專利名稱：熒光顯微鏡及熒光相關光譜分析裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種根據從被測試樣中的熒光物質發出的熒光的強度的隨時間的閃爍而對該熒光物質的平移擴散常數進行測量的熒光相關光譜分析裝置，及優選在該熒光相關光譜分析裝置中使用的熒光顯微鏡。
背景技術：
熒光相關光譜法(FCSFluorescence Correlation Spectroscopy)是一種向存在極低濃度熒光物質的溶液的被測試樣中的微小區域照射激發光，同時通過檢測在該微小的激發光照射區域產生的熒光強度、求出該熒光強度隨時間變化的自相關函數、分析該自相關函數，測定被測試樣中熒光物質的平移擴散運動的方法(例如，參照專利文獻1)。
使用如上所述的熒光相關光譜法來分析被測試樣中的熒光物質的熒光相關光譜分析裝置，由照射激發光與檢測熒光的共焦型熒光顯微鏡，和以通過熒光顯微鏡檢驗出的熒光的強度為基礎、求出自相關函數并進行分析的分析部構成。
在專利文獻1，提到關于使用熒光相關光譜法的多陣列檢測。在該文獻中所提到的多陣列檢測是，分別照射激發光于多個激發光照射區域，檢測這多個激發光照射區域分別產生的熒光，對各個激發光照射區域求出自相關函數并進行分析。
假定，如該文獻所述，能夠對于多個激發光照射區域，利用熒光相關光譜法，同時或者依次進行測定。例如，能夠觀測作為被測試樣的細胞的內部的蛋白質等分子間的相互作用。
專利文獻1日本國特許第3517241號公報。
發明內容
但是，例如，在對作為被測試樣的細胞的內部的多個激發光照射區域進行測定的情況下，這些需要進行測定的多個激發光照射區域，不限定為存在于與激發光入射方向垂直的規定平面上，也存在于與激發光入射方向不同的位置，而且，存在對細胞內進行三維測定的情況。另外，細胞內部的透射率和折射率也不一定均一，激發光照射強度的不均一和像差也是問題。
然而，含有專利文獻1所記載的內容的裝置里的激發光照射系統，不適用于在與激發光照射方向不同的位置上存在多個激發光照射區域的情況，和透射率與折射率不均一的情況。在專利文獻1里，沒有公開和暗示有關，用于向多個激發光照射區域分別照射激發光的激發光照射光學系統的構成，和用于檢測分別產生于多個激發光照射區域的熒光的熒光檢測光學系統的構成。
本發明正是為了解決上述問題，提供了一種熒光顯微鏡以及熒光相關光譜分析裝置，具有，可適用于對于多個激發光照射區域的各個，同時或依次利用熒光相關光譜法進行測定的激發光照射光學系統。
為了解決上述課題，本發明的熒光顯微鏡，向被測試樣照射激發光并檢測與之對應而產生的熒光，其特征在于，具有(1)激發光源部，輸出激發光；(2)激發光照射光學系統，具有對從激發光源部輸出的激發光進行空間調制的空間光調制元件，并將由該空間光調制元件進行空間調制后的激發光照射于被測試樣上；(3)熒光檢測光學系統，接受在利用激發光照射光學系統照射激發光的區域上產生的熒光并進行成像，同時，具有對入射到該成像面內的規定區域上的熒光進行選擇地輸出的選擇輸出單元；(4)檢測部，檢測選擇輸出單元輸出的熒光的強度。
另外，本發明的熒光相關光譜分析裝置，其特征在于，具有上述本發明的熒光顯微鏡和分析部，該分析部，求出由熒光顯微鏡的檢測部檢測的、熒光強度的隨時間變化的自相關函數。
在本發明中，從激發光源的輸出激發光，由在激發光照射光學系統中含有的空間光調制元件進行空間調制，并照射在被測試樣上。使在照射有由激發光照射光學系統產生的激發光的區域中產生的熒光，利用熒光檢測光學系統成像，并利用選擇輸出單元選擇地輸出輸入到該成像面的規定區域內的熒光。從選擇輸出單元輸出的熒光的強度被檢測部檢測。然后，利用分析部求出由檢測部檢測的熒光的強度隨時間變化的自相關函數。
在此，在激發光照射光學系統中含有的空間光調制元件優選為相位調制型。在熒光檢測光學系統中含有的選擇輸出單元優選為空間光調制元件，更優選為強度調制型的空間光調制元件。另外，本發明的熒光顯微鏡優選具有對被測試樣進行攝像的攝像單元。
本發明的熒光顯微鏡，優選為(1)激發光源部，分別輸出波長互不相同的第1激發光和第2激發光；(2)作為激發光照射光學系統的空間光調制元件，對于第1激發光及第2激發光分別設置有專用的空間光調制元件，同時，激發光照射光學系統，以同一光路向被測試樣照射進行空間調制后的第1激發光及第2激發。(3)熒光檢測光學系統，具有分離部，分離在被測試樣的照射有第1激發光的區域上產生的第1熒光，和在照射有第2激發光的區域上產生的第2熒光，同時，對于第1熒光及第2熒光的各個單獨地具有選擇輸出單元。(4)檢測部，檢測從選擇輸出單元輸出的第1熒光及第2熒光各自的強度。
此時，本發明的熒光相關光譜分析裝置，特征在于，具有，上述本發明的熒光顯微鏡和分析部，該分析部求出由所述熒光顯微鏡的所述檢測部檢測的、第1熒光及第2熒光各自的強度的隨時間變化的互相關函數。
