用于細胞信號途徑的細胞計數分析的全血制備的制作方法

專利名稱：：用于細胞信號途徑的細胞計數分析的全血制備的制作方法
技術領域：
：本發明主要涉及用于細胞計數的樣品制備領域，更具體地說，本發明涉及能夠用于采用流式細胞計數法和圖像細胞計數法進行信號轉導測量的生物樣品的制備方法。
背景技術：
：由于流式細胞計數法能夠區分異質細胞群體中的亞群，所以其已成為臨床和基礎免疫學研究中不可缺少的工具。最近，在流式細胞計數法儀器和應用方面獲得了重大進展，使得能同時分析的參數的數目增加到十三個以上。隨著可使用參數的增多，研究者已開始基于表面表位染色來鑒別淋巴細胞樣品的更多非常明確的和生物學上感興趣的亞群。流式細胞計數法常規用于基于表面表型鑒別細胞群體以及也用于諸如細胞毒性、生存力和凋亡等的基于細胞的化驗。得到普遍理解的是，流式細胞計數法提供了評估存在于諸如外周血等復雜群體中的細胞亞群的異質性的能力。雖然表面染色可以是表征細胞的有效辦法，但它不能提供關于那些細胞對立即反映細胞內事件的刺激的功能性響應的信息。甚至在使用的標記是細胞因子受體或者受體酪氨酸激酶的情況下，抗原的水平也不總是與對特定配體的細胞響應相關。因此，已建立通過測量細胞內表位細胞因子、DNA、mRNA、酶、激素受體、細胞周期蛋白的水平以及磷酸化信號分子的水平來表征細胞的方法。結果，流式細胞計數法的研究應用正逐漸地應用于測量調節細胞過程和代表用于新型抗癌劑的重要治療靶的細胞內蛋白質。目前的蛋白質組學方法，例如蛋白翻譯后修飾的雙向SDS-PAGE和質譜是非常強大的并已對許多細胞內激活過程提供了有價值的見解。然而，由于細胞被溶解了，所以這些實驗的讀出數據顯然是細胞群體間的蛋白激活狀態的平均值。通過這樣的平均化可掩蓋重要的生物事件，因為既不能收集群體里個別細胞中蛋白激活分布的信息，也不具有追溯性地分辨與活性蛋白的可檢測水平相對應的細胞群體的能力。因此，關于存在于所限定的細胞群體中和橫跨不同細胞子類型的免疫細胞群體變化的重要信息是不可檢測的，而且也不能為需要細胞溶解用于蛋白分析的方法所克服。最后，蛋白激活信號級聯必須在其生物背景既與人造物相關又不含有人造物時測量。最近開發的基于使用磷酸化態特異性抗體來分析信號轉導途徑的技術引起特別關注。多參數流式細胞計數分析使得能夠使用細胞表面標記辨別小型子群體——代表不同細胞亞群、分化態或激活態。同樣，表征信號事件的單細胞技術的使用提供了在單細胞水平上進行多參數實驗，以在所限定的淋巴細胞群體里鑒定特定分子的獨特信號結合點，以及通過關聯多種同時與信號級聯相關的活性激酶而獲得對信號網絡范圍的全面理解的能力。此外，將這些方法引入傳統臨床流式細胞計數法方案中將對于包括選擇患者進行高度特異性分子癌癥治療在內的血液學惡性腫瘤分類以及對于監測藥物對病人的效果具有廣泛應用。通過流式細胞計數法分析信號轉導途徑顯示出在目前常規臨床應用中不會遇到的技術問題。個別信號元件的磷酸化狀態在響應特定激酶和磷酸酶時會快速發生改變，并因此在樣品保存和制備過程中發生人為改變。對激活或抑制輸入的細胞響往往比磷酸化態的穩態測量具有更多信息。許多抗癌劑表現出對其分子靶的可逆結合。結果，藥效監測只好測量全血樣品而不是分離的白細胞。最后，磷酸基(phospho)特異性流式細胞計數法在臨床環境中的已有的或潛在的應用，包括表征免疫系統發育和信號轉導、抗原特異性T-細胞應答、藥物篩選以及疾病表型分析，必須考慮到磷酸化是指示信號蛋白活化態的暫時的可逆的事件。因此，需要開發能夠用于采用流式細胞計數法進行信號轉導測量的生物樣品的制備方法，該信號轉導測量是有力的并適用于普通臨床應用且能俘獲代表信號蛋白激活態的磷酸化事件。本發明滿足了該要求并且還具有相關的優點。
發明內容本發明涉及一種用于測量蛋白表位的生物樣品的制備方法，該方法使得可以保持細胞內蛋白表位和基于俘獲表位的瞬時激活態的能力檢測信號轉導途徑。本發明提供的方法使得可以快速固定含有紅細胞的生物樣品，以保證信號轉導分子的表位和其他細胞內蛋白表位保持在活化態。本發明的方法進一步使得可以溶解紅細胞，因此使其成為一種用于對生物樣品進行細胞計數分析的有用方法，所述生物樣品包括例如全血、骨髓抽吸物、腹膜液、以及其他含紅細胞樣品。本發明還提供了一種復原或“暴露”細胞內抗原上由于固定樣品所需的交聯固定劑而導致隱蔽的表位。重要的是，本發明的方法使得可以保持和分析直接取自患者的生物樣品中磷酸基表位水平以確定疾病特異性特征。圖1提供用于計算WBC群體的費歇爾距離(FisherDistance)的技術的圖例，所述技術采用光散射測量通過流式細胞計數法測量的全血樣品。圖2顯示在活化全血后不采用固定(上圖)或立即采用固定(下圖)的低滲溶解的影響。在改進方法A(下圖)中樣品在RBC低滲溶解后立即固定。兩種方法均顯示出相似的磷酸基-ERK信噪比(S/N)。立即固定法一般提供更好的光散射群體分離度，但較低的CD3陽性T細胞百分比。圖3顯示不同去污劑對全血光散射測量的影響。所示使用TritonX-100處理的全血樣品數據代表了其他兩種去污劑。圖4顯示使用方法A(低滲溶解技術)(上圖)制備的全血樣品結果與使用2％甲醛固定后用0.1％TritonX-100(下圖)制備的全血樣品結果的比較。此處所示的典型結果說明采用方法A，通過光散射得到的WBC群體分離度差，CD3染色強度較低但P-ERK信噪比較好。兩種方法的相似抗微管蛋白染色強度表明細胞內區室對于兩種方法來說具有相似的易接近性。圖5顯示不同變性劑(行)和不同去污劑(TX-100，右圖；Brij-58，中圖；NP-40，左圖)對光散射測量、CD3表達和P-ERK染色強度的效果。圖6顯示不同甲醛固定劑濃度和溫育溫度對光散射測量、CD3表達和P-ERK染色強度的影響。圖7顯示不同TritonX-100濃度(圖從上至下，0.1％～1.0％)對光散射測量、CD3表達和P-ERK染色強度的影響。