用于檢測分枝桿菌感染的富集抗體，應用方法和應用其的診斷檢測的制作方法

專利名稱：用于檢測分枝桿菌感染的富集抗體，應用方法和應用其的診斷檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測基于微生物的疾病和病況的診斷檢測，并且更具體地，用于檢測結核病的診斷檢測和方法。
背景在最近幾十年間，TB已經從主要的肺部感染發展成為具有增長比例的肺外病例的多面性病理學。直到現在，有效的TB預防計劃受到缺少快速和領域適用的篩選檢測的妨礙。在高收入國家，分枝桿菌培養物一直為診斷的標準物，但是它費時并且相對費錢。理想地，基于3種痰液涂片的痰液顯微鏡方法可以鑒定多達67％的培養物陽性病例。盡管一些研究者沒有報道HIV血清狀態(serostatus)對AFB診斷的任何影響，但是，據報道，HIV共感染消弱結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)在痰液中的證明。另外，在HIV陽性TB患者中的更高百分比的肺外TB增加了AFB-陰性TB病例的比例。這使得肺結核成為增加的診斷挑戰，并且強調了對于用于其診斷的改善的實驗工具的緊急需求。
目前用于診斷TB的方法是不令人滿意的。肺部TB的痰液檢測不是總是有效，特別地，如果在痰液中不存在可檢測的細菌，或者不能獲得痰液樣品。另外，這種診斷檢測需要顯微鏡檢和/或細菌培養，來確定所述診斷，兩者都不是特別適用于這一領域的診斷。由于，再一次通常需要顯微鏡檢和/或細菌的培養和/或ELISA檢測來確定診斷，所以，應用腦/脊髓液用于TB-腦膜炎的診斷也是有問題的，特別是在本領域中。
TB的血液檢測也是已知的，但是具有不好的記錄，復雜而且不可靠。尿液檢測更簡單而且更可靠，但是目前的方法需要在進行診斷檢測前對尿液進行處理--這樣的處理通常包括尿液的濃縮。
在最近研發的方法中，已經研發了針對許多分枝桿菌抗原的抗體檢測方法，但是迄今為止，這些檢測沒有一種達到用于常規診斷目的所需要的特異性。在HIV陽性病例中敏感性的下降也是主要的限制。不同的方法用來測定針對結核分枝桿菌特異性抗原如ESAT-6的免疫應答，但是到目前為止，潛伏的TB感染和TB疾病之間的區分仍是不可能的。
結核病是一種極端復雜的病理過程，其以多種形式存在，但是總是以空氣傳播感染起始。肺結核直接發生在所述微生物進入點，并且肺外結核是進一步滲透到患者體內的結果，結核性腦膜炎和骨結核是最廣泛傳播的實例。病理的復雜性確定在本世紀的現代醫學中所嘗試的多種不同的方法。并且，HIV相關的肺結核的臨床和X射線顯示顯著地被免疫缺陷而改變。這些因素嚴重地限制了我們對HIV/TB患者中的結核病的早期癥狀的識別能力，并且還增加了TB傳播到這樣的患者的親屬和看護者的危險性。
分枝桿菌可以潛在地從各種臨床樣本復蘇，包括上呼吸道收集物(痰液、支氣管洗液、支氣管肺泡灌洗液、支氣管活組織切片等)；尿液、大便、血液、腦脊液(CSF)、組織活體切片、以及實質上任何組織或器官的深針管抽出液。細菌培養一直為結核診斷中的黃金標準，但是其可能需要6-8周才做出最后的診斷。對于分枝桿菌感染的快速(比細菌培養更快)診斷所應用的有3種主要的技術●痰液涂片的直接顯微鏡檢；●基于PCR的檢測；●免疫診斷方法。
痰液涂片的直接顯微鏡檢。早于一個世紀以前，Robert Koch通過對其染色并且從臨床樣本培養其而鑒定了結核的病原劑(ethiologic agent)。現在，通常應用基本上與Koch所用的那些沒有不同的染色和培養技術而建立結核的診斷。目前，痰液的直接顯微鏡檢是發展中國家用于診斷結核的標準，并且其是一種基準，任何新的檢測的功效必須針對其進行評估。它被用于肺結核，但是對于兒童或者對于處于肺結核的原始期的患者并不是十分有效。
基于PCR的檢測。在7個實驗室中進行PCR檢測性能的比較研究已經表明存在高水平的假陽性PCR結果，范圍在3％-20％(在一個實驗室中具有77％的極值)。這種相對不理想的性能是由于對所述方法的每一步驟缺乏監測而引起，并且強調在檢測的所有階段對于仔細的質量控制的必要性。
免疫診斷方法。
結核皮試。這可能是用于結核的最古老的免疫檢測。使用小針頭，將叫作PPD結核素的少量物質恰好置于前臂上的上層皮膚下。在其被給予后48-72小時讀取所述檢測。一般地，將10mm或更大的腫塊視為陽性。許多發展中國家應用BCG接種來保護免受TB。BCG接種后，PPD皮試通常變成陽性。取決于PPD抗原的質量、免疫系統的反應性以及甚至可能是個體的種族，皮試結果而不同。這種檢測也沒有提供關于感染的階段和位置的明確的指示。
用于結核分枝桿菌(M.tuberculosis)的血清學檢測。這種方法，基于針對分枝桿菌抗原的抗體免疫應答的檢測，是在研究和臨床環境下最廣泛應用的方法之一。如果它們應用純化的抗原，所有血清學檢測具有近似相同的靈敏性。最好的檢測的靈敏性，對于涂片陽性病例在80％范圍內，對于涂片陰性病例在60-70％。報道的特異性通常較高，并且在95-100％范圍內。
目前現有技術在一些方式上限制它們的性能。
最廣泛接受的快速顯微鏡檢測需要幾個小時才能完成，需要熟練的技術人員和臨床實驗環境。與傳染病領域的快速POC檢測的現行標準相比，檢測闡釋也是很難的。對于美國醫院，每一個患者的一次分析的實際花費在$100-150范圍內。所述檢測的臨床特異性很好，但是在靈敏性上的任何改善將是非常受歡迎的。
皮試具有足夠的靈敏性，但是需要長時間，并且不能提供關于病理過程階段的信息，并且不能充分地區分被感染的和接種的個體。
血清學檢測通常沒有足夠的靈敏性。檢測結果隨著對TB抗原的個體免疫應答的不同而不同。實際上，這些檢測在被結核分枝桿菌感染的HIV患者中不起作用。這一因素嚴重地限制了它們在非洲和許多亞洲國家的適用性。在美國，這一組患者也構成了大多數的感染TB的患者。
PCR檢測在發達國家廣泛地應用，卻是復雜的、耗費大的，并且不足夠的靈敏，不足以在發展中國家證明它們作為篩選檢測的應用。
用于傳染性疾病的快速診斷的優選方法是基于在患者樣品中細菌抗原的檢測，其提供特異性病原體引起的活性感染過程的明確的證據。在一些出版物中描述了應用直接的抗原檢測而檢測分枝桿菌感染的觀念。
例如，在1982年報道了用于結核分枝桿菌的一種最初的直接抗原檢測的發展--用于在患有活性肺結核的患者的痰液中檢測結核分枝桿菌抗原的放射性免疫檢測，其應用對牛分枝桿菌(M.bovis)(BCG疫苗)的全細胞特異的兔抗體。將高壓滅菌的和超聲降解的痰液用作樣品。所述檢測在來自患有活性結核性肺結核患者的39份痰液樣品中的38份中檢測到抗原。
后來的研究報道了用于檢測患有結核性腦膜炎的患者的腦脊液中的分枝桿菌抗原的ELISA系統的發展，其也應用對牛分枝桿菌全細胞特異的抗體。兩種系統表現出令人驚訝的高度特異性。除了LAM是負責檢測的主要抗原外，據報道堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)表現出5％的交叉反應性，以及胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、鳥分枝桿菌(M.avium)、偶發分枝桿菌(M.fortitum)和母牛分枝桿菌(M.vaccae)只以2％進行交叉反應。其他人報道了通過ELISA在12名患有結核性腦膜炎的患者中的9名的CSF中檢測到分枝桿菌抗原，對應81.25％的靈敏性。所述檢測的靈敏性等于95％。
實際上，所有先前開發用于結核診斷的檢測的嘗試都集中在疾病肺部形式的檢測上。由于與肺部形式(from)相比的低流行率，公認為是難以診斷的肺外形式吸引了相對少的注意。直到20世紀50年代和60年代，肺外TB病例僅包括所有結核病例的大約10％。HIV/AIDS大流行病的發作已經完全改變了所述狀況。這兩種疾病最終結合成為一種新的復雜的公共健康問題。現在，足足有60％的未治療的HIV患者在他們的一生中發展了活性TB，并且多達70％的TB患者是在亞撒哈拉的非洲和亞洲感染的HIV患者。HIV和TB的疊加不但改變了結核病的流行病學，而且改變了疾病本身的病程。在最近的十年間，TB已經從主要的肺部感染發展成為具有肺外形式的不斷增長的流行性的多面性病理學。估計，目前肺外TB病例包括多達30％的所有結核病病例；由于缺乏用于結核病的肺外形式的快速篩選和診斷的工具，這一數字甚至可能是低估的。并且，甚至HIV患者中的肺結核經常表現出非典型的癥狀。例如，這樣的患者典型地不產生痰液。這些因素嚴重地限制了我們對HIV/TB患者中的結核病的早期癥狀的識別能力，并且還增加了TB傳播到這樣的患者的親屬和看護者的危險性。應用能夠檢測由于結核分枝桿菌感染引起的廣譜病理學的篩選檢測的容易性是急需的，包括對于TB肺外形式的檢測。這樣的需求已經討論了很久，但是沒有達到實現目標的進展。現在，所述需求已經成為公共衛生保健的緊急需要。