在此情況下，從激發光源輸出的第1激發光及第2激發光，分別由激發光照射光學系統中含有的空間光調制元件進行空間調制，以同一光路照射在被測試樣上。在第1激發光照射的激發光照射區域內產生的第1熒光和在第2激發光照射的激發光照射區域內產生的第2熒光，利用熒光檢測光學系統進行分離并成像。輸入該成像面的規定區域的各個熒光通過選擇輸出單元進行選擇輸出。從選擇輸出單元輸出的第1熒光及第2熒光各自的強度通過檢測部檢測。而且，通過檢測部，求出由熒光顯微鏡的檢測部檢測的第1熒光及第2熒光各自的強度隨時間變化的互相關函數。
本發明的熒光顯微鏡及熒光相關光譜分析裝置，對于多個激發光照射區域的各個，可同時或依次利用熒光相關光譜法進行測定。
圖1是本發明的第1實施方式的熒光相關光譜分析裝置1的構成圖。
圖2是物鏡101及被測試樣的1的放大圖。
圖3是被測試樣1中的激發光照射區域的放大圖。
圖4是空間光調制元件115的激發光空間相位調制的第1例的示意圖。
圖5是空間光調制元件115的激發光空間相位調制的第2例的示意圖。
圖6是空間光調制元件115的激發光空間相位調制的第3例的示意圖。
圖7是空間光調制元件115的激發光空間相位調制的第4例的示意圖。
圖8是空間光調制元件115的激發光空間相位調制的第5例的示意圖。
圖9是空間光調制元件115的激發光空間相位調制的第6例的示意圖。
圖10是使用第實施方式的熒光相關光譜分析裝置10的熒光相關光譜測定順序的流程示意圖。
圖11是在步驟S3被攝像的被測試樣1的像和在步驟8得到的被測試樣1的熒光檢測結果的示意圖。
圖12是第2實施方式的熒光相關光譜分析裝置20的構成圖。
符號說明1 被測試樣2 透明平板10 熒光相關光譜分析裝置11 熒光顯微鏡12 分析部13 表示部20 熒光相關光譜分析裝置21 熒光顯微鏡
22 分析部101 物鏡102～104分色鏡105 半透鏡106、107反射鏡111 激光源112 ND濾光片113 光束擴展器114 反射鏡115 空間光調制元件121 激光源122 ND濾光器123 光束擴展器124 反射鏡125 空間光調制元件131 透鏡132 帶通濾光器133 空間光調制元件134 檢測部141 透鏡142 帶通濾光器143 空間光調制元件144 檢測部151 透鏡152 帶通濾光器153 CCD(電荷耦合器件)具體實施方式
下面，參照附圖，詳細說明適合本發明的具體實施方式
。為了更加容易地理解本說明，對于各圖里的同一個構成要素采用同一個代號，重復的說明被省略。
第1實施方式首先，說明本發明的熒光顯微鏡及熒光相關光譜分析裝置的第1實施方式。圖1是第1實施方式的熒光相關光譜分析裝置10的構成圖。此圖中所示的熒光相關光譜分析裝置10，具有熒光顯微鏡11、分析部12及表示部13，向透明平板2上放置的被測試樣1照射激發光，檢測該被測試樣1里產生的熒光。
熒光顯微鏡11，具有物鏡101、分色鏡102、半透鏡105、反射鏡106、激光源111、ND濾波器112、光束擴展器113、反射鏡114、空間光調制元件115、透鏡131、帶通濾波器132、空間光調制元件133、檢測部134、透鏡151、帶通濾波器152及CCD153(電荷耦合器件；Charged Coupled Device)。
從激光源111到被測試樣1的光學系統構成，用于將從激光源111輸出的激發光照射在被測試樣1上的激發光照射光學系統。從被測試樣1到檢測部134的光學系統構成向檢測部134導入在被測試樣1中產生的熒光的熒光檢測光學系統。另外，從被測試樣1到CCD153的光學系統構成用于對被測試樣1進行攝像的攝像光學系統及攝像單元。
激光源(激發光源部)111，輸出激發光，該激發光具有能夠激發被測試樣1里含有的熒光物質的波長。ND濾光器112，能夠調整從激光源輸出的激發光的強度。光束擴展器113，輸入來自ND濾波器112輸出的激發光，將其激發光的光束直徑擴大到適當的大小，同時進行準直并輸出。
空間光調制元件115，輸入從光束擴展器113輸出并被反射鏡114反射的激發光，對此激發光進行空間調制，然后輸出空間調制后的激發光。空間光調制元件115，其空間調制是可變的，通過將進行空間調制的激發光經由以后的光學系統而向被測試樣1照射，可以設定在被測試樣1中照射激發光的區域的個數、位置、形狀，另外，也可以消除激發光照射強度的不均一和像差的問題。
這個空間光調制元件115，可以是透射型，也可以是反射型。另外，空間光調制元件115，可以是振幅調制型，可以是相位調制型，也可以是對振幅和相位兩者進行調制而得。但是，從激發光的利用效率這一點來看，空間光調制元件115優選是相位調整型。例如，作為空間光調制元件115，也可以采用在平面上二維排列含有液晶的微小像素的元件。
分色鏡102，在反射從空間光調制元件115輸出的激發光并向物鏡101入射的同時，使從物鏡101輸出的熒光透射。物鏡101，輸入由分色鏡102反射的激發光，將該激發光照射在被測試樣1中的規定區域(激發光照射區域)。另外，物鏡101輸入在激發光照射區域產生的熒光，將此熒光輸出到分色鏡102。