圖8顯示用于“暴露”的不同醇濃度(甲醇或乙醇)對光散射測量和對CD3表達的效果。在CD3染色前，成對樣品在每種醇濃度下溫育15分鐘，或在4℃保存過夜。圖9顯示不同細胞制備方法的效果比較，顯示全血溶解(頂行)、方法B(中行)、或方法B′(底行)對光散射測量、CD3表達和P-ERK水平的影響。圖10顯示不同WBC群體(淋巴細胞、單核細胞和粒細胞)的總偏差圖，所述總偏差圖由流式細胞計數光散射測量由三種不同技術(Q-PrepTM、方法B或方法B′)制備的全血樣品而確定。三種不同技術的值與使用LH-750TM分類細胞計數器對每個樣品得到的分類計數進行比較。圖11顯示根據不同WBC群體(淋巴細胞、單核細胞和粒細胞)的MFI(平均熒光強度)測量的總偏差估計值，所述不同WBC群體涉及三種不同技術(Q-PrepTM、方法B(“減化”)或方法B′(“完全”))制備的全血樣品。相對于針對所使用的6種不同CD標記中的每一種進行WBC群體計數的兩種方法間的平均值繪制近似容許限度圖。具體實施例方式本發明涉及一種用于測量蛋白表位的生物樣品的制備方法，該方法使得可以保持細胞內蛋白表位和基于俘獲表位的瞬時激活態的能力檢測信號轉導途徑。本發明提供的方法使得可以快速固定含有紅細胞的生物樣品，以保證信號轉導分子的表位和其他細胞內蛋白表位保持在活化態。本發明的方法進一步使得可以溶解紅細胞，因此使其成為一種用于對生物樣品進行細胞計數分析的有用方法，所述生物樣品包括例如全血、骨髓抽吸物、腹膜液、以及其他含紅細胞樣品。本發明還提供了一種復原或“暴露”細胞內抗原上由于固定樣品所需的交聯固定劑而導致隱蔽的表位。重要的是，本發明的方法使得可以保持和分析直接取自患者的生物樣品中磷酸基-表位水平以確定疾病特異性特征。本發明提供的方法部分地基于如下發現，即采用全血樣品通過細胞計數分析研究信號轉導途徑可通過初始固定步驟完成，該固定步驟實現了保持細胞表位的激活態而不使得紅細胞對隨后的溶解不敏感。該發現克服了在傳統方法中遇到的問題，傳統方法在固定前通過密度梯度分離或溶解從樣品中移除紅細胞，由于處理時間延遲了固定，可導致信號轉導表位的去磷酸化。相反，通過提供快速固定含紅細胞生物樣品的方法使得可去除延遲固定的費時的分離或溶解步驟，本發明的方法使得使用者可俘獲和測量處于其活化態的蛋白表位。在具體實施方式中，本發明提供了一種用于全血固定、透化和紅細胞溶解的方法，該方法快速地固定細胞(作為初始步驟)，保持光散射測量，維持用于鑒別特定血液細胞群體的關鍵細胞表面表位，以及提供最佳的磷酸基-表位測量。本發明的方法目的在于制備用于細胞計數法測量細胞表位的生物樣品。細胞計數法的優點是能根據細胞表面染色性質區分細胞類型，所述細胞表面染色性質例如T細胞的CD3、B細胞的CD19。在本發明的方法使得可以保持用于檢測的細胞內表位的同時，通過本發明方法也能實現維持區分細胞類型所必需的表面表位識別的重要目的。因此，本文所述的方法使得使用者可以保持用于細胞計數檢測的表面和細胞內表位的物理完整性。本發明提供的方法進一步部分基于如下發現，即特定的靶表位(例如包括p-ERK、p-STAT1和p-STAT5在內的磷酸基特異性表位)的檢測可通過醇步驟得以優化。在一個實施方式中，本發明提供了一種制備用于蛋白表位測量的含紅細胞生物樣品的方法，該方法為隨后的檢測保留了細胞內蛋白表位。所述方法包括固定步驟，該固定步驟包括使所述樣品與固定劑接觸，該固定劑用量所達到的終濃度足以交聯蛋白質、脂質和核酸分子；去污劑步驟，該去污劑步驟包括向生物樣品中加入去污劑，該去污劑用量所達到的終濃度足以溶解紅細胞并透化白細胞；以及標記步驟，其中所述樣品與對一個以上表位具有特異性的可檢測結合劑接觸。在一個實施方式中，本發明提供了一種制備用于蛋白表位測量的含紅細胞生物樣品的方法，該方法為隨后的檢測保留了細胞內蛋白表位。所述方法包括固定步驟，該固定步驟包括使樣品與固定劑接觸，所述固定劑用量所達到的終濃度足以交聯蛋白質、脂質和核酸分子。固定劑濃度可為大約0.1％～大約20％，大約0.5％～大約15％，大約1％～大約10％，大約1％～大約8％，大約1％～大約4％，大約1％～大約2％。所述固定劑可以濃縮液形式或者稀釋形式加入以得到所需濃度。所述固定劑可以是使用者希望的任何適當試劑，例如甲醛或低聚甲醛，或福爾馬林。用于制備用于蛋白表位測量的含紅細胞生物樣品并為隨后的檢測保留了細胞內蛋白表位的本發明方法還包括去污劑步驟，其中去污劑加入用量所達到的終濃度足以溶解紅細胞并透化白細胞。所述去污劑濃度可由使用者根據不同條件選擇并在以下范圍內大約0.1％～大約8％，大約0.1％～大約7％，大約0.1％～大約6％，大約0.1％～大約5％，大約0.1％～大約4％，大約0.1％～大約3％，大約0.1％～大約2％，大約0.1％～大約1％。去污劑可根據多種因素進行選擇，并可以是離子型或非離子型去污劑。去污劑優選為選自非離子型去污劑。目前一種優選去污劑是乙氧化辛基苯酚，其商業名為TritonX-100(SigmaT9284)。在優選實施方式中，所述方法采用TritonX-100進行。用于本發明方法的適當去污劑可透化細胞并保持表面表位的完整性。在本發明中有用的離子型去污劑還包括辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(以IgepalCA-630(SigmaN-6507)或NonidetP-40(NP-40)(Sigma)市售)、Brij-58和直鏈醇烷氧化物(以PlurafacA-38(BASF公司)或PlurafacA-39(BASF公司)市售)。在復雜的細胞群體中，例如在未稀釋的外周血、骨髓抽吸物和腹膜液中，在同一過程中通過表面標記區分細胞亞群并檢測細胞內磷酸基-表位染色是有用的。本發明提供的用于制備用于蛋白表位測量的含紅細胞生物樣品并為隨后的檢測保留了細胞內蛋白表位的方法適用于將細胞內表位檢測和細胞表面表位檢測相聯合。