在肺部細菌感染的其它情形中，目前選擇的篩選方法是基于在患者尿中分泌的多糖抗原的檢測。細菌多糖由不同于人類的單糖組成，并且因此抵抗人類的酶類的分解。這使得它們以免疫化學上完整的形式在尿中分泌，所述免疫化學上完整的形式適于通過多糖特異性免疫檢測進行檢測。在尿中分泌的極低濃度的細菌多糖需要免疫檢測的非常高的靈敏性，以將其用作篩選方法。
瑞典和挪威的合作研究小組嘗試研發一種LAM特異性ELISA系統，其檢測患者尿中的LAM抗原。所述系統將抗原捕獲用于從尿液檢測結核病，其基于脂阿拉伯甘露聚糖，在結核分枝桿菌表面存在的一種多糖，所述結核分枝桿菌生物體負責在人類中引起結核病，如在Svenson的PCT申請號WO97/34149中所公開的那樣。所述公開的診斷方法檢測到LAM以81.3％的AFB-陽性患者和57.4％的AFB-陰性患者存在于患者尿中，并且證明了分枝桿菌LAM抗原檢測用于診斷分枝桿菌感染的效用。同時，所述系統沒能證明所公開的方法用于篩選目的的效用。盡管應用親和純化的對LAM-抗原特異的兔多克隆抗體，但是，所述方法缺少足夠的靈敏性，而不足以用于未處理的非濃縮的尿樣。所述診斷方法要求在生化實驗室中進行大約24-48hrs的熟練操作，集中在對患者尿液的濃縮，并且對其進行制備，用于通過ELISA檢測進行分析。總的看來，Svenson檢測的靈敏性不足以用于所公開的方法的實際應用。由于證明它在臨床設備中的應用太繁瑣，在所述臨床設備中，應用的速度、容易度和高靈敏性對于用來檢測疾病條件的診斷檢測都是非常重要的，所以，免疫檢測的復雜性和持久性也妨礙其作為用于檢測分枝桿菌感染的篩選檢測的實際應用。
發明概述在本發明的第一個實施方案中，提供來自結核分枝桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖的抗原性活性異構體，其通過應用輕度氧化方法，諸如用低濃度的NaIO4處理，將LAM氧化而制備。在其它實施方案中，通過輕度氧化方法產生的LAM的抗原性活性異構體，被用來制備針對滅活的分枝桿菌，更具體地針對表面多糖諸如LAM的高度特異性的、高度純化的抗體，以用于檢測目標患者的尿液、痰液、血液、組織或其它樣品中的多糖(例如LAM)。其它實施方案應用針對LAM的抗原性活性形式產生的高度特異性的、高度純化的抗體來診斷目標患者中的結核病。
在另一個具體的實施方案中，提供一種對于分枝桿菌的表面多糖的抗原高度特異的富集抗體群。在這一實施方案中，所述富集的抗體群可以通過在維持抗原性活性抗原的條件下產生而富集。備選地或者此外，所述抗體通過排除識別相對沒有活性的抗原的抗體而進行富集。在一些實施方案中，分枝桿菌可以是結核分枝桿菌，類似地，所述表面多糖可以是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
在另一實施方案中，提供用于產生對分枝桿菌抗原高度特異性的富集抗體的方法。在這一實施方案中，所述方法包括產生并且分離針對分枝桿菌抗原的抗體；并且從所分離的抗體中分離出對相對沒有活性的抗原特異的抗體群，以產生分離的富集抗體。
在另一實施方案中，提供用于產生對分枝桿菌抗原高度特異性的富集抗體的方法。在這一實施方案中，所述方法包括在維持抗原活性的條件下從分枝桿菌分離抗原；并且在維持其抗原活性時產生針對所分離的抗原的抗體。
在另一實施方案中，提供用于產生對分枝桿菌抗原高度特異性的富集抗體的方法。在這一實施方案中，所述方法包括將來自用分枝桿菌接種的哺乳動物的血清上樣到用分離的分枝桿菌抗原制備的第一親和基質上，從而使得針對所分離的抗原特異的抗體保留在第一親和基質上；從第一親和基質分離對所分離的抗原特異的抗體；將分離的抗體上樣到用修飾的分枝桿菌抗原制備的第二親和基質上，從而使得對所修飾的抗原特異的抗體保留在第二親和基質上，其中所述修飾的抗原已用一種試劑處理，而使其相對于分離的抗原失活；通過收集第二親和基質的流出液，而分離針對分離的抗原特異的富集抗體，從而使得富集抗體比未富集的抗體對分枝桿菌抗原更加高度特異并且表現出更高的靈敏性。
在其它相關實施方案中，分枝桿菌可以是結核分枝桿菌，并且所述表面多糖可以是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
在其它實施方案中，用于修飾分枝桿菌抗原的試劑是高碘酸鈉。在其它相關實施方案中，所述表面多糖可以是從弗氏佐劑分離的。
另一實施方案提供在來自受試者的樣品中檢測分枝桿菌感染的方法。在這一實施方案中，所述方法包括提供免疫反應性環境，這樣的環境從所述富集抗體發展而來，如上文所述；并且將樣品在所述免疫反應性環境下反應，從而檢測分枝桿菌感染。
任選地，分枝桿菌感染可以是結核分枝桿菌或約尼病(Johne′sdisease)。相似地，所述表面多糖可以是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。在其它相關實施方案中，所述免疫反應性環境包括ELISA，并且可以作為帶狀檢測(strip test)而實行。在相關實施方案中，分枝桿菌感染可以是肺部結核分枝桿菌感染或肺外結核分枝桿菌感染，并且樣品可以是痰液、血液、尿液、組織或其它適合的樣品的任何一種。在一個相關的具體實施方案中，所述樣品可以是未處理未濃縮的尿液。
其它實施方案提供用于檢測樣品中的分枝桿菌感染的試劑盒，所述試劑盒包括提供免疫反應性環境的檢測，其中所述環境包括上文所述的富集抗體。在相關實施方案中，所述免疫反應性環境包括ELISA，并且可以作為帶狀檢測而實行。在其它相關實施方案中，分枝桿菌感染可以是結核分枝桿菌，并且所述抗體可以脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
附圖簡述通過參考下述詳細描述，與參考附圖相結合，本發明的前述特征將更加易于理解，所述附圖中

圖1顯示分枝桿菌ManLAM、PILAM和AraLam的結構模型。
圖2顯示LAM實驗的血清學(seriological)活性比較。
圖3顯示LAM-特異性Ab制劑在捕獲ELISA中的功效。
圖4a.對于尿液中不同濃度的LAM的LAM ELISA的靈敏性。截斷值是陰性對照的光學密度+0.1，獲得0.25ng/ml的最小檢測限度。
圖4b.對于下列細菌物種，ELISA中LAM-特異性抗體與非分枝桿菌抗原的結合被排除肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)、肺炎鏈球菌14/12F(Streptococcus pneumoniae 14/12F)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌25923/43300(Staphylococcus aureus 25923/43300)、普通變形菌(Proteus vulgaris)、大腸桿菌8739(E.coli 8739)、腦膜炎奈瑟氏球菌A/B/13102(Neisseriameningitidis A/B/13102)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae A/B/D)。
圖4c.對于各種分枝桿菌菌株的LAM ELISA的靈敏性。檢測牛分枝桿菌和結核分枝桿菌的LAM是最靈敏的。
圖5.AFB陽性患者的顯微鏡檢分枝桿菌密度和在未處理的尿液中通過LAM ELISA測定的其抗原濃度之間的關系。AFB+(光學顯微鏡1000×放大4-90個抗酸桿菌/100個視野)28個病例。AFB++(1-9/視野)23個病例。AFB+++(～10/視野)20個病例。框圖顯示10th，25th，50th，75th，90th百分數和平均抗原濃度。