半透鏡105，輸入從物鏡101輸出并透過分色鏡102的光，通過使其一部分反射、其余部分透射而將光分支為2個方向，被反射的光向透鏡131輸出，透射的光向反射鏡106輸出。而且，代替半透鏡105，也可以使用裝卸自如的反射鏡。透鏡131，輸入由半透鏡105反射的熒光，與物鏡101一起，在空間光調制元件133上形成在被測試樣1中的激發光照射區域中產生的熒光的像。帶通濾光器132設置在透鏡131和空間光調制元件133之間的光路上，在選擇性透射熒光的同時，屏蔽激發光的散射成分。
空間光調制元件133用于選擇輸出單元，對入射到由物鏡101及透鏡131形成的熒光成像面內的規定區域中的熒光，進行選擇性輸出。也可以使用具有開口的屏蔽器，來替換空間光調制元件133，使熒光像位于開口位置(規定區域)。但是，由于優選可使該規定區域的位置為可變，因而，空間光調制元件133，優選使熒光成像面中，需要選擇地輸出熒光的規定區域的個數、位置和形狀為可變。通過這樣，能夠實現等效的共焦光學系統。
空間光調制元件133，可以是透射型，也可以是反射型。另外，空間光調制元件133，可以是振幅調制型，可以是相位調制型，也可以是對振幅和相位兩者進行調制而得的。但是，由于檢測光學系統中的空間光調制元件133，與激發光照射光學系統中的空間光調制元件115相比，由于不要各種條件控制，所以從成本的觀點來看，優選使用強度調制型。例如，作為空間光調制元件133，適于使用德州儀器社(TexasInstruments Inc.)的數字微反射鏡器件(DMDDigital MicromirrorDevice)。
檢測部134，檢測從空間光調制元件133輸出的熒光的強度。作為這個檢測部134，優選使用光電子倍增管或雪崩光電二極管(avalanchephotodiode)。分析部12，存儲由檢出部134檢測的熒光的強度隨時間變化的函數I(t)，并由該I(t)求出自相關函數G(τ)(下述(1)式)。然后，以這個自相關函數G(τ)為基礎，就能夠求出被測試樣1中激發光照射區域里的熒光物質的平移擴散系數。這里，t是時間變量，τ是表示相關時間的變量。
G(τ)=⟨I(t)·I(t+τ)⟩⟨I(t)⟩2---(1)]]>反射鏡106，向透鏡151反射透過半透鏡105的光。透鏡151，輸入通過反射鏡106反射的光，與物鏡101一起，在CCD153的攝像面上形成由被測試樣1中的激發光照射區域產生的光的像。帶通濾光器152設置在透鏡151和CCD153之間的光路上，在透射熒光的同時，遮蔽激發光的散射成分。CCD153，對形成在攝像面上的像進行攝像。另外，表示部13適用于表示分析部12產生的分析的結構。
圖2是物鏡101及被測試樣1的放大圖。作為物鏡101使用水浸類型，在物鏡101和透明平板2之間的光路上填充有水3。透明平板2為，由對于激發光及熒光雙方均透射率高的無熒光性材料構成的平板，例如，由石英玻璃制成的蓋玻片。被測試樣1被放置在透明平板2上。
被測試樣1中的激發光照射區域，與激發光照射光學系統中的空間光調制元件115的激發光空間調制相對應地，對個數、位置、形狀進行設定。這是由于，利用由被空間光調制元件115進行的空間調制而調整過波陣面的激發光，受到了從空間光調整元件115到被測試樣1的光學系統的光學傳遞系數的影響后，照射在被測試樣1上。也就是說，空間光調制元件115的激發光空間調制，是根據從空間光調制元件115到被測試樣1的光學系統的光學傳遞系數及被測試樣中的所期望的激發光照射區域的位置而決定的。各激發光照射區域的位置，不僅能夠對與物鏡101垂直的方向(x方向、y方向)進行設定，也能夠對與物鏡101的光軸平行的方向進行設定。激發光能夠同時或依次分別照射于多個激發光照射區域。
在圖2中，被測試樣1，有觀測區域1A和觀測區域1B。觀測區域1A和觀測區域1B，折射率或透射率互不相同。另外，還顯示了三個激發光照射區域P1～P3。激發光照射區域P1、P2位于觀測區域1A內，激發光照射區域P3位于觀測區域1B。
圖3是被測試樣1中的激發光照射區域的放大圖。一般說來，若用聚光透鏡對某個具有有限光束直徑的光進行聚光，則在其聚光位置上的光束，徑向的強度呈高斯形狀，具有半徑為w的光束腰(beamwaist)。在熒光相關光譜法中，作為激發光照射區域考慮在半徑w上長度L的圓柱狀區域，使存在于該激發光照射區域中的熒光物質的個數為幾個左右。而且，通過使熒光物質進出激發光照射區域，使存在于激發光照射區域的熒光物質的個數也隨時間而變化，從激發光照射區域產生的熒光的強度也隨時間變化，因此，以表示該熒光強度隨時間變化的自相關函數為基礎，就能夠求出激發光照射區域里的熒光物質的平移擴散常數。
圖4～圖9是空間光調制元件115中的激發光空間調制的實施例的示意圖。圖4(a)、圖5(a)、圖6(a)、圖7、圖8及圖9，分別以顏色的濃淡表示每個像素的激發光的相位調制，例如，對于等分從0到2π的的256份的相位值，以256階的濃淡來表示。另外，在圖4(b)、圖5(b)及圖6(b)中，以黑點表示物鏡101視野中的被測試樣1的激發光照射區域的位置。