在本發明提供的方法中，細胞內表位和細胞外表位均可保持完整，使之能通過細胞計數分析進行隨后測量。例如，典型T細胞標記(包括例如CD4、CD3、CD62L和CD8)的表面檢測能與細胞內表位檢測相聯合。在另一個實施方式中，本發明的方法包括進一步的醇步驟，該醇步驟包括將生物樣品與醇接觸，該醇的用量所達到的終濃度足以暴露在固定步驟中因為交聯而失去的細胞表位。如這里所述，醇步驟可保留大部分的細胞外表位并可由使用者根據需要保留的表位調節溫育長短、溫度和濃度。本領域應當理解對于涉及多參數細胞計數分析的臨床應用，期望能為檢測而暴露和保留與特定生物標記有關的細胞外表位的亞群，所述特定生物標記可包括例如CD3、CD35、HLADR、CD4、HLADP、HLDDQ、CD5、CD10、CD1Ia、CD29、CD32、CD36、CD38、CD40、CD45、CD49、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD71、CD83、CD85i(ILT2)、CD85j(ILT3)、CD85f(ILT-4)、CD86、CD87、CD99、CD103、CD116、CD126、CD135、CD206、CD208(DC-LAMP)、b2-微球蛋白、cBc12、CCR5、CXCR4、HLAABC、L25、MPO、CD3、CD79，以及表面CD2、CD4、CD8、CD1Ib、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、D23、CD24、CD25、CD28、CD33、CD34、CD35、CD41、CD42b、CD61、CD62L、CD64、CD65、CD66b、CD69、CD72、CD94、CD106、CD122、CD138、CD154、CD158a、CD161、NKbI以及可以根據使用者的目選擇的在本領域已知的其他表位。本領域技術人員能根據其他多種變量選擇最終醇濃度，所述變量包括例如，溫育時間、溫度和旨在暴露和測量的特定表位。最終醇濃度可以為大約25％～大約75％，大約30％～大約70％，大約35％～大約65％，大約40％～大約60％，大約45％～大約55％。所述醇還可選自由乙醇和甲醇構成的組。如果需要，丙酮在醇步驟中可替代醇。樣品可與醇或丙酮在以下溫度接觸，所述溫度例如大約-30℃，大約-20℃，大約-10℃，大約-5℃，大約0℃，大約4℃，大約6℃，大約8℃，或者有利于暴露細胞內表位而不降低細胞表面表位的反應性的任何其他溫度。如果需要，通過本發明方法制備的生物樣品可以在醇步驟后保存在低于凝固點的溫度，例如保存在大約-40℃，在大約-30℃，在大約-20℃，在大約-10℃，在大約-5℃，并能保持光散射特征和細胞外表位的完整性，而不降低其易接近性或不改變細胞內表位的激活態長達2個月的時間。應當理解，信號損失的百分比涉及多種因素，包括例如所剩水分的百分比和靶表位。在一個優選實施方式中，所述樣品可以保存在大約-20℃達2天以上、3天以上、5天以上、10天以上、12天以上、14天以上、16天以上、20天以上、30天以上、40天以上、50天以上、60天以上。磷酸基-表位在醇中的穩定性根據本領域所理解的多種因素變化，所述因素例如所剩水分在樣品中的百分比和靶表位。因此，本發明方法提供了磷酸基-表位在醇中的穩定性并使得生物樣品的長期保存期在分析前保持達幾天至2～3周或者更長時間。在本發明的各種實施方式中，制備含紅細胞的生物樣品以用于包括例如病毒粒子、免疫球蛋白、雌激素受體、細胞因子以及特定細胞內蛋白等表位的測量。應當理解靜態蛋白分子的染色可使得能在長期實驗里觀察細胞對刺激的響應。本發明的方法使得細胞外標記與細胞內信號事件相關聯，或者信號事件之間相互關聯，使不同時監測單個細胞里的事件就不可能觀察到的免疫細胞作用和信號轉導的復雜性得以理解。雖然本文就細胞內磷酸基-表位進行舉例證明，但是本發明的方法同樣可用于制備目的在于測量其他翻譯后修飾的生物樣品，所述翻譯后修飾包括例如泛素化、糖基化、甲基化、乙酰化、棕櫚酰化，或蛋白質-蛋白質相互作用。因此，本發明使得能檢測細胞內多種蛋白的非磷酸基表位，進一步擴展了所述方法的用途。使用者可根據所研究的特定細胞事件選擇經標記的結合劑。本發明提供的方法能對具體時間段里的途徑和途徑特異性方式進行檢測，這是以前不能獲得的。雖然多種細胞內表位可被選擇用于流式細胞計數法分析，但是應當理解使用者可優化并修改本文提供的方法以適用于被研究的特定表位，其中考慮的因素包括例如定位、構象/結構、抗體易接近性以及表位的穩定性。本文提供的方法一般可用于多色、多參數細胞計數分析。磷酸化是指示信號蛋白激活態的瞬時、可逆事件。因此，通過使用流式細胞計數法測定蛋白質的磷酸化態，可以確定響應諸如細胞因子或生長因子等特定刺激所使用的何種信號級聯、信號轉導的動力學和被轉錄的下游目標。此外，對比病態細胞和健康樣品可容易地鑒別出異常信號事件，該事件是對癌癥和免疫疾病進行表型分類的有用特征。因此，在診斷環境中，本發明的方法可用于制備生物樣品以用于根據例如磷酸基-蛋白狀態等病理學人體樣品的診斷性流式細胞計數法分析。在另外的應用中，本發明的方法可用于制備用于從分子庫篩選原代細胞群體的生物樣品以發現激酶信號級聯的新型抑制劑和激活劑。用于制備用于蛋白表位測量的含紅細胞的生物樣品并為隨后的檢測保留了細胞內蛋白表位的本發明方法還在涉及免疫系統表征的應用中有用，所述免疫系統表征包括例如免疫細胞發育(通過監測發育中T細胞、B細胞或其他譜系特定細胞的磷酸基-識別標記以將細胞內活動與細胞分化階段相關聯)；免疫疾病狀態概況(包括將四倍體染色與細胞內信號評估相聯合以研究病毒和/或細菌感染中抗原特異性T細胞，并可潛在用于監測淋巴細胞亞群在急性和慢性感染情況下的響應)；監測患病鼠類模型或患者體內的淋巴細胞群體，例如血液白血病或諸如類風濕關節炎等自身免疫疾病以將磷酸基-識別標記和疾病表現相關聯；不能通過傳統生化技術分析的罕見細胞群體的生化識別標志，所述細胞群體包括樹狀細胞、幼稚和記憶效應細胞、干細胞；細胞信號轉導網絡的多維評估以理解細胞功能；鑒別不同信號級聯間的信號轉導閾和聯系；監測病毒感染細胞的被改變的功能和細胞內信號轉導；以及表征免疫細胞對細胞因子和細胞外刺激的響應模型。