圖6顯示按照本發明的具體實施方案的抗原純化流程的示意圖。
圖7顯示按照本發明的具體實施方案制備親和柱的示意圖。
圖8顯示按照本發明的具體實施方案的抗體純化流程的示意圖。
圖9顯示按照本發明的具體實施方案制備綴合物的示意圖。
具體實施方案詳述定義下述術語應該具有指定的意思，除非上下文另外需要當用在本文時，“免疫反應性環境”意指，支持免疫檢測，免疫反應，免疫化學，以及包括、涉及或依賴免疫反應而獲得需要的結果的任何流程、檢測方法學或系統的環境。免疫反應性環境的實例是在Swanson等的美國專利號5,073,484；和Guire等的美國專利號5,654,162和6,020,147中詳述的那些，其公開了用于定量確定液體中的被分析物的方法和設備，其中具體的實施方案應用這樣的免疫化學反應，即，其中被分析物和反應物代表特異的配體(抗原)-抗體(抗-配體)結合對的不同部分。這些專利涉及已經被用作我們在本詳述和下述權利要求中稱為“帶狀檢測”的技術。
“弗氏佐劑”來自Sigma，USA。
我們已經開發了一種高靈敏性的方法，用于檢測分枝桿菌抗原，特別是結核分枝桿菌抗原，諸如表面多糖脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和其它種類，在體液包括但不限于尿液中的存在。迄今為止，這種性質檢測缺少靈敏性，并且不可用于未處理的尿樣或用于檢測肺外TB感染。特別地，我們已經開發了針對分枝桿菌抗原產生的富集抗體，其中所述抗體通過在保持抗原性活性抗原的環境下產生而富集。我們將用于產生這種第一類的富集抗體的方法叫作“直接法”，在下文將對其更詳細地描述。
我們還開發了通過排除識別相對沒有活性的抗原的抗體而富集的抗體。用于產生這一類抗體的所述方法通過在“直接法”之后開始，以獲得富集抗體，但是然后還通過排除識別相對沒有活性的抗原的抗體而進行。我們將用于產生這種第二類富集抗體的方法叫作“富集法”，在下文也將對其更詳細地描述。
圖8是顯示參與實行富集方法(enhanced method)的實施方案的步驟的示意性描述。由于所述富集方法建立于直接法，所以，如果我們在第一親和柱之后停止，圖8還舉例說明了直接法。
在下文，我們顯示這些兩類之一或二者的富集抗體可以怎樣用于在各種樣品中檢測肺部和肺外TB感染，所述樣品包括但不限于未處理的(即，未濃縮的)尿樣。(其它潛在的樣品來源包括痰液、腦脊液、血液、組織、灌洗液。)在其接著的實例中，在保持其抗原性活性的環境下，針對脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)的表位產生富集抗體。
已經研究了用于應用不同的體液諸如血清、尿液或痰液而檢測表面多糖(LAM)的現有方法，但是證明其是有問題的。在血清中，LAM的檢測似乎受到形成免疫復合體的干擾。由于肺外感染通常不提供含有分枝桿菌抗原的痰液，所以，LAM在痰液中的檢測只在患有肺TB的患者的樣品中是可能的。關于尿的現有研究需要大量的樣品處理和操作，限制了本領域的這樣的方法學。對于診斷肺外分枝桿菌感染，諸如在HIV-陽性受試者中出現的那些，這些方法沒有一種有效。
本發明的實施方案通過提供可以用于在受試者的寬范圍的樣品類型中檢測分枝桿菌抗原的富集抗體，從而克服了現有技術的困難。其中，這些樣品類型包括血清、血液、痰液、灌洗液、組織、以及未處理的、未濃縮的尿液。
脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)是一種對分枝桿菌屬特異性的17500molwt脂多糖。脂阿拉伯甘露聚糖是一種由甘露糖和阿拉伯糖殘基組成的復合多糖抗原，形成高度分支的和復雜的結構。盡管多于40年的分枝桿菌多糖抗原的結構研究，本領域的那些技術人員仍然只討論所述結構的片段或結構基序和復合模型。最近的LAM結構復合模型在下面圖1中給出。
作為分枝桿菌外細胞壁的部分，LAM從新陳代謝活躍的或退化的細菌細胞釋放。假定在活性TB感染中，LAM滲漏到循環中，穿過腎臟，并且因此可以在尿液中檢測到，從而反映分枝桿菌負擔的水平。由于LAM是具有糖苷鍵的碳水化合物抗原，對于其不存在人類降解糖苷酶，所以，所述抗原以完整形式存在于尿液中。
分枝桿菌LAM抗原由3個主要結構域組成甘露糖基-磷脂酰(phospahtidyl)-肌醇(MIP)錨定子，其含有具有可變鏈長度的可變數目的脂肪酸；甘露聚糖核多糖，甘露糖殘基數目可變；和連接到甘露聚糖核上的分支阿拉伯聚糖多糖鏈。盡管許多嘗試，在甘露聚糖(manan)核上用于阿拉伯聚糖鏈的附著位點仍然未知。阿拉伯聚糖多糖鏈被甘露糖寡糖封端(capped)，其由長度可變的單-(α1-2)-雙-和(α1-2)-三-甘露糖基單位(封端基序)組成。封端程度隨著鏈與鏈而不同，并且可能還取決于生長條件。
分枝桿菌LAM的極高的結構復雜性和可變性導致抗原表位的非常復雜的譜型。所選擇的診斷劑的復雜性迫使我們應用親和純化的多克隆抗體作為主要的免疫檢測試劑。只有應用多克隆抗體才允許我們涵蓋與臨床樣品中存在的LAM潛在相關的全部譜型的抗原特異性。為了獲得三明治免疫檢測的可能的最高檢測靈敏性，在捕獲區域我們應用最高濃度的抗原-特異性抗體并且還用作標記的抗體。已知抗原-特異性親和純化產生這樣的抗體。
為了制備基于抗原的親和柱，我們研發了用于抗原分離并且偶聯到固相支持物上的方法。LAM抗原分離的方法基于文獻中所述的和為本領域的那些技術人員公知的，以及在下文所述的其它細菌多糖的分離方法，其具有一些小的改進。
文獻所述的早先的基于LAM的直接抗原免疫檢測使用多克隆抗體，所述多克隆抗體是應用LAM-瓊脂糖柱通過抗原-特異性親和層析而純化。對于合成親和基質的現有技術方法是基于LAM多糖的部分NaIO4-氧化，隨后偶聯到NH2-瓊脂糖上。令人吃驚地，我們的實驗表明，NaIO4-氧化LAM多糖的抗原活性，如可以從圖2看出的那樣。
由于氧化多糖和NH2-固體支持物的偶聯效率與氧化程度成比例，所以，我們通過用50mM NaIO4氧化的功能化BSA-間隔分子LAM抗原而偶聯到瓊脂糖支持物上。在這一氧化水平上，LAM多糖仍保留一些抗原性活性，如下文所述，但是提供了高的偶聯效率。將免疫血清應用到這樣的親和基質上導致了以高的級分產量分離兔抗體。在平板ELISA免疫檢測形式中作為捕獲抗體的這樣的抗體的檢測表現出一些功能活性，但是沒有在足夠的水平上，不足以用于對于應用非濃縮尿樣進行篩選應用所必需的高靈敏性免疫檢測中。這些數據解釋了先前在文獻中獲得的結果，在所述文獻中，應用LAM-特異性親和純化的抗體，但是仍然需要濃縮尿樣，以檢測在樣品中存在的Lam。
出乎意料地，基于用溴化氰(CNBr)激活多糖，通過將LAM偶聯化學變成更輕微的非破壞性方法，導致了質量好得多的LAM特異性抗體的純化，如可以從圖3看出。
然后，令人驚訝地，在深入地、強NaIO4還原后(見下文)，將用完整的LAM(CNBr-活化方法)在柱上純化的抗體流過具有LAM抗原的柱子，產生相對少的抗體級分，大約為應用量的7-10％，在LAM-特異的直接抗原免疫檢測中具有非常高的活性。圖3顯示這樣的抗體作為捕獲抗體的效率。當將這樣的抗體用辣根過氧化物酶(HRP)標記并且用作標記的抗體時，它還表現出比所檢測的或已知的任何其它抗體更高的活性。基于這樣的抗體的ELISA系統已經表現出極高的靈敏性，并且證明有效用于檢測非濃縮的尿液樣品。這使得我們制成一種具有性能特征的篩選LAM-特異性的免疫檢測方法，其適于在本領域或者肺部和肺外TB情形中進行快速篩選，這是以前別人沒有獲得的技術。因此，盡管已經在TB患者的冷凍尿液中描述了LAM，但是對于這樣的報告的檢測需要大量的樣品制備，并且因此不是領域適用的。
流程在本部分，我們描述了適于實行上文所定義的“直接法”和“富集法”的流程。這一討論沒有嚴格地按照直接法和富集方法本質而進行分類，但是具體描述了制備適用于一種或兩種方法的柱子的方法，這依賴于上下文。圖8顯示了直接和富集法的示意圖。
