方式允許簡單地優化膜和載體的比例，成為可以設置不同的膜濃度和不同的載體濃度的基質試驗。優選地，使用稍微過量的載體以確保完全捕獲該分析中存在的所有細胞膜。本領域技術人員可以利用已知的確定載體最佳濃度的方法，以用于本文所述的分析。對于本發明加入的特定順序并不被認為是關鍵性的。在一些實施方案中，在加入分析的其他反應試劑前，在允許細胞膜和載體形成膜-載體絡合物的條件下，細胞膜和載體進行了預培養。根據該實施方案，在向分析中加入細胞膜或標記的配體前，細胞膜和載體進行了預培養。一般地，作為達到該目的的一個代表性方法，在需要的溫度下(典型地2-8℃)將細胞膜和載體在預培養期(典型地1到4小時)小心地攪拌。該特別的實施方案可以提供很多優點，例如減少向分析中加入的次數，因為載體和膜是作為一個反應試劑加入的。在一些實施方案中，該實施方案可以為分析條件提供均一性，因為對于分析的每種反應溶液都是使用同樣的制品。可替代地，在一些實施方案中，在向分析中加入其它反應試劑前，在允許細胞膜和配體形成膜-配體絡合物的條件下，細胞膜與用激活閃爍體的標記物標記的配體進行了預培養。根據該實施方案，加入的載體的量足以與分析反應混合物中的所有細胞膜連接。引入的過量體積將會導致與游離配體的結合的平衡移動，這樣在進行測定前反應將會給出足夠的時間來重新平衡。在一些實施方案中，該方式的分析的培養時間可以比連續方式加入反應試劑的情況更短。優選地，在進行本發明的方法的本文所述的所有實施方案中，優化細胞膜和載體的比例，以使得分析中存在的全部，或幾乎全部的細胞膜與載體連接(比如，結合)。與未結合的膜(沒有與載體連接的膜)結合的標記的配體對分析信號沒有貢獻，因為，該標記的配體距離載體的閃爍體太遠而不能影響閃爍體的發射。在連續加入反應試劑或配體與細胞膜預培養的實施方案中，優選包括稍微過量的載體以確保載體捕獲了所有的細胞膜。在本發明一個典型的表現中，表示配體與膜通道結合以及載體與細胞膜連接的信號將會持續增加，直至分析達到平衡。可替代地，在分析期間的特定時間點，t，進行測定。通過使用光電倍增管的任意適當的檢測器來檢測產生的輸出。可以使用任意適當的商業可用的閃爍計數器作為檢測器。如所述，本發明提供一種鑒定與膜通道相互作用的分子，因此，當在分析樣品中存在懷疑與膜通道相互作用的分子時，該分子將與包含激活閃爍體的標記物的配體競爭性地和感興趣的膜通道結合。結果，當該分子與膜通道結合時，它取代了標記的配體，因此降低了閃爍體發射的光能，這是因為從閃爍體附近清除了包含激活閃爍體的標記物的配體。如果該分子的競爭性更強，將會在分析輸出中觀測到可測定的改變。因此，本發明優選的實施方案可以提供很多優點，例如允許高效篩選懷疑與感興趣的膜通道相互作用的分子的系統。此外，根據本發明優選的實施方案，在研究中僅僅通過系統的配體-膜通道的反應比例來控制分析的時間。根據本發明，僅僅需要與細胞膜結合的包含激活閃爍體的標記物的配體與載體的閃爍體足夠緊密地接近，以允許標記的配體發射的輻射能轟擊閃爍體。結果，不需要從反應混合物中洗去載體或以其他方式試圖除去未結合的標記的配體；相反，可以用在分析混合物中存在的所有組分來測定發射能的水平。下面的實施例解釋說明了本發明的各個方面。實施例反應試劑和方法結合緩沖液50mMhepes-Tris，pH7.4，和0.05％牛血清白蛋白(BSA)PVT-WGA珠聚(乙烯基甲苯)-麥胚凝集素SPA珠(商業可用的，來自Amersham，Piscataway，NJ，Cat.No.RPNQ0001)。Ysi-WGA珠硅酸釔-麥胚凝集素SPA珠(商業可用的，來自Amersham，Piscataway，NJ，Cat.No.RPNQ0011).Ysi-PL珠硅酸釔-麥胚凝集素SPA珠(商業可用的，來自Amersham，Piscataway，NJ，Cat.No.RPNQ0010).GVIAPerkinElmerLifeSciences，Boston，MA，Cat.NoNEX239[125I]MVIICPerkinElmerLifeSciences，Boston，MA，Cat.NoNEX323[125I]MVIIAPerkinElmerLifeSciences，Boston，MA，Cat.NoNEX316除非另有說明，在下列實施例中使用的SPA珠濃度是5mg/ml。細胞膜的制備根據Zhang等，(2001)Int.Immunopharmacol1955-965的方法，從人神經母細胞瘤(IMR32)中制備，從溴脫氧尿苷或成年雄性斯普拉-道來大鼠腦組織中分化來制備細胞膜。