用于制備用于蛋白表位測量的含紅細胞的生物樣品并為隨后的檢測保留細胞內蛋白表位的本發明方法還在涉及藥效學監測和藥物篩選的應用中有用，所述藥物篩選包括例如為快速鑒別靶激酶的特異性抑制劑/調節劑進行的細胞內激酶篩選；在原代細胞中進行藥物篩選以測定亞群特異性功效和副作用；通過同時分析多條細胞內途徑證實化合物專一性的靶點；監測特定化合物在藥物治療過程中對感興趣的細胞群體的效果而進行臨床試驗；通過將細胞內生化差異與其它臨床參數相關聯而鑒別激酶上的磷酸基-表位(作為疾病進程的診斷標志)；以及在接種程序中進行磷酸基-表位分析以監測細胞水平的功效。如上所述，本發明的方法具有制備用于藥效學概況分析的生物樣品的用途。例如，磷酸基-特異性流式細胞計數法可用于通過疾病信號狀態和對特定化合物的響應來對疾病狀態進行概況分析。磷酸基-表位識別標志與疾病進程間的關系可用于根據處于疾病早期或晚期的患者個體調整療法的研究。例如，多種酪氨酸激酶受體，包括FIt-3、PDGF-R、EGF-R和HER2，已經與白血病和乳腺癌的疾病嚴重性和預后相關聯，并且是藥物治療的靶點(Drevs等，CurrDrugTargets4113-21，2003；Fjallskog等，ClinCancerRes91469-73，2003)。在本領域中已知多種細胞內分子是分裂活躍的癌癥的指示，例如p53和周期蛋白(如Tashiro等，CancerRes63424-31，2003，和Kmet等，Cancer97389-404，2003所述)。盡管cDNA微陣和蛋白質矩陣提供關于分子豐度的信息，但是這些分析并沒有提供關于活化態的信息。以低濃度存在的蛋白如果具有組成型活性則能在疾病進程中起重要作用，這是只能由磷酸基特異性分析才能表征的特征。因此，本發明提供的用于制備含紅細胞的生物樣品并為隨后的檢測保留細胞內蛋白表位的方法賦予使用者將蛋白質水平和其在特定疾病狀態中的活性相關聯的能力。如本文所述，本發明提供的方法具有在各種臨床環境中的用途，包括例如，腫瘤塊的檢測、活組織檢查和得自組織的樣品的分析(基于制備用于細胞計數分析的含紅細胞的生物樣品的能力)。通過允許使用者對異常信號轉導進行概況分析，并隨后分析在臨床試驗前和臨床試驗過程中療法的功效和專一性，所述方法已擴展了在癌癥和免疫系統疾病的研究和治療中的用途。隨著為流式細胞計數法發展并驗證出更多的磷酸基-表位特異性抗體，可以篩選生物樣品以發現用于藥物開發以及對特定疾病致病原因的進一步研究的可能線索。根據其對含紅細胞的生物樣品，包括未稀釋的外周血的適用性，本發明的方法使得能保持和分析直接取自患者的生物樣品中的磷酸基-表位水平以確定疾病特異性特征。本發明提供的方法還具有在臨床環境中的用途，包括例如，監測患者個體例如在慢性骨髓性白血病(CML)中對分子導向療法的反應性；監測在全血或骨髓樣品中GleevecTM抑制STAT5的磷酸化的能力，這作為藥物體內活性的標志以預測藥效在臨床上明顯以前在CML患者中所常見的藥效喪失；在AML(急性骨髓性白血病)中通過監測下游途徑，包括STAT、MAPK和PKB/AKT來監測Flt-3的抑制劑；在多發性骨髓瘤(MM)中通過監測MARK、PI3K、STAT和Wnt途徑監測新開發出的分子導向抑制劑。本發明提供的方法還具有監測多藥物組合治療對特定類型腫瘤的用途。例如，已知對大多數CML患者使用GleevecTM單治療最終將失敗，大多數機構要求多形式治療。本文提供的方法可用于通過監測諸如MAPK、STAT、凋亡等下游信號轉導途徑來監測GleevecTM與諸如flavopiridol或阿糖胞苷等其他試劑組合后的體外效果，以協助選擇具有潛在體內療效的組合。本文提供的方法可用于研究AML和MM患者個體中信號轉導途徑。在該實施方式中，可使用特定途徑刺激物和/或抑制劑，例如，Flt-3配體、PMA和Steele因子+/-UO-126(MAPK抑制劑)、用于AML的雷帕霉素(mTOR抑制劑)處理血液或骨髓樣品，并隨后測量基線和在多途徑中與細胞表面標記結合的磷酸化的(激活的)關鍵蛋白的可誘導和適居(inhabitable)的水平。如本文所述，在優選實施方式中，本發明方法能用于制備用于進行蛋白表位的測量的含紅細胞的生物樣品以致能保留用于檢測的細胞內磷酸基-表位，包括例如ERK、p38、JNK，和信號轉導物和轉錄激活物3(STAT3)、STAT1、STAT5、STAT6、AKT/PKB、mTOR、S6激酶、組蛋白(例如組蛋白H3)、ATM、NFKappaB、GSK3等。因此，本發明提供的方法使得能保留與信號轉導途徑相關的細胞內磷酸基-表位。本發明提供的用以制備含紅細胞的生物樣品的方法部分通過快速細胞固定步驟有效地“凍住”蛋白的磷酸化狀態實現了保留用以檢測的細胞內磷酸基-表位。此外，可合為一步或者分別進行的溶解和透化步驟使可檢測結合劑能接近其同源表位，該表位必須在已透化處理的靶細胞中以適當的天然或變性的構象保留。在本領域中應當理解信號級聯通常由下游效應器的蛋白磷酸化所驅動，所述下游效應器的蛋白磷酸化激活了效應器使其執行功能。因此，磷酸基-特異性的經標記結合劑，例如抗體可用于識別這些活性蛋白并分辨信號事件的“開-關”狀態。采用磷酸化作為激活下游效應器的方式的級聯在本領域里是熟知的。多信號級聯可被同時測量，例如，通過使用不同熒光團標記以測定配體或抑制劑的特異性，并且所述多信號級聯可包括例如細胞分裂原激活蛋白(MAP)激酶級聯和詹納斯激酶-信號轉導物和轉錄激活物(Jak-Stat)途徑。