從弗氏佐劑分離結核分枝桿菌的干細胞首先，在使用前，允許細胞和弗氏佐劑在室溫靜置最少1周。打開佐劑瓶的蓋子，并且不攪亂沉降在瓶底的細胞，倒掉大體積的礦物油。可以將少量的礦物油留在瓶中，作為避免吸取細胞沉淀的警示。棄掉礦物油，并且然后混合6.0L乙醇和6.0L二乙醚，并且向每個瓶中加入5mL乙醇二乙醚混合物。
接著，關閉瓶子，渦流振蕩，并且迅速將混懸液轉移到1-L Erlenmyer燒瓶中。在本步驟中避免使細胞重新在瓶中沉降。當所述1-L Erlenmeyer燒瓶裝滿到1-L線時，讓細胞沉降1-1.5hr。然后，輕輕地將Erlenmeyer燒瓶中的溶劑倒入一個潔凈的1-L燒杯中。避免攪亂沉降的細胞并且用溶劑移動它們。如果倒入燒杯中的溶劑是清澈的，那么棄之。如果有顯著量的細胞隨著溶劑倒出，那么將所倒出的溶劑倒回Erlenmeyer燒瓶并且重復沉降步驟。使用20-30ml整分的乙醇二乙醚混合物，將細胞轉移倒玻璃熔制的濾器上。
用500ml乙醇-二乙醚混合物洗滌細胞，然后用200ml二乙醚洗滌。接著，使用100mmHg+/-10(低真空)的真空器，在濾器上將細胞空氣干燥。時不時地攪拌，并且將細胞質體勻漿，然后用多孔材料(諸如Kim-wipe)將濾器蓋上，并且置于通風櫥中直到晾干(大約15小時，即，過夜)。
稱重并且記錄總重量，并且計算細胞的干重。然后用橡膠線紋蓋密封，并且保存在15-30℃。
粗LAM抗原的酚提取將結核分枝桿菌的干細胞置于250-mL Pyrex培養瓶中，并且將溫和的去離子水添加到細胞中。在超聲波水浴中，將混懸液渦流振蕩，并且用脈沖超聲(～20秒脈沖)處理，直至混懸液成為均勻的。
用酚提取細胞，然后用乙醇沉淀，并且將沉淀的細胞在冰箱(2-8℃)中放置過夜(～16小時)，以允許沉淀物沉降下來。十分小心不要攪動沉淀，輕輕地倒出上層清液，直到留下大約100mL上層清液覆蓋所述沉淀物。輕輕振動以混合，然后將余下的混懸液轉移到teflon離心管中，并且在12,000rpm離心20分鐘。盡可能多的從所有的管子中倒掉上層清液，不要攪動沉淀塊，向每個管中加入5ml去離子水，并且使用渦流振蕩和脈沖超聲，將沉淀塊溶解在水中。將所有的級分與溶解的沉淀組合在一起并且置于500-mL燒瓶中(注意不要超過燒瓶容量/體積的1/10)。旋轉蒸發，以使得體積最小化，但是避免使得樣品熔焦化。用大約50mL水將膜再次溶解，并且重復干燥和再溶解，直到樣品被干燥3次。再溶解在50mL水中并且凍干。
通過葡聚糖G-25層析純化LAM抗原將800mg粗LAM Ag溶解在15mL0.25％的乙酸溶液中。在超聲波水浴中振蕩并且超聲，以獲得完全的溶解。在微量離心機中以5000rpm離心5min。將上層清液收集到20-mL玻璃瓶中，將所述上清分成3等份，以用于獨立的層析運行，然后輕輕地將上面收集到的1/3的LAM Ag上清上樣到層析柱上。在100mL體積流過柱子后，開始收集級分。繼續收集級分，直到從層析開始流過350mL的移動相。蓋上所有的級分，并且保存在2-8℃。在250-mL蒸發燒瓶中旋轉蒸發(體積不大于25mL)。蒸發以使得體積最小化，但是避免使得樣品熔焦化。在20mL水中稀釋所蒸發的物質，超聲，振蕩，直到完全溶解并且然后凍干(大約8小時)。用刮刀將干燥的物質刮到配衡玻璃小瓶中并且稱重。
上述步驟在圖6中示例性地描述。
用CNBr活化將LAM抗原與BSA-間隔偶聯首先，制備0.5M碳酸氫鈉和1M碳酸鉀溶液。然后將30.0g純化的LAM Ag溶解在1.5mL去離子水中。應用脈沖超聲(10-20sec脈沖)和振蕩以完全溶解LAM Ag。
將300mg BSA-肼配體溶解在15mL去離子水中。脈沖超聲(10-20sec脈沖)和振蕩以完全溶解，然后置于微量離心管中，并且在微量離心機中以10,000rpm離心10分鐘。使用巴斯德移液器從每個管中小心收集清澈的上層清液并且匯集在一起，并且轉移到20-mL的小瓶中。避免攪動可能形成的任何沉淀。向小瓶中加入1.0mL 0.5M的碳酸氫鈉，并且通過搖動充分混合。向LAM溶液中加入150μL冷凍的1M碳酸鉀，并且通過簡短的振蕩充分混合。將獲得的溶液置于冰/水浴中。
在乙腈中制備5mg/mL CNBr，立即使用，并且向LAM溶液中加入180μL的溴化氰溶液。振蕩混合并且置于冰上大約15分鐘。用巴斯德移液器將這一溶液添加到BSA-肼配體溶液(上述)中。充分混合并且在緊密密封的小瓶中在2-8℃溫育過夜(16-24小時)。
用NaIO4活化將LAM抗原與BSA-間隔偶聯3-4-mL小瓶中，將LAM抗原溶于1.25mL去離子水中。脈沖超聲并振蕩以完全溶解。制備0.1M的高碘酸鈉溶液(在NaOAc緩沖液中，pH4.0)。將1.25mL 0.1M NaIO4溶液添加到1.25mL LAM溶液中。振蕩以混合。用鋁箔將小瓶蓋上；將其置于搖動平臺上，并且在環境溫度下混合1小時+/-5分鐘。
在25-40mL玻璃血清小瓶中，將250mg BSA-肼配體溶解在12.5mL去離子水中。應用脈沖超聲并且振蕩以完全溶解，然后以10,000rpm離心大約10分鐘。使用巴斯德移液器從每個管收集上層清液，并且匯集到25-40mL玻璃小瓶中。避免攪動沉淀。向小瓶中添加12.5mL 0.1M磷酸鈉(pH6.8)，并且通過簡單振蕩充分混合。
偶聯方法向BSA-肼溶液中加入氧化的LAM溶液，并且振蕩。加入100mg氰基硼氫鈉并且密封。取樣10μL最終溶液，并且用90μL 1×PBS緩沖液(QC溶液)稀釋，并且留作進一步的分析(LAM濃度為約0.75mg/mL)。
用NaIO4活化瓊脂糖測定與80ml沉積的凝膠相對應的瓊脂糖4B-CL的等分混懸液，并且轉移到燒結的玻璃濾器上。用500mL水洗滌，并且用低真空(大約300mmHg)抽吸，直到凝膠表面的粒狀結構可見。避免在凝膠層形成空氣裂縫。制備0.1M醋酸鈉緩沖液，pH4.0的溶液，并且用于制備在0.1MNaOAc中的30mM NaIO4溶液。
向所述凝膠中加入250mL的30mM NaIO4，并且充分混合。用鋁箔將瓶子蓋上，并且以45℃角置于搖動平臺上，在環境溫度以中等速度搖動1.5小時±10分鐘。轉移到燒結的玻璃濾器中，并使用低真空(大約300mmHg)用1L水洗滌。活化的凝膠必須在使用的最多4小時內制備。將BSA-LAM配體與活化的瓊脂糖偶聯(用于合成第一和第二親和柱)制備基質在1×PBS(磷酸鹽緩沖液)中制備0.1％疊氮鈉溶液。測量與60ml沉積凝膠(或其它適宜的基質)對應的活化的瓊脂糖混懸液，并且將其轉移到燒結的玻璃濾器上。使用低真空(300mm Hg)抽吸凝膠，直到凝膠壓實，并且粒狀結構可見，但避免在凝膠表面形成裂縫。
BSA-LAM配體溶液在250-mL培養瓶中，用磷酸鈉緩沖液(pH6.8)將17-20mLBSA-LAM配體溶液稀釋到90mL。將90mg結晶氰基硼氫鈉加入所述溶液。使用提供的塑料蓋，將瓶子緊密關閉。通過簡單振蕩而充分混合。所述溶液可以呈現出乳白色的，但是不應該有沉淀。可以看到由氰基硼氫鈉形成的顯微氣泡。
偶聯步驟向上述制備的LAM溶液中加入抽吸的活化瓊脂糖凝膠。緊密關閉，并且使用輕輕振蕩充分混合所述混懸液。在37℃+/-2℃溫育大約4小時，每小時混合反應混合物(通過倒置)。加入4.5mL 1.5M Tris緩沖液，并且再次緊密蓋上蓋子。繼續在37℃+/-2℃溫育大約16小時(過夜)。
將反應混合物轉移到燒結的玻璃濾器上，并且通過使用低真空(300mm Hg)將液相收集到干凈的100-200mL Bunzen燒瓶中。用400ml去離子水洗滌在濾器上的LAM-瓊脂糖凝膠，并且繼續用600mL 1×PBS洗滌。
柱的包裝和保存在250mL燒杯中，向制備的凝膠中加入100mL 1×PBS。人工攪動成漿狀。按照標準方法，使用1×PBS裝柱。用1×PBS加0.1％疊氮鈉平衡柱子。
-LAM配體與活化瓊脂糖的通用偶聯(用于制備親和柱I和II)測定與100ml沉積膠對應的活化瓊脂糖混懸液，并且轉移到燒結玻璃濾器上。使用低真空(300mm Hg)抽吸凝膠，直到所述凝膠壓實并且粒狀結構可見，但是避免在凝膠表面形成裂縫。保持抽吸的凝膠以備后用。
RSA-L AM配體溶液在250mL Pyrex培養瓶中，用磷酸鈉緩沖液(pH6.8)，將大約27.5mLBSA-LAM配體溶液稀釋到100mL。向溶液中加入100mg結晶氰基硼氫鈉。應用提供的塑料蓋緊密關閉瓶子。通過簡單振蕩而充分混合。所述溶液可以呈現出乳白色，但是不應該有沉淀。可以看到由氰基硼氫鈉形成的顯微氣泡。