在圖4所示的第1實施例中，在空間光調制元件115上形成如同一圖的(a)所示的2維相位等級，與此相對應，在被測試樣1上形成如同一圖的(b)所示的兩個激發光照射區域。同樣在同一圖的(b)中，位于左邊激發光照射區域中的激發光的強度，成為位于右邊激發光照射區域中的激發光的強度的2倍。
在圖5所示的第2實施例中，在空間光調制元件115上形成如同一圖的(a)所示的1維相位等級，與此相對應，在被測試樣1上形成如同一圖的(b)所示的1個激發光照射區域。在被測試樣1上形成的激發光照射區域的位置，對應于空間光調制元件115上形成的1維相位等級的周期及方位，且能夠對于與物鏡101光軸垂直的方向(x方向、y方向)進行調整。
在圖6所示的第3實施例中，在空間光調制元件115中形成如同一圖的(a)所示的2維相位等級。與此相對應，在被測試樣1中形成如同一圖的(b)所示的兩個激發光照射區域。在被測試樣1中形成的各個激發光照射區域的位置，對應于在空間光調制元件115中形成的2維相位等級的各個方位及周期。同樣在同一圖的(b)中，在位于左邊激發光照射區域中的激發光的強度，與位于右邊激發光照射區域中的激發光的強度相互不同。
在圖7所示的第4實施例中，在空間光調制元件115中形成，以主光線入射位置為中心點，在徑向相位逐漸變化的空間相位調制模式。在這種情況下，空間光調制元件115，起到了與折射率分布型透鏡相同的作用。在被測試樣1中形成的激發光照射區域的位置，與空間光相位調制元件115中的徑向的相位變化率相對應，能夠對于與物鏡101的光軸平行的方向進行調整。
在圖8所示的第5實施例中，在空間光調制元件115中形成的空間相位調制模式，將圖5(a)所示的空間相位調制模式和圖7所示的空間相位調制模式復合而成。在此情況下，在被測試樣1中形成的激發光照射區域的位置，能夠對于與物鏡101的光軸垂直的方向(x方向、y方向)進行調整，同時，也能夠對于與物鏡101的光軸平行的方向進行調整。
在圖9所示的第6實施例中，空間光調制元件115中形成的空間相位調制模式，能夠修正從空間光調制元件115到被測試樣1的光學系統的非點像差。
從圖4～圖9可以判斷，與空間光調制元件115中的激發光的空間相位調制模式相對應，能夠對在被測試樣1里形成的激發光照射區域的個數、位置、激發光強度進行調整，另外，也能夠修正激發光照射光學系統的像差(不僅是非點像差，也包括色像差及球面像差)。而且，通過將其他的空間相位調制模式與圖9所示的空間的相位調制模式相重合，并在空間光調制元件115上的形成，從而，可以同時進行在被測試樣1上形成的激發光照射區域的個數、位置、激發光強度的調整及激發光照射光學系統的像差的修正。
接下來，就使用第1實施方式的熒光相關光譜分析裝置10的熒光相關光譜測定的一例進行說明。圖10是使用第1實施方式的熒光相關光譜分析裝置10的熒光相關光譜測定順序的流程圖。
首先，在步驟S1中，用標準試樣代替被測試樣1放置在透明平板2上，并進行熒光檢測。在此，標準試樣是，在粘性已知的媒質(緩沖液)中存在的分子量已知的熒光物質。作為緩沖液可以用例如水。作為熒光物質，可以使用熒光蛋白質(GFPGreen Fluorescence Protein)，或者，也可以使用以羅丹明(Rhodamin)和紫翠玉(Alexa)等熒光色素標記的血管緊縮素(Angiotensin)或生物素(Biotin)。
在將如上標準試樣放置于透明平板2上的狀態下，從激光源111輸出激發光(例如波長488nm)。該激發光，通過ND濾光器112對強度進行調整，通過光束擴展器113對光束直徑進行調整，并由反射鏡114反射，入射到空間光調制元件115。入射到空間光調制元件115并進行空間調制后的激發光，由分色鏡102反射，通過物鏡101，照射到透明平板2上的標準試樣。
在標準試樣的激發光照射區域里產生的熒光，通過物鏡101、分色鏡102、半透鏡105、透鏡131及帶通濾波器132，入射到空間光調制元件133。在入射到空間光調制元件133的熒光中的入射到規定區域的熒光，由檢測部134受光并檢測強度，并利用分析部12存儲該檢測出的熒光的強度隨時間的變化I(t)。此時，從標準試樣內激發光照射區域到空間光調制元件133的光學系統，構成了等效的共焦光學系統。
在接下來的步驟S2中，通過分析部12，解析在步驟S1中檢測的熒光強度隨時間的變化I(t)。也就是說，能夠從I(t)求出自相關函數(上述(1)式)，該求出的自相關函數，通過假定理想分子運動模型的情況下的下述(2)式的自相關函數G(τ)，進行擬合(fitting)處理。在式(2)中，F為三重態(triplet)的比例，τtrip是三重態的衰減時間，N為激發光照射區域內的平均數，M為成分識別號(M＝1、2或3)，yi是第i成分的貢獻率，τDi是第i成分的平移擴散時間。此外，S是由激發光照射區域的半徑w和長度L所決定的構造參數(參照圖3)。