MAP激酶、細胞外調節激酶(ERK)、c-JunN-端激酶(JNK)和p38是雙重磷酸化的(在Thr和Tyr殘基上)，隨后移位進入細胞核以磷酸化多種轉錄因子。STAT蛋白由生長因子和諸如IFN-g、IL-4和GM-CSF等細胞因子激活。在由Jaks磷酸化以后，STAT蛋白發生二聚化并進入細胞核中，在細胞核中，其直接與DNA結合以調節轉錄。因此，用于制備用于蛋白表位測量的含紅細胞的生物樣品并為隨后的檢測保留細胞內蛋白表位的本發明方法在涉及測量在細胞刺激或應激后快速發生的動態信號轉導事件的應用中有用。在細胞分裂原激活蛋白(MAP)激酶級聯中，信號開始于細胞表面并由MAP激酶激酶激酶(MEKK)傳遞給MAP激酶激酶(MEK)再傳遞給MAP激酶，最后傳遞給轉錄因子。該級聯的每一個成員都由其上游成員磷酸化。轉錄因子的磷酸化通常增加DNA結合親合力或者改變其構象而引起二聚化和DNA結合。在所述JAK-Stat級聯中，細胞因子受體的二聚導致JAKs的激活，其隨后使STAT在其二聚化區域磷酸化而導致二聚化的STAT進入細胞核并激活轉錄。磷酸化也能為其他蛋白提供停靠位點以結合和定位于特定細胞內位置，所述磷酸化例如受體酪氨酸激酶的酪氨酸基序的磷酸化。雖然通常導致“正”活性，但是磷酸化事件也可引起負結果，例如T細胞蛋白Lck，其中磷酸化抑制酶活性，并且其是通過導致Lck發出信號的磷酸酶發生的去磷酸化事件。為了單獨地測定磷酸化事件，可增加與磷酸化形式蛋白的特異性結合的經標記結合配偶體。這通常通過使用結合到載體蛋白上的經磷酸化的短肽免疫原完成。因此，可以在本發明提供的方法中采用對相同信號蛋白中不同磷酸基殘基具有特異性的可檢測結合劑，由此隨后的測量可以了解對于特定信號事件重要的殘基。可以通過比較靜息細胞和被刺激的細胞，在分析前采用磷酸酶處理樣品，使磷酸化肽與非磷酸化肽競爭并將磷酸基-蛋白水平歸一化至總蛋白含量來確定磷酸基-特異性。本發明提供的方法包括標記步驟，其中所述生物樣品與對一種或多種表位具有特異性的可檢測結合劑接觸。為隨后通過細胞計數法測定生物樣品中一種或多種表位的存在，結合劑可以是單克隆抗體，吸附和/或親和純化或采用其它方式富含對一種或多種靶表位具有特異性的抗體的多克隆抗血清，以及諸如酶法制備的單價(Fab)或二價(F(ab′2))抗原結合片段等抗體片段。此外，結合劑可以是抗體樣分子或模擬物。在標記步驟(本領域中也通常稱為染色步驟)中，樣品與飽和量的經標記結合劑(優選為熒光團結合抗體)接觸，所述經標記的結合劑將結合到表達表位的細胞上。通過適當波長的激光激發，熒光團發射出特征熒光信號，從而隨后鑒別出表達表位的細胞。優選的熒光團包括藻膽色素蛋白B-藻紅蛋白(B-PE)、R-藻紅蛋白(R-PE)和別藻藍蛋白(APC)，它們適用于或者要求高靈敏度或者要求同時多色檢測的應用。如果需要，可以使用含有雙標簽的串聯結合物(例如，藻紅蛋白標記的結合試劑與綠色熒光檢測試劑聯合)以利用儀器激光的譜線同時激發來檢測兩種不同的信號。如果需要，也可設計和合成基于活性的標記，其中包括例如作為磷酸酶特異性俘獲裝置的α-溴芐基磷酸酯以及將俘獲裝置與生物素標簽相連的連接物，所述生物素標簽用于可視化和純化，如Kumar等，Prod.Natl.Acad.ScL，USA1017943-48，(2004)中所述。磷酸基-特異性抗體也可與熒光團結合以形成初級標記的抗體，該抗體是適用于實施本發明提供的方法的可檢測結合劑。當選擇用于結合的熒光團標記時，熒光團標記的吸收光譜必須與細胞計數器中使用的激光線相匹配，并且其發射必須落在檢測濾波器組件的范圍里。此外，所述標記不能影響結合劑，例如，抗體結合特性或者穿過細胞結構的透過性。可以理解諸如PE或APC等大蛋白熒光團可以減緩抗體進入細胞并影響其結合特性。小分子標記，例如FITC、Alexa488和Alexa647等熒光團可提供最好的染色特性，從而提供對熒光團/蛋白比例的恰當控制。熒光團在流式細胞計數法中的使用和應用的廣泛討論可在Petit等，Biol.Cell781-13，1993；Mullins，MethodsMoIBiol34107-16(1994)；以及Shapiro，MethodsCellBiol63107-29，2001中找到。流式細胞計數法裝置以及操作流程是本領域熟知的，并在大量文獻中得到詳細的描述。參見例如，FlowCytometryandSorting，第二版，(1990)M.R.Melamed等編輯，Wiley-Liss；FlowCytometryandcellSorting，第二版，(2000)A.Radbruch，Springer-Verlag；和InLivingColor.ProtocolsinFlowCytometryandCellSorting(2000)Diamond和Demaggio編輯，Springer-Verlag。流式細胞計數方法同樣在美國專利5,968,738和5,804,387中得以描述；在此將所述公開內容以參考的方式引入。本發明因此提供了一種制備用于蛋白表位測量的含紅細胞的生物樣品的方法，該方法使得可以保留用于通過細胞計數法檢測的細胞內蛋白表位，所述細胞計數法例如流式細胞計數法或者激光掃描細胞計數法。細胞計數法是非常強大的用于分析磷酸基-特異性表位和其他非磷酸基-表位的多參數方法，并且具有超過通過諸如蛋白質印跡和ELISA等方法進行分析的多項優勢。為保持精確性和半定量結果，所述細胞計數檢測可以通過與諸如蛋白質印跡和ELISA等傳統方法進行比較來得以確認。細胞計數法使得能夠不經過任何預先細胞篩選或損耗而分析B細胞對比T細胞，病態/癌癥細胞對比健康細胞，在一個發育階段的細胞對比另一階段的細胞。通過能夠以保留用于檢測的細胞內表位的方式制備生物樣品，本發明的方法使得能進行細胞類型間的立即比較。