偶聯步驟
向上述制備的LAM溶液中加入抽吸的活化瓊脂糖凝膠。用提供的塑料蓋緊密關閉。使用輕輕振蕩(中等速度)充分混合所述混懸液，并且在37℃+/-2℃溫育大約4小時，每小時混合反應混合物(通過倒置)。加入7.5mL 1.5M Tris緩沖液，并且緊密關閉。繼續在37℃+/-2℃溫育大約16小時(過夜)。
將反應混合物轉移到燒結的玻璃濾器上，并且通過使用低真空(300mmHg)將液相收集到干凈的100-200mL Bunzen燒瓶中。用約800ml去離子水洗滌在濾器上的LAM-瓊脂糖凝膠。繼續用大約1.2L 1×PBS洗滌。
柱的包裝和保存在250-mL燒杯中，向上述凝膠中加入約160mL 1×PBS。人工攪動(用刮刀/玻璃棒)成漿狀。按照標準方法，使用1×PBS裝柱。用帶有0.1％疊氮鈉的1×PBS平衡柱子。
圖7示例性地描述了包括純化的LAM的應用和親和柱I和II的制備的上述步驟。
用親和層析-I分離抗體(“直接法”)制備下列儲液1升0.1M甘氨酸緩沖液，并且用1M HCl調節pH到2.5。
1升3×PBS溶液(用去離子水稀釋10×PBS儲液)并且檢查pH，如果需要，用1M HCl或1M NaOH重新調節到7.2-7.4。
200mL 1×PBS加0.1％疊氮鈉溶液。
100mL 0.5M磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液。
血清制備將冷凍的血清在冰箱中緩慢解凍(大約16小時/過夜)直到完全解凍。測定血清體積，并且對于每100mL血清稱重2.9g氯化鈉，并加入到血清中。輕輕旋振直到完全溶解終濃度為0.5M NaCl。
以～8000g離心(4-8℃)20分鐘。用巴斯德移液器從所有離心管中吸走上層清液。不要攪動沉淀。通過棉花塞緊的漏斗過濾上清，并且收集濾過液。收集的濾過液應該是微乳白色的，但是不應該含有任何微粒物質。將濾過的血清置于冰箱中直到應用。
血清應用通過用1×PBS平衡，準備柱I(未修飾的LAM偶聯到柱材料上)用于血清應用。調節流速為2.0mL/min，并且繼續應用1×PBS直到基線保持至少1小時的穩定。當需要時，將記錄器和檢測器調零。一旦基線穩定，調節流速到0.5-0.6mL/min，然后以0.5-0.6ml/min流速將上文制備的血清上樣到LAM親和柱I上。收集無用的(void)體積洗脫液(其約為柱體積的30％)。通過260-280nm的UV檢測而監測級分，并且當信號增加發生時，開始收集500-1000mL血清中流過柱子的血清。當全部體積的血清都上樣到柱子上時，暫時停止柱子流動，上樣3×PBS緩沖液，然后重新開始液體流動。繼續用3×PBS洗滌柱子，直到信號下降到基線的大約50％。在這一點，停止收集血清，并且保存所有收集到的級分。改變流速到2.0mL/min，并且繼續用3×PBS洗滌柱子，直到基線約為10-15％。棄掉穿透液。用1×PBS緩沖液代替3×PBS緩沖液，并且以2.0mL/min的流速用大約2-2.5柱體積洗滌。棄掉穿透液。
抗體洗脫步驟將流速調節到1.0mL/min。用上文制備的冰冷的0.1M Gly-HCl緩沖液代替1×PBS，并且開始洗脫吸附的抗體。當信號迅速增加并且增加到全刻度的約10-15％時，開始收集洗脫液系列(eluent column)，收集到置于冰-水浴(0℃)上的15ml圓錐形管子中。收集5-ml級分。
繼續收集在Gly-HCl緩沖液中的抗體，直到信號開始迅速減小。當信號下降到開始收集時的信號水平(全刻度的10-15％)時，停止級分收集。通過向每5-mL級分中以0.1-mL的增加量加入0.5mL 0.5M Na2HPO4，而中和收集的抗體。加入的總體積應該等于中和前級分體積的10％。
在加入Na2HPO4緩沖液過程中輕輕混合溶液，并且匯集所中和的級分。針對只含有0.1M Gly-HCl緩沖液的空白測定抗體在280nm的O.D.，并且計算抗體濃度。將收集的抗體置于2-8℃最少3天，以允許碰撞(crashing)和釋放(shedding)。
柱的維護用1×PBS平衡柱子直到中性(pH7)。不用時，用1×PBS加0.1％疊氮鈉溶液平衡柱子，并且將柱子保存在4-8℃以備將來應用。
透析將制備的抗體以10,000G離心最少5分鐘。將上清轉移到12-14mol.wt.截留透析管中，并且針對1×PBS透析2-3天，最少更換4次緩沖液，Ab溶液與總體積的比例≥1∶20。從透析中移出抗體。使用玻璃量筒，測定抗體溶液的體積。如果存在一些多余的碰撞/釋放(以沉淀物的形式)，那么將抗體溶液再以10,000G離心最少5分鐘。用1×PBS緩沖液將分光光度計調整空白后，在280nm測定抗體的O.D.。計算濃度，單位mg/mL，并且置于4-8℃保存。
用親和層析-II分離抗體(“富集法”)純化高度特異性的抗體以2.0mL/min的流速上樣1×PBS到上文制備的LAM親和柱2，(LAM通過使用NaIO4強氧化修飾、偶聯到柱材料上)，直到基線保持至少15分鐘的穩定。當需要時，將記錄器和檢測器調節到零。接下來的30分鐘內，繼續監測基線，并且一旦穩定，將抗體上樣到柱上。調節流速到0.5-0.6mL/min，并且使用Econo泵或相似的裝置，上樣上文制備的一定量抗體到LAM親和柱2上，所述一定量的抗體對應～100-150mg Ab。在280nm收集無用的體積洗脫液(其約為柱體積的30％)。當信號增加到高于基線約10-15％時，開始將抗體收集到干凈的血清瓶中。當全部抗體體積都被上樣時，暫時停止液體流動，上樣1×PBS緩沖液，并且以0.5-0.6mL/min繼續開始液體流動。繼續在280nm收集流過柱子的物質。當信號下降到高于開始收集時信號的10-15％時(高于基線30-50％)，停止收集溶液。
后來測定高度特異性抗體在280nm處的O.D.，并且計算抗體濃度。立即將抗體溶液置于4-8℃用于暫時的保存。
柱洗滌繼續用1×PBS以2.0-2.5mL/min的流速洗滌柱子。流過最少3柱體積的1×PBS。用上文制備的冰冷的0.1M Gly-HCl緩沖液洗脫吸附在柱子上的物質。將洗脫的物質收集到玻璃小瓶中。當監測器/信號下降到基線的～10-15％時，停止收集。通過以0.5mL的增加量，加入總體積的10％的上文制備的0.5M磷酸鈉，而中和收集的抗體溶液。測定抗體在280處的O.D.，并且計算抗體濃度。立即將收集的抗體溶液置于4-8℃，并且保存到完成對在上述步驟收集的抗體的分析。如果上述抗體濃度低于0.3mg/mL，那么進行濃縮。
用最少3柱體積的1×PBS以2.0-2.5mL/min流速洗滌柱子。再用1柱體積的1×PBS加0.1％疊氮鈉洗滌柱子，并且保存在4-8℃以備將來應用。
圖8示例性地描述了上述步驟，所述步驟表現了使用直接和富集法從親和柱I和II分離富集的抗體。
ELISA平板包被過程。
建立Moduline 300系統。
Ab包被必須在包被溶液M815制備后最多8小時內完成。在包被過程中，抗體包被溶液必須保持在冰上(0℃)。
步驟1預先稱重并且檢查空平板，并且丟棄任何壞掉的平板。使用Moduline300系統，向每個條形平板的每個孔中分配100mcl MTB-LAM特異性Ab包被溶液。在包被過程中，視覺上檢驗每個平板的所有96個孔充分充滿的均一性。保存未用的Ab溶液，并且保存在(2-8℃)直到全套平板都被處理并且投入使用。將分配了Ab的平板以每摞10個平板疊放在一起，并且用空平板作為蓋而覆蓋最上面的平板。將每摞蓋板標記為1到18。在2-8℃冷藏疊放的平板，并且溫育過夜(14-18hrs)。
步驟2建立Moduline 300系統，以進行3次洗滌循環，其后緊接著進行312μL封閉溶液的分配循環。封閉溶液必須在制備后最多24小時內應用。
從冰箱中取出平板，并且當將它們放置在Moduline上時，從每摞上取走覆蓋的平板，并且并排放置它們。定時6小時。將從傳送帶上下來所封閉平板擺放到連續編號的托盤上，并且在環境溫度(20-28℃)下封閉5-6小時。
將在托盤上的平板置于烘箱中，并且在20-23℃和20-22％相對濕度下溫育24-72hr。從烘箱取出干燥的平板。