式2
G(τ)=1+F·exp(-ττtrip)1-FN{Σi=1Myi(1+ττDi)(1+ττDi·1S2)}+1---(2a)]]>Σi=1Myi=1---(2b)]]>在該擬合處理中，例如，可以使用最小二乘法，以通過實際測量得到的自相關函數為基礎，決定假定理想分子運動模型情況下的自相關函數中的參數。這里需要決定的參數為，標準試樣中的熒光物質的平移擴散時間τDi，及激發光照射區域內的熒光物質的平均個數N。若求出標準試樣中的熒光物質的平移擴散時間τDi，就也能夠求出熒光物質的大小。另外，若求出激發光照射區域內的熒光物質的平均數N后，就不難從實際測定時的熒光強度求出一個熒光分子的熒光量。
在接下來的步驟S3中，在透明平板2上放置作為測定對象的被測試樣1，并對被測試樣1進行攝像。在此，被測試樣1為例如細胞，具有折射率和透射率互不相同的觀測區域1A和觀測區域1B(參照圖2)。而且，在被測試樣1里，摻有與步驟S1、S2中的標準試樣里摻有的物質相同的熒光物質。
在將如上被測試樣1放置于透明平板2上的情況下，從激光源111輸出激發光。該激發光，通過ND濾光器112對強度進行調整，通過光束擴展器113對光束直徑進行調整，被反射鏡114反射，入射到空間光調制元件115。入射到空間光調制元件115的并進行空間調制后的激發光，由分色鏡102反射，通過物鏡101，照射到透明平板2上的被測試樣1。這時，空間光調制元件115的激發光的空間調制隨時間變化，在被測試樣1里，2維掃描點狀的激發光，或者，1維掃描線狀的激發光。
在被測試樣1內的激發光照射區域里產生的熒光，通過物鏡101、分色鏡102、半透鏡105、反射鏡106、透鏡151及帶通濾光器152，在CCD153的攝像面上成像。如上所述，通過對向被測試樣1的激發光的照射進行掃描，由CCD153對被測試樣1進行攝像。然后，該被拍攝的被測試樣1的像由表示部13表示。由此，被測試樣1的觀測區域1A和觀測區域1B能夠嚴格區分開來。另外，在對此被測試樣1進行攝像時，也可以使用用于對被測試樣1進行照明的專用的照明光源和照明光學系統。
在接下來的步驟S4中，上述的被測試樣1被放置在透明平板2上，進行與步驟S1相同的熒光檢測。在此，被測試樣1內的觀測區域1A及觀測區域1B分別形成激發光照射區域。例如，觀測區域1A內形成激發光照射區域P1、P2，觀測區域1B內形成激發光照射區域P3(參照圖2)。然后，分別對于激發光照射區域P1～P3，通過分析部12，存儲檢測出的熒光的強度隨時間的變化I(t)。
在接下來的步驟S5中，與步驟S2一樣，通過分析部12分析在步驟S4中的激發光照射區域P1～P3各自的熒光強度隨時間的變化I(t)。由此，對激發光照射區域P1～P3求出各自的熒光物資的平移擴散時間或平均個數。
在接下來的步驟S6中，對于觀測區域1A里的激發光照射區域P1、P2判斷是否與在步驟S5中得到的結果等同。如果，兩者的結果不等同，則必須調整照射在激發光照射區域P1、P2各自中的激發光強度，改變由空間光調制元件115產生的激發光的空間調制，再次進行步驟S4、S5。另一方面，如果兩者的結果等同，則進入下一步驟S7。
在步驟S7中，對于透明平板2上的被測試樣1，摻入可以與已經摻入的熒光物質強烈結合的其他分子，并與步驟S4一樣，進行熒光檢測。在此，例如，在已經摻入的熒光物質為GFP的情況下，新摻入的其他分子就應該是抗GFP。在已摻入的熒光物質是以熒光色素標記的血管緊縮素的情況下，新摻入的其他分子就應該是抗血管緊縮素。另外，在已摻入的熒光物質是以熒光色素標記的生物素的情況下，新摻入的分子就應該是抗生物素。然后，分別對于激發光照射區域P1～P3，通過分析部12，存儲檢測出的熒光強度隨時間的變化I(t)。
在接下來的步驟S8中，與步驟S5一樣，通過分析部12分析在步驟S7中的激發光照射區域P1～P3的各自的熒光強度隨時間的變化I(t)。由此，對激發光照射區域P1～P3求出各自的熒光物質的平移擴散時間和平均個數。已經摻雜的熒光物質(分子A)和新摻雜的其他分子(分子B)結合而成的分子AB，與分子A相比，由于分子量變大，布朗運動變慢，因而，平移擴散系數大。
因此，通過比較對于激發光照射區域P1～P3各自而得到的熒光物質的平移擴散時間，能夠求出在觀測區域1A及觀測區域1B各自中的分子A和分子B的結合程度。另外，也能夠求出，在觀測區域1A及觀測區域1B中，分子A和結合分子AB的檢測比率和分離常數(Kd值)，或者，能夠求出分子A及結合分子AB各自的平移擴散時間。(參照日本特開平11-326208號公報)。
在步驟S7、S8中，即使不對透明平板2上的被測試樣1摻雜新的其他分子，在已經摻入被測試樣1的熒光物質，與被測試樣1內已經存在或生成的其他分子強烈結合的情況下，同樣能夠分析出這些熒光物質與其他分子的相互作用。例如，在已經摻入的熒光物質為以熒光色素對規定排列的核酸(DNA、RNA)進行標記的物質時，被測試樣1內的其他分子是，由被測試樣1的細胞的內部生成的分子(能夠與已摻雜的核酸強烈結合的核酸或蛋白質)。此外，在通過外部刺激促進或抑制分子結合的情況下，也同樣，能夠測定分子間的相互作用。這里所說的外部刺激，可以是電刺激、磁刺激、化學刺激、熱刺激、光學刺激、放射線刺激等。