應當理解根據選擇的可檢測試劑可以同時分析幾個信號級聯或者一個特定級聯中的多個成員。在意欲檢測多個表位的實施方式中，可以使用能進行多色分析，例如2、4、6、8或者更多個不同顏色的流式細胞計數法。因此，所述方法能夠根據疾病的信號狀態或者通過它們對刺激的響應對比正常健康細胞對刺激的響應來對這些疾病進行概況分類。在這方面，致瘤性病癥經常被表征為過度表達或者具有組成型活性的信號分子。本發明的方法進一步應用于制備生物樣品用以使用流式細胞計數法進行基于細胞的藥物篩選，其中可包括同時檢測多個信號級聯以確定藥物特異性。通過細胞計數法檢測使得使用者可以分析在復雜群體里的罕見細胞亞群。由于能夠分析異質群體中的罕見細胞亞群，流式細胞計數法可用于特別是存在許多細胞類型時的監測環境中的信號事件，該信號事件最好地刺激體內的信號事件。如本文所述，本發明的方法使得能制備含有紅細胞的生物樣品，其使信號事件固定在幾乎任何時間點以用于隨后的染色。應當理解本發明的方法可對諸如96孔板形式的大量樣品平行進行操作以快速測量細胞內信號轉導事件。在多個實施方式中，可以使用許多細胞因子對諸如未稀釋外周血、骨髓抽吸物或腹膜液等生物樣品進行刺激并在諸如T細胞、B細胞和NK細胞等幾種不同類型的細胞中測量諸如ERK、p38和JNK或者STAT轉錄因子等MAP激酶的磷酸化。因此，使用磷酸基-特異性流式細胞計數法，僅有淋巴細胞的一個特定亞群，例如B細胞或者T細胞能根據其對刺激的響應而被靶向，所述對刺激的響應不會由其他子群體所表現出來。分辨出細胞子群體并單獨檢測出樣品中存在的細胞類型的能力能夠使那些看上去非常小并且如果從整個群體背景下考慮則不能檢測到的變化變得清晰。本發明提供的方法可包括一步或多步溫育步驟，例如，在固定步驟和去污劑步驟之間以及在去污劑步驟和隨后的標記步驟之間。可以設想在生物樣品與固定劑接觸以后，接著進行大約在30秒鐘～大約1小時范圍的溫育步驟。可以考慮在樣品與去污劑接觸后，在標記步驟以前，進行持續時間為大約30秒～大約1小時的第二溫育步驟。在目前優選實施方式中，第二溫育步驟的時間約為10分鐘。本發明的方法可進一步包括一步或多步離心步驟。如本文所舉例的那樣，在標記步驟前可進行其目的在于去除去污劑的第一離心步驟。此外，可在醇步驟后進行另外的離心步驟以去除醇。應當理解可根據使用者需要在多個步驟中進行洗滌步驟和在適當的緩沖液(例如磷酸緩沖鹽水(PBS))中的重懸浮。如本文所述，本發明提供了包括在去除(溶解)紅細胞和透化靶白細胞前加入固定劑的方法。結果，本發明提供的方法使得經標記的結合劑，例如抗體、抗體片段或抗體樣分子可接近細胞內或細胞核內區室。此外，本發明提供了所述方法的以下實施方式，其包括本文所述的醇步驟，該醇步驟提供了使由于固定步驟而掩蔽的蛋白表位“暴露”的方式，已顯示所述固定步驟對于檢測諸如ERK1、2等關鍵信號轉導蛋白的磷酸化是必須的。當提供一個范圍內的值時，應當理解在該范圍的上限和下限間的每一個中間值，直到下限單位的十分之一(除非上下文明確指出)，以及其他在所述范圍內指明的或者位于中間的值都包含在本發明中。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包含在所述較小范圍里，并也包括在本發明內，在所指明范圍里可特別排除任何的極限值。當所指明的范圍包括一個或兩個極限值時，排除其中一個或兩個所包含的極限值的范圍也包括在本發明中。除非另外指明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬
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里的普通技術人員所通常理解的相同含義。除非上下文另外明確指明，否則本文使用的單數形式“一個”、“和”以及“所述”包括其所指物的復數。應當理解那些未實質上影響本發明各種實施方式實行的修改也包括在本文提供的本發明限定范圍內。因此，下述實施例用以描述而不是用以限制本發明。實施例1紅細胞的溶解、固定以及白細胞的透化本實施例描述和比較了通過低滲溶解，隨后的固定以及固定后的去污劑溶解來制備全血樣品。簡言之，將豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA，SigmaChemicalCorp.，St.Louis，MO)在100％無水乙醇中制備成40M工作溶液，并以400nM的終濃度用在全血中。在本實施例中使用的TritonX-100和其他去污劑以Surfact-PakTM去污劑樣品試劑盒的形式從PierceBiotechnology(Rockford，IL)購得。所述樣品試劑盒包含七種不同的非離子型去污劑(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、TritonX-114、NonidetP-40、Brij-35和Brij-58，均以10％水溶液形式提供)和三種粉末(非離子型辛基-B-葡萄糖苷，和辛基-B-硫吡喃葡萄糖苷，和兩性CHAPS)。粉末去污劑溶解在PBS(不含有Ca2+和Mg2+)中制得10％溶液。所有去污劑在即將使用前于PBS中溶解。對于對磷酸基-特異性表位進行的細胞內染色，使用冷洗滌緩沖液將已固定和透化的細胞(經過或未經過甲醇處理)洗滌一次并離心。向細胞沉淀中加入溶解在洗滌緩沖液中的抗體(單抗體或多抗體)以使最終體積為100μl并在40℃溫育15～30分鐘。采用磷酸基-ERK1/2的單克隆抗體(Thr202/Tyr204，克隆ElO)(CellSignalingTechnologies，Beverly，MA)，并根據制造商說明與AlexaFluorTM488(MolecularProbes，Eugene，OR)結合。