制備用于偶聯HRP的MTB-Ab(制備MTB-Ab溶液應該在偶聯步驟前至少7天進行。)透析在2-8℃，針對1×PBS，透析需要用量的MTB-LAM-Ab溶液最少48h，最少更換4次。使用具有MWCO 12-14,000的透析管。透析后，以12,000rpm離心Ab溶液10min，并且小心地將上清吸到15ml刻度離心管中。
透析后，測定Ab溶液在280nm處的光學密度，并且計算透析后的Ab濃度。如果透析后Ab溶液具有OD280nm＞2.8，那么在1×PBS中進行1∶7的Ab溶液稀釋。
濃縮用1×PBS預先洗滌Amicon Ultrafree-15離心過濾裝置。將大約15mL1×PBS溶液放入裝置中，并且以3500rpm離心大約5min。從裝置部件中倒掉所有的溶液。通過在長工作臺上的離心機(斗式轉子)上以3500rpm離心大約5min×3，用Ultrafree-15離心過濾裝置將上述透析后的Ab溶液濃縮到4.5-5.5mg/ml。小心將濃縮的Ab溶液從Amicon裝置的過濾部件中吸出，放入15mL管中。為了最大化的回收，離心后立即取出濃縮的樣品，并且用移液器將濃縮體積重新懸浮幾次，以確保在吸取Ab前正確混合。
10000rpm將濃縮的Ab溶液離心大約15min，并且將Ab上層清液吸取到15mL管中。在1×PBS中以1∶20稀釋，測定Ab溶液的OD280，并且計算Ab的濃度。
取樣0.1ml Ab溶液用于ELISA分析。保存在2-8℃。
制備MTB-LAM-Ab-HRP綴合物洗滌用于偶聯步驟的所有的玻璃小瓶和攪拌棒以及用于用H2SO4溶液保存綴合物的玻璃小瓶，并且用自來水和去離子水徹底潤洗它們。
制備用于層析的葡聚糖G-25柱獲得裝有葡聚糖G-25(Fine)的大約V＝50ml的柱子(1.5×30cm)。按上文所述進行裝柱。設定下述層析條件，以用1mM鈉鹽平衡柱子●醋酸緩沖液，pH4.4●280nm UV監測波長●監測器靈敏度0.2OD●圖表記錄器速度2mm/min●用于柱洗滌的泵流速60ml/h。
用大約100-150ml 1mM醋酸鈉pH4.4洗滌柱子，并且將UV監測器的基線調整到0位置。確保建立的基線穩定大約30min。計算偶聯所需的MTB-LAM-Ab溶液的用量，并且以12,000rpm離心Ab大約10min。小心將Ab上清吸到干凈的玻璃小瓶中。在1×PBS中以1∶20稀釋，測定Ab溶液的OD280nm，并且計算未稀釋的Ab溶液的濃度。將Ab溶液在使用前保存在2-8℃。
用NaIO4氧化HRP(辣根過氧化物酶)在V型玻璃小瓶中稱重8mg HRP。加入2.0ml去離子H2O。輕輕攪動所述溶液大約2-3min，直到所有的HRP都溶解。確保在玻璃小瓶壁上沒有留下未溶解的HRP顆粒。
制備0.1M NaIO4，pH4.4的新鮮溶液，并且在最多5分鐘內使用，避光保存。一邊攪拌，一邊向上述制備的HRP溶液中加入0.4ml 0.1MNaIO4。用鋁箔覆蓋小瓶，以便避光保存所述混合物。在環境溫度下一邊攪拌一邊將所述混合物溫育20min。向反應混合物中加入4滴乙二醇，并且攪拌大約2min。
氧化HRP的層析和濃縮完成步驟5.4.7后，立即通過在葡聚糖G-25(Fine)柱上的凝膠過濾而純化氧化的HRP。將用于樣品洗脫的泵流速設定為大約50ml/h。小心將上述制備的全部體積的氧化HRP上樣到干凝膠床上，但是小心不要攪動所述凝膠床。不要超過干凝膠。將所有氧化的HRP(帶顏色的溶液)收集到15ml管中。在層析圖表上的第一個峰(OD280nm＞0.05)。在層析完成后，倒空葡聚糖G-25柱，并且棄掉凝膠，并且記錄層析后的HRP溶液體積。
濃縮氧化的HRP用1mM醋酸鈉pH4.4預先洗滌Ultrafree-15離心過濾裝置，使用大約15mL的1mM醋酸鈉pH4.4，并且使用長工作臺上的離心機(斗式轉子)以3500rpm將過濾部件離心大約5min。然后從過濾部件棄掉所有的溶液。層析后，立即用Ultrafree-15離心過濾部件(生物最大-10K膜)，通過以3500rpm離心大約5min，而將氧化的HRP溶液(上文)濃縮到約2±0.2ml。小心將濃縮的HRP溶液從裝置的過濾部件吸到干凈的玻璃小瓶中，測定并記錄體積，并且保存在2-8C。
偶聯HRP與MTB-LAM-Ab計算與HRP偶聯所需的MTB-LAM-Ab溶液的用量。使用三角形的攪拌棒將MTB-LAM-Ab(上文)置于V型玻璃小瓶中，不要在瓶壁上留下Ab溶液的液滴。向所述MTB-LAM-Ab溶液中加入1/2體積的氧化HRP溶液(上文)，用鋁箔覆蓋小瓶，以便避光保存反應混合物，并且在室溫下將玻璃瓶中的反應混合物攪拌30分鐘。避免起泡。
加入1M碳酸鹽-HCl，至pH9.5，并且在室溫下攪拌2hr。避光保存，并且避免起泡。
在使用前立即制備4mg/ml的硼氫化鈉(NaBH4)，并且用鋁箔避光保存。立即加入對于上文制備的MTB-LAM-Ab溶液所需要的計算用量的NaBH4，并且將反應混合物在約2-8℃溫育2hr。在2-8℃，將反應混合物針對1×PBS透析48h，以8-16小時的時間間隔最少更換4次緩沖液。使用12-14kDa截留的透析管透析。
綴合物保存和分析透析后，將綴合物溶液以4000rpm離心大約4min。小心倒出上層清液并且將綴合物溶液置于干凈的6ml玻璃小瓶中。量取18ml Gardian過氧化物酶綴合物穩定劑/稀釋物到具有磁力攪拌的50ml玻璃瓶中。加入2ml MTB-Ab-HRP綴合物，并且將所述混合物攪拌大約10min。在2-8℃保存，并且避光。
圖9示例性地描述了關于制備MTB綴合物的上述步驟。
結果下面我們列出直接抗原ELISA評估的數據，對于富集抗體生產，其使用“直接法”檢測未處理的、未濃縮的尿液中的LAM。(相信通過使用上述“富集法”產生的富集抗體將形成甚至更好的數據。)通過Regional TB和Leprosy Programme和Mbeya Medical Research Project(MMRP)的合作，產生這些數據的研究在Mbeya地區進行，所述Mbeya地區位于坦桑尼亞的西南丘陵地帶。在Mbeya地區，每年大約有3,500例新的TB病例被診斷出來，并且按照國家DOTS方法進行治療。每次治療的開始在MbeyaReferral Hospital的中心機構開始。2002年，TB治愈率為72.3％。研究的目的是評估商業可獲得的LAM-捕獲ELISA在臨床應用中的性能，并且將所述結果與用于TB診斷的黃金標準相比較痰液顯微鏡檢、TB培養、胸腔射線照相法和臨床研究。
材料和方法
LAM-ELISA描述MTB-ELISA直接抗原三明治免疫檢測(MTB-ELISA，Chemogen，So.Portland，ME，USA)是一種與他人研發的檢測相似的LAM-ELISA。免疫血清從新西蘭白兔收集，所述新西蘭白兔用滅活的結核分枝桿菌H37Rv的全細胞進行免疫。通過使用固定的LAM作為配體的親和層析而分離多克隆LAM-特異性抗體。檢測試劑盒由下列各項組成96孔ELISA平板，其用LAM-特異性抗體預先包被，封閉并且密封在具有干燥劑的塑料袋中；具有LAM-特異性HRP-綴合的LAM-特異性多克隆抗體的小瓶；具有TMB單一成分發色底物的小瓶；具有陰性對照溶液的小瓶，和具有對應尿樣中的0.5ng/ml、1.5ng/ml和4.5ng/ml LAM的校準器的3個小瓶。當在450nm獲得的光學密度高于陰性對照的至少0.1(＞2SD)時，認為尿樣在ELISA中是陽性的。
將0.1ml的患者尿樣一式兩份置于ELISA平板上，溫育1小時，并且用0.05％吐溫-20/PBS(PBST)溶液洗滌。加入0.1ml LAM-特異性HRP-綴合物。溫育1小時后，將平板用PBST溶液洗滌，并且加入0.1ml TMB底物。10分鐘的溫育時間后，通過加入0.1ml 1M H2SO4而使底物反應終止，并且在450nm讀取顏色發生。