在接下來的步驟S9中，將由步驟S3拍攝的被測試樣1的像，和由步驟S8得到的被測試樣1的熒光檢測結果進行對比。圖11是在步驟S3中攝像的被測試樣1的像和在步驟S8中得到的被測試樣1的熒光檢測結果的示意圖。同一圖的(a)僅顯示了在步驟S3拍攝的被測試樣1的像。同一圖的(b)重疊顯示了在步驟S3中拍攝的被測試樣1的像和在步驟S8被測試樣1的熒光檢測結果(熒光物質的平移擴散時間和平均個數)。例如，如圖所示，平移擴散時間按照，在觀測區域1A中并靠近觀測區域1B的區域1A1、在觀測區域1A中并包圍觀測區域1A1的區域1A2、在觀測區域1A中并包圍觀測區域1A2的區域1A3、在觀測區域1A中的其他區域1A4的順序增大。從這樣的表示，就能夠分析作為被測試樣1的細胞內部的蛋白質的作用等。
如上所述，依次變更空間光調制元件115中的激發光的空間調制模式，能夠得到物鏡101視野內的被測試樣1的熒光檢測結果的分布。這時，不僅對與物鏡101的光軸垂直的方向(x方向、y方向)，而且對與物鏡101的光軸平行的方向(z方向)，也能夠求出被測試樣1的熒光檢測結果的分布。因而，能夠得到物鏡101視野內的被測試樣1的熒光檢測結果的3維分布。
第2實施方式接下來，說明本發明的熒光顯微鏡及熒光相關光譜分析裝置的第2實施方式。圖12是第2實施方式的熒光相關光譜分析裝置20的構成圖。該圖中所示的熒光相關光譜分析裝置20，具有熒光顯微鏡21及分析部22，照射激發光于透明平板2上放置的被測試樣1，并檢測在該被測試樣1中產生的熒光。尤其是，該熒光相關光譜分析裝置20，適用于使用熒光互相關光譜法(FCCSFluorescence Cross CorrelationSpectroscopy)測定被測試樣1。
熒光顯微鏡21，具有物鏡101、分色鏡102、分色鏡103、半透鏡104、反射鏡106、反射鏡107、激光源111、ND濾波器112、光束擴展器113、反射鏡114、空間光調制元件115、激光源121、ND濾光器122、光束擴展器123、反射鏡124、空間光調制元件125、透鏡131、帶通濾波器132、空間光調制元件133、檢測部134、透鏡141、帶通濾波器142、空間光調制元件143及檢測部144。
分別從激光源111、121到被測試樣1的光學系統構成，用于將從激光源111、121輸出的激發光照射在被測試樣1上的激發光照射光學系統。從被測試樣1分別到檢測部134及檢測部144的光學系統構成，向檢測部134、144導入在被測試樣1中產生的熒光的熒光檢測光學系統。另外，在本發明實施方式，優選具有用于對被測試樣1進行攝像的攝像光學系統及攝像單元，具體說明省略。
在本發明實施方式，作為輸出激發光的激發光源部，設有輸出互不相同的波長激發光的激光源111及激光源121。從激光源111輸出的第1激發光及從激光源121輸出的第2激發光，均具有能夠激發被測試樣1中含有的熒光物質的波長。
ND濾光器112，調整激光源111輸出的第1激發光的強度并進行輸出。光束擴展器113，輸入從ND濾光器112輸出的第1激發光，將其光束擴大到適當的大小的同時進行準直并輸出。空間光調制元件115，輸入從光束擴展器113輸出并被反射鏡114反射的第1激發光，對該第1激發光進行空間調制并輸出調制后的第1激發光。
ND濾光器122，調整激光源121輸出的第2激發光的強度并進行輸出。光束擴展器123，輸入從ND濾光器122輸出的第2激發光，將其光束擴大到適當的大小的同時進行準直并輸出。空間光調制元件125，輸入從光束擴展器123輸出并被反射鏡124反射的第2激發光，對該第1激發光進行空間調制并輸出調制后的第2激發光。
空間光調制元件115、125，其空間調制是可變的，通過將進行空間調制的激發光經由以后的光學系統而向被測試樣1照射，可以設定在被測試樣1中照射激發光的區域的個數、位置、形狀，另外，也可以消除激發光照射強度的不均一和像差的問題。
空間光調制元件115、125，可以是透射型，也可以是反射型。另外，空間光調制元件115、125，可以是振幅調制型，可以是相位調制型，也可以是對振幅和相位兩者進行調制而得。但是，從激發光的利用效率這一點來看，空間光調制元件115、125優選是相位調整型。例如，作為空間光調制元件115、125，也可以采用在平面上二維排列含有液晶的微小像素的元件。
分色鏡103，使從空間光調制元件115輸出的第1激發光透射，并且反射從空間光調制元件125輸出并被反射鏡107反射的第2激發光，并向同一光路上的分色鏡102輸出第1激發光和第2激發光。