結合的磷酸基-ERKl/2具有4.3～6.3的染料蛋白質比，并在此前抗體滴定試驗所確定的最佳抗體濃度(在100μl中，0.2μg結合的磷酸基-ERK1/2相對于每106個細胞)使用。從BeckmanCoulter，Inc.得到抗-微管蛋白(FITC結合物，克隆TBlA337.7)并以100μl中相對于每106個細胞為0.5μg的濃度使用。在抗體染色后，將樣品懸浮在2ml洗滌緩沖液中，并通過35微米尼龍網(SmallParts，在PA州某處)過濾，離心，然后在使用BeckmanCoulterEpicsEliteTM流式細胞儀分析前重懸浮于150μl～300μl洗滌緩沖液中。對于細胞表面加上細胞內染色，將在按照制造商(BeckmanCoulter，Inc.，Miami，FL)說明進行Q-PrepTM處理后或者在進行經過或未經過50％冷甲醇處理的方法B后采用選定的單克隆抗體對全血樣品(100μl)進行染色過程。單克隆抗CD抗體(在使用方法B或B′制備細胞樣品后加入)包括CD45(克隆J.33)、CD3(克隆UCHT-1)、CD19(克隆J4.119)、CD13(克隆SJZD1)、CD14(克隆RMD52)和CD33(克隆D3HL60.251)。所有抗CD抗體均從BeckmanCoulter，Inc.(Miami，FL)獲得并按照制造商推薦的抗體濃度用作PE結合物。在室溫溫育抗體30分鐘后，將試管離心(645×G，四分鐘)，重懸浮于1ml洗滌緩沖液，并立即使用FC-500TM，或者EpicsXLTM流式細胞儀(BeckmanCoulter，Inc.，Miami，FL)進行分析。對于測量磷酸基-特異性表位變化的試驗，使用EpicsEliteTM流式細胞儀(BeckmanCoulter，Inc.)進行流式細胞計數測量，該細胞儀配備有采用20mW488nm照明的空氣冷卻的氬激光。通過525±10nm帶通濾波器收集FITC或AlexaFluorTM488熒光，通過575±10nm帶通濾波器收集PE，并采用最小補償以消除在PE通道中的FITC或AlexaFluorTM488信號。獲得2000～10000的陽性事件(通常為CD3陽性)并保存在列表式文件中。使用EpicsEliteTM軟件進行數據分析，計算平均熒光強度(MFI)和陽性事件百分比。在采用FALS和側散射測量比較淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的相對分離度的試驗中，和在測量采用三種不同技術(Q-PrepTM、甲醛/Triton(不采用醇)[方法B]，或者采用醇的甲醛/Triton[方法B′])制備的全血樣品中選定的表面標記的相對熒光強度的試驗中，按照制造商提供的標準配置使用FC-500TM，或者EpicsXLTM流式細胞儀(BeckmanCoulter，Inc.)。采用488nm(唯一)提供照射，并且用于PE通道(575±10nm)的儀器設置保持在同一值，每次測量計數總共45,000個細胞。采用FALS鑒別器，設置其用以消除大部分血小板和小的碎片。在Q-PrepTM、方法B、或方法B加上50％甲醇處理(稱為方法B′)之后，光散射群體(淋巴細胞、單核細胞和粒細胞)的定量回收差異通過比較CBC分析結果與基于流式細胞計數法的光散射所測定的群體的結果而確定。使用CD45(FITC)相對于側散射的同時測量進行基于光散射的群體的驗證，正如Loken等，Cytometry11453-459，1990中所描述。如圖2所示，對比PMA刺激的和未刺激的全血，低滲溶解技術(方法A)通常給出20～25倍的磷酸基-ERK1/2信號增加。為將淋巴細胞作為測量的靶點，如Chow等，Cytometry4672-78，2001中所述，測量了CD3陽性外周血淋巴細胞上的磷酸基-特異性ERK水平。這樣做部分是由于低滲溶解技術后通過光散射所測量的白細胞群體的分離度低(圖2，左圖)。在磷酸基-ERK信號(PMA刺激的相對于未刺激的樣品的比率)中未能觀察到采用方法A(圖2，上圖)與采用在RBC溶解后立即進行福爾馬林固定的改進低滲溶解技術(圖2，下圖)相比較的顯著差異。這些結果表明對全血樣品進行固定方面的延遲對磷酸基-ERK的測量水平沒有顯著影響。根據與低滲RBC溶解技術相關的技術難點，進行在去污劑溶解后的固定。增加交聯固定劑濃度、溫育時間或者提高溫度是使得紅細胞更耐去污劑溶解的因素。為篩選不同的去污劑進行了一系列試驗以評價在交聯固定后它們溶解紅細胞的能力。對于這些試驗，在室溫(RT)使用35μl10％甲醛(終濃度2％)固定100μl全血10分鐘。隨后在室溫(不去除固定劑)，采用濃度為三種不同濃度之一(0.001％、0.01％、0.1％)的每種去污劑處理已固定的全血樣品，并進行目視監測以檢測長至2小時的時間段內的紅細胞溶解。采用前向角光散射(FALS)對比側散射(SS)分析去污劑處理的樣品以確定白細胞群體的相對完整性和分離。如圖3所示，采用0.1％TritonX-100(左圖)對所固定的全血進行處理顯示出淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的不同群體。相反，采用終濃度為0.001％的TritonX-100的處理未顯示出不同的WBC群體(右圖)。采用0.01％TritonX-100對所固定的樣品進行處理通過光散射顯示出相似的WBC群體分離不足(結果未示出)。對于表現出顯著的紅細胞溶解的三種去污劑(TritonX-100、NP-40和Brij58)可以觀察到相似結果，所有這三種去污劑根據去污劑終濃度表現出相似的RBC溶解和WBC群體分離的模式(其中僅特定去污劑終濃度表現出清晰的WBC群體分離，而相同去污劑的其他濃度未表現出明顯的分離)。對于表現出RBC溶解的三種去污劑(TritonX-100、NP-40和Brij58)，(在所測試的三種濃度中)0.1％去污劑終濃度通過光散射顯現出WBC群體的分離。