在其它實施方案中，確定含有抗原性活性的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)具體異構體被用于產生高度特異性的、高度純的多克隆抗體，以便應用與上文所述相似的流程，用于檢測要篩選活性結核菌的患者尿液中的分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖。使用LAM的選擇性氧化，而鑒定LAM的抗原性活性異構體，其中兩種異構體容易確認并且是可區別的(數據未顯示)。一種異構體含有對高濃度的高碘酸鈉(NaIO4)敏感的部分，以致在高濃度的高碘酸鈉下，LAM的血清活性被破壞。另一種異構體保留血清活性，甚至在經受高濃度的高碘酸鈉時仍保留血清活性。兩種LAM氧化方法的比較，使用輕微的氧化劑或低濃度的NaIO4保持了LAM的抗原性活性。然而，用高濃度的NaIO4氧化，導致LAM失去了抗原性活性。
因此，只有用CNBr活化、或者用輕微氧化劑或低濃度的NaIO4氧化的LAM被用來產生高度抗原型的LAM，以用于制備高度特異性的、高度純的多克隆抗體，從而用于檢測尿樣中的LAM而診斷目的患者中的TB。
與Svenson等公開的檢測方法(參見，例如WO97/34149)相比，這些結果完全是出乎意料的，Svenson等公開的檢測方法只使用高濃度的NaIO4氧化分枝桿菌LAM，因而破壞了用來產生抗體的LAM的抗原性活性。由于不知道存在多于一種異構形式的LAM可被檢測，在先前的公開內容中不可能制備針對抗原性活性形式的LAM的高度特異性的抗體，因為在這些研究之前，甚至沒有人知道存在一種獨立的異構體，所述異構體含有抗原性活性，或者在標準氧化方法中，即，用高濃度的NaIO4處理過程中，失去這樣的活性。
臨床地點描述。
在8周內，在坦桑尼亞Mbeya的5個臨床中心的門診部召集到242名TB懷疑患者。研究的標準流程包括臨床評估、胸腔射線照相、ESR、白血細胞×計數和HIV檢測、在第1、2和3天的痰液3×AFB染色(ZiehlNeelson)、在Loewenstein Jenssen培養基上的2痰液培養和在尿液和血清中的LAM-ELISA。
所有的患者都有TB的臨床癥狀(咳嗽＞4周，盜汗、體重減輕、沒有食欲)。這些患者中的137名患有實驗室確定的肺部TB(PTB)，9名患有高度放射性學上疑似的PTB(胸膜滲出或擴大的肺門淋巴結)，以及8名表現出軍事TB(military TB)的臨床和放射線學癥狀。對同意的患者檢測他們的HIV狀態，70％被確定為HIV-陽性。將數據機密地進行處理。本研究得到坦桑尼亞共和國的當地制度評議委員會和國家倫理委員會的核準。
所有的實驗流程都在Mbeya Medical Research Project的實驗室機構進行。
痰液樣品的顯微鏡檢和培養Ziehl Neelson染色和顯微鏡檢由有經驗的和非常有資格的實驗室技術人員進行。凈化后，將痰液樣品在Loewenstein Jenssen培養基中一式兩份培養。每周檢查培養物的生長，持續8周。
尿樣對于每名患者，在無菌塑料容器中收集30ml尿液，將其用各自患者的數據形式的編碼數字進行標記。將100μl新鮮的和未處理的尿液一式兩份地添加到ELISA平板的孔中。還將陰性對照、低的、中等的和高的陽性對照一式兩份地添加到每個平板中。將樣品在24h內處理，并且然后保存在-20℃，以備將來在德國檢測。
來自坦桑尼亞和美國的對照組在LAM-ELISA中檢測下列尿樣Mbeya Referral Hospital 23名職員的尿樣，Chemogen，Inc.20名職員的尿樣，和紐約2個門診部的200名患者的尿樣。所有這些尿樣都在臨床檢驗中表現為健康的，沒有任何呼吸傳染病的癥狀。
結果ELISA系統的預先臨床評估。
圖4a)顯示在尿液中使用不同濃度的LAM的應答曲線。按照這些曲線，將最佳截斷值定義為產生超過陰性對照的OD 0.1 OD的光學密度(OD)的LAM濃度，其與大于陰性對照樣品信號的多于2的標準偏差相對應。將具有大于這一截斷值的光學密度的所有樣品都視為是ELISA陽性的。在未處理的新鮮尿液中，所述截斷值等于大約0.25ng/ml的LAM。
評估MTB-ELISA與其它種屬的各種革蘭氏-陽性和革蘭氏-陰性細菌的交叉反應性，所述細菌種屬是尿道感染和細菌性肺炎的典型。即使在最高的檢測濃度，所檢測的物種沒有一種在評估的LAM-ELISA系統中表現出任何反應性(圖4b)。然而，在LAM-ELISA系統中，各種物種的分枝桿菌的全細胞分析表現出與所有檢測的分枝桿菌(M.)物種的交叉反應性(圖4c)，檢測出結核分枝桿菌H37Rv和牛分枝桿菌是最敏感的。從免疫化學觀點看來，這兩種物種是非常接近的，但是牛分枝桿菌極少在人類中引起分枝桿菌的感染。
研究參與者數據按照表1，將242名TB疑似患者分成3大類(1)具有確定的顯微鏡檢和/或培養物診斷的肺部TB患者，(2)具有典型的臨床和放射線學癥狀的患者和(3)具有TB臨床癥狀的患者，由于所有可用的診斷工具(放射線照相、痰液顯微鏡檢和培養)都是陰性的，它們不被認為是TB患者。
組1包括137名患有實驗室確定的肺部TB的患者。132名通過Loewenstein Jenssen培養而確定，和5名具有陰性培養物但是陽性的AFB-染色。132份培養物陽性病例中有62.12％為AFB陽性。
組2包括參與基于放射線學和臨床發現的DOTS治療項目的其他17名患者(表1)。組3的88名患者是痰液陰性的，并且沒有表現出特異的肺部TB放射線學癥狀，因此沒有參加DOTS項目。
參與者的平均年齡為34歲。女性和男性比例為41∶59。在同意進行HIV檢測的223名患者中的總體HIV流行率是1069.1％(參見表2)。HIV流行率在患有證實的TB的患者中為73.2％，在沒有證實的TB的患者中為60.8％。
ELISA的臨床評估在患有證實的肺部TB(培養物或AFB陽性)的137名患者中，有111名對于預先確定的截斷值(陰性對照的光學密度(OD)+0.1)是LAM-ELISA陽性的(靈敏度81.02％)。對于涂片和培養物陽性組(82)的平均OD增加量(＝絕對平均OD-陰性對照的OD)是0.604。對于涂片陰性和培養物陽性病例(50)，平均OD增加量是0.293，并且對于涂片陽性而培養物陰性病例(5)為0.249。
在組2的17名患者中，其培養物和AFB為陰性，但是具有典型的放射線學和臨床TB癥狀，13名(76.47％)具有陽性LAM-ELISA檢測結果，具有0.183的平均OD增加量。他們中的13名(76.47％)是HIV陽性的。
其余88名患者，他們來到特殊的TB門診部，具有暗示肺部TB的臨床癥狀，培養物和AFB是陰性的，并且沒有TB的特異性放射線學發現。在這些患者中，13名患者(14.77％)具有陽性LAM-ELISA檢測(平均OD增加量0.184)。
基于在每個平板上所包含的低的、中等的和高陽性對照的已知濃度，可以基于ELISA的OD值而確定每份尿液中的大概LAM濃度。在AFB陽性患者中，評估LAM濃度是否與個體的結核細菌負擔相關。盡管在顯微鏡檢下具有低密度結核細菌(AFB+)的患者在尿液中具有0.93ng/ml的平均LAM抗原濃度，但是具有中等密度的抗酸桿菌(AFB++)的患者在他們的尿液中具有1.74ng/ml的平均抗原濃度，并且AFB+++患者具有2.02ng/ml的平均抗原濃度(圖5)。由于坦桑尼亞實驗室所用的ELISA讀數儀不能讀出高于2的信號，高于2的信號對應大約4ng/ml，所以，后者值低于AFB+++患者尿液中真正的LAM濃度。
在確定的肺部TB患者中，HIV血清狀態沒有影響LAM-ELISA的靈敏性。與35名未感染的個體中有26名(74.3％)相比，在124名具有已知的HIV血清狀態和陽性TB培養和/或AFB染色的患者中，89名感染HIV的患者中有73名(82.0％)在LAM-ELISA中是陽性的。類似地，AFB的靈敏性沒有受到HIV血清狀態的破壞(comprised)。在感染HIV的和陰性個體中，靈敏度分別為61.2％和58.8％。
使用健康的坦桑尼亞人和美國志愿者的尿液，來評估所述檢測的特異性。分析了23名健康的坦桑尼亞血統的醫院職工的尿液。在LAM-ELISA中，沒有一份樣品被檢測出是陽性的(-0.047平均相對OD，特異性100％)。收集并分析了220名健康的美國志愿者的尿樣。除了4份外其余的都具有低于截斷值0.1的光學密度(特異性98.18％)。