分色鏡102，使從分色鏡103到達的第1激發光及第2激發光反射并向物鏡101入射，同時，使從物鏡101輸出的熒光透射。物鏡101，輸入通過分色鏡102反射的第1激發光及第2激發光，將這些激發光照射在被測試樣1中的指定區域(激發光照射區域)上。另外，物鏡101輸入在激發光照射區域產生的熒光，將該熒光輸出到分色鏡102。
分色鏡104，將在照射有第1激發光的被測試樣1中的激發光照射區域上產生的第1熒光，和在照射有第2激發光的被測試樣1中的激發光照射區域上產生的第2熒光相互分離開來。第1熒光和第2熒光的波長互不相同。也就是說，分色鏡104，輸入從物鏡101輸出并透過分色鏡102的光，選擇性地反射其中的第1熒光，并使第2熒光(及激發光的散射成分)透射。在反射鏡106上入射透過分色鏡104的光，反射其中的第2熒光，吸收激發光的散射成分。
在透鏡131上入射由分色鏡104反射的第1熒光，與物鏡101一起，在空間光調制元件133上形成在被測試樣1中的激發光照射區域中產生的第1熒光的像。帶通濾光器132設置在透鏡131和空間光調制元件133之間的光路上，在選擇性透射第1熒光的同時，屏蔽激發光的散射成分。空間光調制元件133，用作選擇輸出單元，對輸入到由物鏡101及透鏡131形成的第1熒光的成像面內的規定區域的熒光，進行選擇性輸出。檢測部134，檢測來自空間光調制元件133的第1熒光的強度。
在透鏡141上入射由反射鏡106反射的第2熒光，與物鏡101一起，在空間光調制元件143上形成在被測試樣1中的激發光照射區域中產生的第2熒光的像。帶通濾光器142設置在透鏡141和空間光調制元件143之間的光路上，在選擇性透射第2熒光的同時，屏蔽激發光的散射成分。空間光調制元件143，用作選擇輸出單元，對輸入到由物鏡101及透鏡141形成的第2熒光的成像面內的規定區域的熒光，進行選擇性輸出。檢測部144，檢測來自空間光調制元件143的第2熒光的強度。
也可以使用有開口的屏蔽器，來替換空間光調制元件133、143，使熒光像位于開口位置(規定區域)。但是，由于優選可使該規定區域的位置為可變，因而，空間光調制元件133、143，優選使熒光成像面中，需要選擇地輸出熒光的規定區域的個數、位置和形狀為可變。通過這樣，能夠實現等效的共焦光學系統。
空間光調制元件133、143，可以是透射型，也可以是反射型。另外，空間光調制元件133、143，可以是振幅調制型，可以是相位調制型，也可以是對振幅和相位兩者進行調制而得的。但是，由于檢測光學系統中的空間光調制元件133、143，與激發光照射光學系統中的空間光調制元件115、125相比，由于不要各種條件控制，所以從成本的觀點來看，優選使用強度調制型。
分析部22，存儲由檢測部134檢測的第1熒光的強度隨時間的變化I1(t)，同時，也存儲由檢測部144檢測的第2熒光的強度隨時間的變化I2(t)，并由上述I1(t)及I2(t)求出互相關函數G(τ)(下述(3)式)。然后，以此互相關函數G(τ)為基礎，能夠分析出被測試樣1中的激發光照射區域里的熒光物質的相互作用。
G(τ)=⟨I1(t)·I2(t+τ)⟩⟨I1(t)·I2(t)⟩---(3)]]>該熒光相關光譜分析裝置20按照以下進行動作。從一個激光源111輸出第1激發光(例如波長為488nm的激光)之后，該第1激發光由ND濾光器112調整其強度，由光束擴展器113調整其光束直徑，并由反射鏡114反射，入射到空間光調制元件115，由該空間光調制元件115進行空間調制。從另一個激光源121輸出第2激發光(例如波長為633nm的激光)之后，該第2激發光由ND濾光器122調整其強度，由光束擴展器123調整其光束直徑，并由反射鏡124反射，入射到空間光調制元件125，由該空間光調制元件125進行空間調制。
將由空間光調制元件115進行空間調制后的第1激發光及由空間光調制元件125進行空間調制后的第2激發光，利用分色鏡103調整到同一光路之后，被分色鏡102反射，通過物鏡101照射于透明平板2上的被測試樣1。在被測試樣1里摻入，能夠被第1激發光激發的由熒光色素(例如紫翠玉488)所標記的第1熒光物質和能夠被第2激發光激發的以熒光色素(例如紫翠玉633)所標記的第2熒光物質。
在被測試樣1內的激發光照射區域里，由第1激發光的照射產生的第1熒光(波長530nm)，通過物鏡101、分色鏡102、分色鏡104、透鏡131及帶通濾光器132，入射到空間光調制元件133。在入射到空間光調制元件133的第1熒光中的入射到規定區域的第1熒光，由檢測部134受光并檢測強度，并利用分析部22存儲檢測出的第1熒光的強度隨時間的變化I1(t)。這時，從被測試樣1內的激發光照射區域到空間光調制元件133的光學系統，構成了等效的共焦光學系統。
在被測試樣1內的激發光照射區域里，由第2激發光的照射產生的第2熒光(波長680nm)，通過物鏡101、分色鏡102、分色鏡104、反射鏡106、透鏡141及帶通濾光器142，入射到空間光調制元件143。在入射到空間光調制元件143的第2熒光中的入射到規定區域的第2熒光，由檢測部144受光并檢測強度，并利用分析部22存儲檢測出的第2熒光的強度隨時間的變化I2(t)。這時，從被測試樣1內的激發光照射區域到空間光調制元件143的光學系統，構成了等效的共焦光學系統。