簡言之，在冰冷的25mMTris(pH7.2)，2mMEDTA和320mM蔗糖中均勻化細胞或組織。在均勻化以后，首先將混懸液以100×g離心10分鐘。收集所得到的上清液，然后以40,000×g離心20分鐘。收集膜沉淀，再懸浮于結合緩沖液中，并在-70℃貯存。用牛血清白蛋白(BSA)作為標準品，使用Bradford試劑(Bio-Rad)來確定膜制品中蛋白質的濃度。細胞膜的量為2-5mg/ml。典型地，在大鼠腦膜蛋白中鈣通道的量是約200fmol/mg。實施例1配體與鈣通道的特異性結合本實施例說明的方法，是用于測定配體與包含在從大鼠腦組織中分離的細胞中的鈣通道的特異性結合。在96-孔微量滴定板上，在室溫下(20℃-25℃)進行分析。在每個孔中，加入2.5μg的如上所述從大鼠腦組織中分離的細胞膜(通過蛋白質濃度來測定)，1mgPVT-WGA珠，和將總反應溶液達到200μl體積量的結合緩沖液在室溫和pH7.4下培養1小時。該預培養步驟產生了細胞膜/珠絡合物。在培養后，向每個孔中加入15pM的下列標記的配體中的一種[125I]GVIA，或[125I]MVHC。所得到的混合物在室溫和pH7.4下培養60分鐘。當進行非特異性結合研究時，在加入[125I]GVIA前，向每個孔中加入100nM未標記的GVIA芋螺毒素，反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時，以得到平衡。存在過量的未標記的GVIA芋螺毒素，以使得在加入標記的GVIA前所有可用的鈣通道特異性結合位點都通過未標記的配體結合。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能。光能的增加對應于膜-珠絡合物的形成。GVIA的結合的結果如附圖1所示。如上述，用[125I]GVIA培養不同的時間(0到20小時)，并在附圖1的X-軸上表示。[125I]GVIA結合在Y-軸上表示，單位是cpm。配體的總結合如曲線A(填充格)所示，而非特異性結合如曲線B(空方格)所示。通過確定總結合(曲線A)和非特異性結合(曲線B)之間的差異來獲得GVIA與鈣通道的特異性結合。為了確定孔與孔之間的差異，在96孔板中測定48個總結合樣品和48個非特異性結合樣品。接著進行上述實施例1所述的分析方法。結果如附圖7所示，其表明了單位為cpm(Y-軸)的[125I]GVIA的總結合和NSB樣品的結合。X-軸表示樣品的數目。在該附圖中用方格表示總結合，用三角形表示非特異性結合。如所示，當測定的總結合為1641.3次每分鐘(cpm)時，測定的非特異性結合(NSB)是264cpm。因此，確定GVIA的特異性結合(總結合-非特異性結合)是1377cpm。總結合與非特異性結合的計算比例是約6.Z-因子(Zhang等，1999，J.Biomol.Screening，467-73)是約0.75，提示該分析的再現性對于構建高效篩選是足夠的。實施例2對標記的配體和細胞膜結合的影響確定載體濃度、細胞膜濃度和配體濃度對標記的配體和細胞膜結合的影響。載體濃度在設定的標記的配體和細胞膜的濃度下，檢測改變載體的濃度的影響。在微量滴定板中制備包含不同濃度的SPA珠(0.75到5mg/ml)的孔。在每個孔中，含有2.5μg從大鼠腦組織中分離的細胞膜和結合緩沖液，兩者的和使總反應溶液體積達到200μl。將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。作為對照，向每個孔中加入100nM未標記的GVIA，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。未標記的GVIA要過量，以使得未標記的配體與所有可用的鈣通道特異性結合位點結合。然后向每個孔中加入15pM[125I]GVIA，以獲得平衡。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能。結果如附圖2所示。SPA珠的濃度(mg/孔)如X-軸所示，單位為cpm的[125I]GVIA結合如Y-軸所示。光能的增加對應于珠-膜絡合物的形成。如附圖2所示，[125I]GVIA與細胞膜的結合取決于所存在的PVT-WGA珠的濃度。標記的-GVIA的總結合用曲線A(黑色圓)表示，標記的-GVIA的非特異性結合用曲線B(空白圓)表示。