討論用于TB診斷的經典工具，痰液培養和涂片顯微鏡檢具有明顯的局限性。這兩種方法只檢測開發性肺部TB的病例。這顯著地消弱了不管器官顯示與否而檢測所有的活性TB病例的可能性。因此，在過去已經評估了多種新方法，所述新方法可能補充所述經典的工具，特別是在資源匱乏的設置方面。對于這樣的新檢測所設定的標準為a)比顯微鏡檢更高的靈敏性，b)相當的特異性，c)有限的額外工作量，d)診斷痰液-陰性TB的可能性和e)不會被HIV共感染消弱的靈敏性。
在這種第一評估中，LAM-ELISA的靈敏性(81％的培養物陽性)優于AFB-染色(69％)。靈敏性可以通過將新鮮尿液濃縮而進一步的提高，然而，其將導致實驗室技術人員額外的努力。盡管病例數字不是足夠地高，不足以允許做出最終的結論，但是，對于具有放射線學確定的軍事TB的病例(87.5％)以及對于具有典型的肺部TB放射線學癥狀的痰液陰性病例(61％)的LAM-ELISA檢測率是令人鼓舞的。對于健康的個體，ELISA的特異性較高(在美國為98.18％和在坦桑尼亞為100％)。陽性TB病例培養物中的HIV共感染沒有影響LAM-ELISA的靈敏性。
與先前公布的LAM-ELISA結果相比，新的檢測在比先前的檢測更低的濃度(0.2ng/ml)檢測到LAM。與使用處理的和冷凍的尿液的先前檢測81.3％的靈敏度相比，對于未濃縮的和新鮮尿液，新檢測的靈敏度為82.9％(AFB+)。與先前研究中的86.9％相比，在本研究中檢測的特異性為98.36％。
這種交叉組合的TB研究的局限性是這樣的事實，即，一定比例的TB疑似患者在他們的TB狀態方面尚不能確定(組2和3)。為了確認這一問題，我們建立了用于分析的3大類組1實驗室確定的TB，組2臨床上和放射線學上診斷的TB，組3沒有TB的實驗室或放射線學證據。盡管我們確信第1類的參與者是真正的TB病例，但是我們不能排除第2和第3類含有一些錯誤歸類的患者。因此，我們將他們從我們的靈敏性和特異性計算中排除。TB的診斷通常需要對患者的一段時間的隨訪。特別地，具有異常放射線學特征的痰液陰性患者將需要幾次隨訪會診，以重新檢查他們的TB狀態。在一段時間的研究中，臨床的以及診斷重估和TB治療結果將對把組2和3分類為TB和非TB患者給出重要的其它信息。
在結核分枝桿菌的細菌負擔和在尿液中檢測到的LAM的量之間是否存在數量上的相關性，這一問題是主要的興趣所在。在交叉組合研究形式中闡述這一問題的唯一方法是使得AFB痰液染色得分與尿液中LAM的濃度相關。如在圖5中所示，尿液中抗原濃度和痰液中結核細菌密度存在明顯的正相關性。這樣的相關性揭示了LAM檢測的一些其它應用。治療成功的監測和完成治療后對復發的早期識別是直接應用相關的。與檢測肺外和AFB-陰性TB的能力組合使得LAM檢測成為在具有增加流行率的肺外形式的TB和具有異常臨床癥狀的肺部形式的環境中的潛在的工具。LAM-ELISA不僅可以用于具有臨床癥狀的患者的診斷，而且用于篩選HIV陽性患者和其它高危組。活性TB的早期病例檢測和有效治療是成功抗爭TB中的兩大支柱。為了進一步研究LAM檢測在這一抗爭中的作用，我們目前計劃一些有希望的和多通道的研究。
總而言之，LAM-ELISA可以容易地被結合在發達和發展中國家的實驗室常規診斷流程中。它可以容易地應用并且強有力地檢測。完成ELISA只需要2hr，并且許多樣品可以同時進行分析。由于抗原脂阿拉伯甘露聚糖是穩定的，所以可以將尿液冷凍保藏3天而沒有顯著降低光學密度。最近開發的用于檢測未處理尿液中的LAM的MTB-ELISA具有還可以在發展中國家野外條件下應用的篩選檢測的潛力。


表1。在來到OPD具有TB臨床懷疑的242名患者中和243名臨床上健康對照者中的尿液LAM分泌的分析。對于LAM-ELISA陽性(positively)的截斷值比平板上陰性對照的平均光學密度高出0.1。+＝陽性。

表2。在不同組中HIV患者的比例。242名患者中有223名同意進行HIV檢測。
權利要求
1.一種富集的抗體群，其對分枝桿菌的表面多糖抗原高度特異。
2.按照權利要求1的富集的抗體群，其中所述抗體通過在保持抗原性活性抗原的環境中產生而富集。
3.按照權利要求1的富集的抗體群，其中所述抗體通過排除識別相對沒有活性的抗原的抗體而富集。
4.按照權利要求2的富集的抗體群，其中所述抗體通過排除識別相對沒有活性的抗原的抗體而富集。
5.按照權利要求1的富集的抗體群，其中分枝桿菌是結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。
6.按照權利要求5的富集的抗體群，其中所述表面多糖是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
7.一種產生對分枝桿菌抗原高度特異的富集抗體的方法，所述方法包括產生并分離針對分枝桿菌抗原的抗體；并且從所分離的抗體中分離出對相對沒有活性的抗原特異的抗體群，以產生分離的富集抗體。
8.一種產生針對分枝桿菌抗原特異的富集抗體的方法，所述方法包括在保持抗原性活性的條件下從分枝桿菌分離抗原；和在保持其抗原性活性時，產生針對所述分離的抗原的抗體。
9.一種產生對分枝桿菌抗原高度特異的富集抗體的方法，所述方法包括將來自用分枝桿菌接種的哺乳動物的血清上樣到用從分枝桿菌分離的抗原制備的第一親和基質上，以致對所述分離的抗原特異的抗體被第一親和基質保留；從第一親和基質分離對所述分離的抗原特異的抗體；將分離的抗體上樣到分枝桿菌的修飾的抗原制備的第二親和基質上，以致對所述修飾抗原特異的抗體被第二親和基質保留，其中所述修飾的抗原已用一種試劑處理，以使其相對于分離的抗原而失活；通過收集第二親和基質的流出液而分離對所述分離抗原特異的富集抗體，以致所述富集抗體比非富集的抗體對分枝桿菌抗原更加高度特異，并且展現出對分枝桿菌抗原更高的敏感性。
10.按照權利要求7-9任一項的方法，其中所述分枝桿菌是結核分枝桿菌。
11.按照權利要求10的方法，其中所述表面多糖是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
12.按照權利要求9的方法，其中所述試劑是高碘酸鈉。
13.按照權利要求7-9任一項的方法，其中所述表面多糖從弗氏佐劑分離。
14.一種用于檢測受試者樣品中的分枝桿菌感染的方法，所述方法包括提供一種免疫反應性環境，這樣的環境從權利要求1-4任一項的富集抗體發展而來；將樣品在所述免疫反應性環境中反應，以檢測分枝桿菌感染。
15.按照權利要求14的方法，其中所述分枝桿菌感染是結核分枝桿菌(M.tuberculosis)。
16.按照權利要求15的方法，其中所述表面多糖是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
17.按照權利要求14的方法，其中所述免疫反應性環境包括ELISA。
18.按照權利要求14的方法，其中所述分枝桿菌感染是約尼病。
19.按照權利要求14的方法，其中所述分枝桿菌感染是肺部結核分枝桿菌感染。
20.按照權利要求14的方法，其中所述分枝桿菌感染是肺外結核分枝桿菌感染。
21.按照權利要求14的方法，其中所述樣品是痰液、血液、尿液、組織或其它適合的樣品的任何一種。
22.按照權利要求14的方法，其中所述樣品是未處理的未濃縮的尿液。
23.一種用于檢測樣品中的分枝桿菌感染的試劑盒，所述試劑盒包括提供免疫反應性環境的檢測，其中所述環境包括按照權利要求1-4任一項的富集抗體。
24.按照權利要求23的試劑盒，其中所述免疫反應環境包括ELISA。
25.按照權利要求23的試劑盒，其中所述分枝桿菌感染是結核分枝桿菌。
26.按照權利要求25的試劑盒，其中所述抗體是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。
27.按照權利要求23的試劑盒，其中所述免疫反應性環境被作為條帶檢測而進行。
全文摘要
富集抗體群，對于分枝桿菌表面多糖抗原高度特異。在相關實施方案中，所述抗體通過在保持抗原性活性抗原的環境中產生而富集。這些抗體可以在免疫反應性環境中用于檢測分枝桿菌感染在來自受試者的樣品中的存在。
文檔編號G01N33/569GK101014622SQ200580029939
公開日2007年8月8日 申請日期2005年7月20日 優先權日2004年7月20日
發明者V·A·庫爾欽, E·V·莫洛科娃, J·L·克里克 申請人:凱默根公司