然后，利用分析部，根據I1(t)及I2(t)求出互相關函數G(τ)。這樣求出的互相關函數G(τ)，利用理想分子運動模型的互相關函數進行擬合處理。由此，可以分析出在被測試樣1內的激發光照射區域中的第1熒光物質和第2熒光物質的相互作用。
如上所述，在本實施方式的熒光相關光譜分析裝置20中，同上述第1實施方式的熒光相關光譜分析裝置10一樣，與空間光調制元件115、125中的激發光的空間相位調制模式相對應，可以調整在被測試樣1中形成的激發光照射區域的個數、位置、激發光強度，或者，可以修正激發光照射光學系統的像差。
此外，在該熒光相關光譜分析裝置20中，向被測試樣1內的激發光照射區域照射波長互不相同的第1激發光及第2激發光，并利用第1激發光激發存在于激發光照射區域中的第1熒光物質并由該第1熒光物質產生第1熒光，同時，利用第2激發光激發存在于激發光照射區域的第2熒光物質并由該第2熒光物質產生第2熒光。然后，根據熒光互相關光譜法(FCCS)，利用各共焦光學系統分別檢測第1熒光強度I1(t)及第2熒光強度I2(t)，能夠分析出激發光照射區域中的第1熒光物質和第2熒光物質間的相互作用。
另外，在該熒光相關光譜分析裝置20中，一方面，照射第1激發光于被測試樣1的第1激發光照射區域并檢測第1熒光，另一方面，可以照射第2激發光于被測試樣1的與第1激發光照射區域不同的第2激發光照射區域而檢測第2熒光。然后，根據熒光相關光譜法，能夠測定在位置互不相同的第1激發光照射區域及第2激發光照射區域的各自上，個別熒光物質的運動。
上述本發明的熒光顯微鏡、熒光相關光譜分析裝置，適用于對規定試樣中的熒光物質的平移擴散運動進行測定的測量設備。
權利要求
1.一種熒光顯微鏡，向被測試樣照射激發光并檢測與之對應而產生的熒光，其特征在于，具有激發光源部，輸出激發光；激發光照射光學系統，具有對從所述激發光源部輸出的激發光進行空間調制的空間光調制元件，并將由該空間光調制元件進行空間調制后的激發光照射于所述被測試樣上；熒光檢測光學系統，接受在利用所述激發光照射光學系統照射激發光的區域上產生的熒光并進行成像，同時，具有對入射到該成像面內的規定區域上的熒光進行選擇地輸出的選擇輸出單元；檢測部，檢測所述選擇輸出單元輸出的熒光的強度。
2.如權利要求1所述的熒光顯微鏡，其特征在于，在所述激發光照射光學系統中含有的所述空間光調制元件是相位調制型空間光調制元件。
3.如權利要求1所述的熒光顯微鏡，其特征在于，在所述熒光檢測光學系統中含有的所述選擇輸出單元為空間光調制元件。
4.如權利要求3所述的熒光顯微鏡，其特征在于，用作所述選擇輸出單元的空間光調制元件為強度調制型空間光調制元件。
5.如權利要求1所述的熒光顯微鏡，其特征在于，還具有對所述被測試樣進行攝像的攝像單元。
6.如權利要求1所述的熒光顯微鏡，其特征在于所述激發光源部，分別輸出波長互不相同的第1激發光和第2激發光；作為所述激發光照射光學系統的所述空間光調制元件，對于第1激發光及第2激發光分別設置有專用的空間光調制元件，同時，所述激發光照射光學系統，以同一光路向所述被測試樣照射進行空間調制后的第1激發光及第2激發。所述熒光檢測光學系統，具有分離部，分離在所述被測試樣的照射有第1激發光的區域上產生的第1熒光，和在照射有第2激發光的區域上產生的第2熒光，同時，對于第1熒光及第2熒光的各個單獨地具有所述選擇輸出單元。所述檢測部，檢測從所述選擇輸出單元輸出的第1熒光及第2熒光各自的強度。
7.一種熒光相關光譜分析裝置，其特征在于，具有如權利要求1～5中任何一項所述的熒光顯微鏡；和分析部，求出由所述熒光顯微鏡的所述檢測部檢測的熒光強度的隨時間變化的自相關函數。
8.一種熒光相關光譜分析裝置，其特征在于，具有如權利要求6所述的熒光顯微鏡；和分析部，求出由所述熒光顯微鏡的所述檢測部檢測的第1熒光及第2熒光各自的強度的隨時間變化的互相關函數。
全文摘要
熒光顯微鏡(11)，具有物鏡(101)、分色鏡(102)、半透鏡(105)、反射鏡(106)、激光源(111)、ND濾光器(112)、光束擴展器(113)、反射鏡(114)、空間光調制元件(115)、透鏡(131)、帶通濾波器(132)、空間光調制元件(133)、檢測部(134)。空間光調制元件(115)，其空間光調制為可變的，并且通過經由以后的光學系統，向被測試樣(1)上照射進行空間調制后的激發光，可以對被測試樣(1)中的激發光照射區域的個數、位置、形狀進行設定。
文檔編號G01N21/64GK101019018SQ20058002986
公開日2007年8月15日 申請日期2005年9月2日 優先權日2004年9月6日
發明者長谷川寬, 伊崎泰則 申請人:浜松光子學株式會社