細胞膜濃度在設定的標記的配體和載體的濃度下，檢測改變細胞膜的濃度的影響。在微量滴定板的孔中置入從大鼠腦組織獲得的不同濃度的(3.125到25mg/ml)的細胞膜。在每個孔中，加入1mgPVT-WGA珠和使得總反應溶液體積達到200μl的結合緩沖液。將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。在培養后，向每個孔中加入100nM未標記的GVIA，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。未標記的GVIA要過量，以使得未標記的配體與所有可用的鈣通道特異性結合位點結合。然后向每個孔中加入15pM[125I]GVIA，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時，以獲得平衡。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能。結果如附圖3所示。腦膜的濃度如X-軸所示(μg/孔)，[125I]GVIA結合如Y-軸所示(cpm)。光能的增加對應于珠-膜絡合物的形成。如附圖3所示，珠-膜絡合物的形成取決于在分析混合物中存在的細胞膜的濃度。標記的-GVIA的總結合用曲線A(黑色圓)表示，標記的-GVIA的非特異性結合用曲線B(空白圓)表示。配體濃度在設定的標記的載體和細胞膜的濃度下，檢測改變標記的配體的濃度的影響。在微量滴定板的孔中置入從大鼠腦組織獲得的不同濃度的(3.125到25mg/ml)的細胞膜。向96-孔滴定板的每個孔中，加入1mgPVT-WGA珠，2.5μg從大鼠腦中分離的細胞膜和使得總反應溶液體積達到200μl的結合緩沖液。將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。在培養后，向每個孔中加入100nM未標記的GVIA，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。未標記的GVIA要過量，以使得未標記的配體與所有可用的鈣通道特異性結合位點結合。然后向每個孔中加入不同濃度(1到100pM)的[125I]GVIA，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時，以獲得平衡。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能.結果如附圖4所示.單位為pM的[125I]GVIA的濃度如X-軸所示，單位為cpm的[125I]GVIA結合如Y-軸所示。光能的增加對應于珠-膜絡合物的形成。附圖4表明了[125I]GVIA濃度對于標記的配體與細胞膜結合的影響。在不含細胞膜的情況下確定背景(曲線B，三角形)。配體的總結合用曲線A(黑方格)表示，而非特異性結合用曲線C(空方格)表示。附圖5顯示的是在高濃度的配體下，[125I]GVIA與細胞膜的結合是可飽和的。單位為pM的[125I]GVIA的濃度如X-軸所示，單位為cpm的[125I]GVIA結合如Y-軸所示。在附圖5中所示的數據是附圖4數據的重繪圖。該計算機繪出的曲線表示了數據的最佳擬合。在約12pM的濃度時達到了半數最大結合(EC50)，而在約25pM的濃度時達到了最大結合(Bmax)。對[125I]GVIA的飽和數據的分析表明，用一位點模型是結合的最佳擬合，解離常數(Kd)值是13pM，Bmax值是225fmol/mg蛋白質。實施例3鈣通道的競爭性結合下面，研究其他鈣通道配體和[125I]GVIA競爭性地與從大鼠腦中分離的細胞膜結合的能力。在96孔微量滴定板的每個孔中，加入下列物質1mgWGA-PVT珠，2.5μg從大鼠腦組織中分離的大鼠細胞膜，使總反應溶液體積達到200μl的結合緩沖液。然后向每個孔中加入15pM[125I]GVIA，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。研究不同配體進爭性地與細胞膜結合的能力，包括，向上述制備的反應混合物中加入下列一種配體GVIA、MVIIA、MVIIC、和ω-Agatoxin。加入的每種配體的濃度是0.01pM到0.1pM。將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時，以獲得平衡。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能。結果如附圖6所示，其表明了所研究的每種配體的結合曲線。通過單-位點結合模型進行抑制曲線的最佳擬合。配體的濃度如X-軸所示(l0gM)，[125I]GVIA結合如Y-軸所示(cpm)。CVIA的結合如曲線A(方格)所示，MVIIA如曲線B(圓)所示，MVIIC如曲線C(黑三角)所示，ω-Agatoxin入曲線D(空白三角)所示。觀測到的[125I]GVIA與細胞膜結合的取代順序如下GVIA＞MVHA＞MVIIC＞＞ω-Agatoxin。換言之，GVIA顯示了最高的相對親和力，而ω-Agatoxin對所分析的配體顯示了最低的相對親和力。通過單-位點模型對GVIA、MVIIA和MVIIC結合數據進行最佳擬合。結果表明，[125I]GVIA與從大鼠腦中分離的細胞膜中的N-型鈣通道特異性結合。計算每種配體的親和常數(Ki)，結果如表2所示。該數據表明，該分析方法提供了一種有效的系統來研究與鈣通道競爭性結合的相互作用。表2特定配體的親和常數實施例4配體與細胞膜的結合下面研究兩種不同的配體與從大鼠腦中分離的細胞膜的結合。在微量滴定板中和室溫下進行分析。在第一組設計用于檢測[125I]GVIA結合的反應中，向每個孔中加入2.5μg從大鼠腦組織中分離的大鼠細胞膜，1mgWGA-PVT珠，和使總反應溶液體積達到200μl的結合緩沖液，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。在第二組設計用于檢測[125I]GVIA結合的反應中，向每個孔中加入5μg從大鼠腦組織中分離的大鼠細胞膜，1mgPVT-WGA珠，使總反應溶液體積達到200μl的結合緩沖液，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。該預培養步驟產成了細胞膜/珠絡合物。在上述培養后，向第一組反應中加入15pM[125I]MVIIA，向第二組反應中加入15pM[125I]MVIIC。將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時，以獲得平衡。用實施例1的方法，以對反應混合物合適的方式，在100nM未標記的MVIIA(第一組反應)或MVIIC(第二組反應)存在下測定非特異性結合。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能。結果如附圖8所示。每種配體的總結合如條形A所示，而每種配體的非特異性結合如條形B所示。單位為cpm的[125I]芋螺毒素的結合(第一組反應是MVIIA，第二組反應是MVIIC)如Y-軸所示。實施例5配體與IMR32細胞的結合如下所述研究標記的配體與IMR32細胞的結合。在微量滴定板中和室溫下進行分析。向每個孔中加入10μg從上述的IMR32細胞中分離的細胞膜，1mgWGA-PVT珠，和使總反應溶液體積達到200μl的結合緩沖液，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。該預培養步驟產成了細胞膜/珠絡合物。在上述培養后，向反應混合物中加入15pM[125I]GVIA(第一組反應)，加入15pM[125I]MVIIA(第二組反應)。將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時，以獲得平衡。用實施例1的方法，以對反應混合物合適的方式，在100nM未標記的GVIA(第一組反應)或MVIIA(第二組反應)存在下測定非特異性結合。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能。結果如附圖9所示。每種配體的總結合如條形A所示，而每種配體的非特異性結合如條形B所示。單位為cpm的[125I]芋螺毒素的結合(第一組反應是GVIA，第二組反應是MVIIA)如Y-軸所示。實施例6包含不同偶聯劑的珠的結合如下所述研究包含不同偶聯劑的載體與細胞膜連接的能力和在配體-結合分析中的功能。在微量滴定板中和室溫下進行分析。向每個孔中加入2.5μg從大鼠腦組織中分離的大鼠細胞膜，1mgYsi-WGA珠或Ysi-PL珠，和使總反應溶液體積達到200μl的結合緩沖液，將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時。該預培養步驟產成了細胞膜/珠絡合物。在上述培養后，向反應混合物中加入15pM[125I]MVIIA。將反應混合物在室溫和pH7.4下培養1小時，以獲得平衡。用實施例1的方法，在100nM未標記的MVIIA存在下測定非特異性結合。用PackardTopCountTM閃爍計數器測定微量滴定板發射的光能。結果如附圖10所示。總結合如條形A所示，而非特異性結合如條形B所示。單位為cpm的[125I]MVIIA的結合如Y-軸所示。我們觀測到，該非特異性結合高于使用PVT-WGA珠的分析。根據對本說明書的思考或從本文公開的本發明的實施中，本發明的其他實施方案對本領域技術人員將是顯而易見的。本領域技術人員可以做出對本文所述原理和實施方案的各種省略、改變和變化，而不脫離下列權利要求所指定的本發明的真正范圍和精神。本文引用的所有專利、專利文獻和出版物都通過參考引入，就像分別引入一樣。權利要求1.一種檢測與細胞膜通道相互作用的分子的分析系統，該分析系統包括a.包含膜通道的細胞膜；b.載體，其包含閃爍體和與細胞膜連接的偶聯劑；c.選擇性地與膜通道結合的配體，該配體包含激活閃爍體的標記物，其中載體與細胞膜的連接和配體與膜通道的結合導致了從載體的閃爍體中發射，其中，當與膜通道相互作用的受試分子存在時，改變了從載體的閃爍體中的發射。2.權利要求1的分析系統，其中該細胞膜是從表達天然膜通道的細胞膜中得到的。3.權利要求1的分析系統，其中該細胞膜是從重組細胞分離的，該重組細胞從外源性DNA表達膜通道。4.權利要求1的分析系統，其中該細胞膜是人造膜。5.權利要求1的分析系統，其中該膜通道是離子通道。6.權利要求5的分析系統，其中該離子通道選自鈉通道、鉀通道、氯通道、鈣通道和配體門控離子通道。7.權利要求6的分析系統，其中該離子通道是鈣通道。8.權利要求1的分析系統，其中該膜通道是配體門控通道。9.權利要求1的分析系統，其中該載體包含珠。10.權利要求1的分析系統，其中該載體包含二苯基唑。11.權利要求1的分析系統，其中該載體包含聚(乙烯基甲苯)。12.權利要求1的分析系統，其中該載體包含硅酸釔。13.權利要求1的分析系統，其中該偶聯劑與細胞膜以非特異性方式連接。14.權利要求13的分析系統，其中該偶聯劑依靠細胞膜的負電荷與細胞膜連接。15.權利要求13的分析系統，其中該偶聯劑選自麥胚凝集素A型和麥胚凝集素B型。16.權利要求1的分析系統，其中該偶聯劑與細胞膜以特異性結合相互作用的方式連接。17.權利要求16的分析系統，其中該偶聯劑是直接對抗在細胞膜上表達的一種或多種蛋白質的抗體。18.權利要求1的分析系統，其中該配體選自抗體或抗體片段、肽和小分子。19.權利要求18的分析系統，其中該配體選自GVIA、MVIIA、MVIIC。20.權利要求1的分析系統，其中該激活閃爍體的標記物是放射性同位素。21.權利要求1的分析系統，其中該分子是離子通道調節劑。22.權利要求1的分析系統，其中當存在與膜通道相互作用的分子時，從載體的閃爍體中的發射減少。23.一種鑒定與細胞膜通道相互作用的分子的方法，該方法包括下列步驟a.提供包括一種或多種膜通道的細胞膜；b.在允許偶聯劑與細胞膜結合的條件下，培養細胞膜和包含閃爍體和偶聯劑的載體；c.在允許配體和膜通道結合的條件下，培養細胞膜和包含激活閃爍體的標記物的配體；d.培養細胞膜和懷疑與膜通道相互作用的受試分子；e.在受試分子存在時和在受試分子不存在時，測定載體的閃爍體中的發射；和f.比較當受試分子存在時從載體的閃爍體中的發射和當受試分子不存在時從載體的閃爍體中的發射。24.權利要求23的方法，其中在步驟(c)或(d)之前進行步驟(b)。25.權利要求23的方法，其中在步驟(b)之前進行步驟(c)和步驟(d)。26.權利要求23的方法，其中測定從閃爍體中的發射包括測定光能的發射。全文摘要本發明提供一種檢測與膜通道相互作用的分子的分析系統，該分析系統包括，包含一種或多種末通道的細胞膜；載體，包含閃爍體和與細胞膜連接的偶聯劑；選擇性地與膜通道結合的配體，該配體包含激活閃爍體的標記物。根據本發明，載體與細胞膜的連接和配體與膜通道的結合導致了從載體的閃爍體中發射，其中，當與膜通道相互作用的受試分子存在時，改變了從載體的閃爍體中的發射。也公開了鑒定與膜通道相互作用的分子的方法。文檔編號G01N33/68GK101023355SQ200580031637公開日2007年8月22日申請日期2005年7月19日優先權日2004年7月20日發明者S·－P·張,E·E·科德申請人:詹森藥業有限公司