對于這三種去污劑，在0.01％時RBC溶解不可見，在0.001％去污劑處理的樣品中僅可見部分溶解。與在使用低滲溶解法(方法A)制備的全血樣品中的20倍或更高水平相比，使用甲醛固定(2％濃度在室溫下處理10分鐘)和0.1％去污劑處理，在PMA刺激的全血中的磷酸基-ERK水平僅僅比未刺激的對照高2.5～3.5倍(見圖4)。如圖4所示，使用兩種不同方法(方法A與甲醛/Triton(方法B))制備并與抗-微管蛋白-FITC同時溫育的細胞顯示出相同百分比的陽性細胞(基本上100％為CD3陽性細胞)，以及相似的抗-微管蛋白染色的MFI(圖4，右圖)，表明對使用任一方法制備的細胞中的胞內抗原具有等同的接近性，并排除了甲醛/去污劑方法不能提供足以使抗體進入細胞內部的細胞透化作用的可能性。在磷酸基-ERK(而不是抗微管蛋白)染色中的主要差別表明磷酸基-ERK表位(而不是微管蛋白)在交聯固定(在低滲溶解(方法A)技術中通過醇處理提供的過程)需要暴露或變性。然而，如圖2和圖4所示，甲醛固定后的醇處理并不能保留光散射特性并使得可以分辨所有白細胞群體。甲醛/去污劑技術盡管保留了光散射但不能暴露磷酸基-ERK。結果，研究了使用高鹽、低pH和加熱作為變性條件是否可以潛在地暴露出磷酸基-ERK表達。使用高鹽、低pH或者溫度來暴露抗原在4％甲醛(室溫10分鐘)中固定全血樣品和在室溫使用0.1％去污劑(TritonX-100、NP-40或者Brij58)處理30分鐘后，通過在可見RBC溶解后直接將濃縮儲備溶液(5M儲備液)加入到去污劑溶液中制得在NaCl或尿素中的1M或2M樣品。對置于低pH的樣品，通過離心(在30分鐘溫育后)去除去污劑并將細胞重懸浮于pH調節為5的PBS中。將所有樣品在室溫置于高鹽或酸中30分鐘，離心并重懸浮于洗滌緩沖液中。對于置于升高的溫度作為變性因素的樣品，將已固定的全血樣品(在室溫條件下4％甲醛處理10分鐘)采用0.1％TritonX-100在室溫處理30分鐘，然后在70℃水浴中溫育10分鐘，離心并重懸浮于洗滌緩沖液中。對于所有條件，使用CD3-PE和磷酸基-ERK-Alexa488對樣品進行染色，洗滌并使用EpicsEliteTM進行分析。如圖5所示并總結在表1中的結果表明，通過低滲溶解技術制備的全血樣品(頂行，圖5)表現出對比刺激的樣品和未刺激的樣品，在CD3陽性淋巴細胞中磷酸基-ERK表達具有26～34倍的差異。對比僅用去污劑處理的樣品，使用1N或2NNaCl，或者1M或2M尿素處理的樣品表明很小而不顯著的磷酸基-ERK表達的增加，而置于pH5條件下表現出7倍的差異，進行70℃處理表現出6倍的差異(PMA刺激的相對于未刺激的)。使用任何去污劑處理并置于NaCl、尿素或低pH的全血樣品的散射圖(FALS對比SS)表現出白細胞群體的分離度很差(圖5，每種去污劑處理的第一行)。所顯示的結果代表對三份不同全血樣品進行的相同試驗。表1不同變性條件對p-ERK在CD3陽性淋巴細胞中的表達的影響aa所示結果獲自三個單獨的試驗b方法A低滲溶解加上固定c方法B4％甲醛/0.1％TX-100這些結果表明雖然所述變性條件提高了p-ERK在甲醛/去污劑處理的細胞中的表達，但表達水平遠比在使用低滲RBC溶解、固定和醇處理(方法A)處理的全血樣品中見到的表達水平要低。實施例II固定劑和去污劑濃度對白細胞光散射的影響該實施例表明固定劑和去污劑二者的濃度和溫育時間對白細胞的分離度和回收的影響。根據先前研究所建議的高濃度交聯固定劑有助于維持白細胞群體的光散射圖和分離度，研究了不同固定劑濃度的影響。全血樣品在室溫或37℃在濃度逐漸升高的甲醛(從1％至10％終濃度)中溫育10分鐘，隨后立即與1ml0.1％TX-100(在室溫)溫育。如圖6所示，甲醛濃度從2％～4％(對于室溫溫育)的逐漸升高顯著改進白細胞群體的分離度(左圖)。相似地，在37℃使用甲醛處理全血樣品導致使用光散射的WBC群體的分離改善，而對CD3表達沒有顯著影響(對于兩個處理溫度具有相似的MFF，圖6，中圖)。然而，較高甲醛濃度(超過4％)導致RBC的不完全溶解，并且不能分辨白細胞群體(數據未示出)。如圖6所示(右圖)，在37℃的處理也導致提高了磷酸基-ERK表達的S/N(從室溫的2.5提高到37℃處理的5.2)。為確定去污劑濃度對WBC回收、基于光散射的分離和p-ERK表達的影響，用4％甲醛(終濃度)在室溫或37℃固定全血等分試樣(100μl)10分鐘，然后將其與1mlTX-100溫育，所用去污劑濃度從0.1％至1.0％。對于這些實驗，通過離心去除去污劑并洗滌(使用洗滌緩沖液洗滌三次)，然后使用抗-CD3-PE對細胞進行染色。如圖7所示，去污劑濃度提高到超過0.1％導致WBC群體的分離度變差，伴隨碎片量的增加以及顯著喪失使用光散射從淋巴細胞分辨出單核細胞的能力(見圖7左圖)。此外，通過使用逐漸升高的去污劑濃度，CD3相比側散射直方圖(圖7中圖)顯示出CD3陽性事件百分比提高并伴隨側散射圖顯著高于在淋巴細胞中所發現的側散射圖。如圖7所示，室溫固定使得RBC在所有去污劑濃度下溶解，而在37℃固定的樣品顯示在所有去污劑濃度下細胞凝集且RBC溶解不完全。這些結果啟示伴隨去污劑濃度增加，或者CD3陽性淋巴細胞結合到單核細胞或粒細胞，或者溶解的CD3陽性淋巴細胞將膜片段結合到單核細胞和粒細胞(后者與圖7的中圖中所見的SS圖更一致)。結合有關固定劑滴定的數據，這些數據表明使用4％甲醛和0.1％TX-100處理可獲得最優的RBC溶解和WBC回收。然而，對使用上述討論的甲醛和TX-100的范圍所處理的細胞進行的p-ERK染色的研究未提供比未刺激的對照樣品高于7.4倍的p-ERK信號(對于PMA刺激的全血樣品)(與最初描述的低滲溶解處理的28倍相比較)。隨后研究了使用4％甲醛時全血樣品與固定劑的溫育時間的作用(10分鐘～30分鐘)。此外，研究了或者在存在固定劑(如前所述)，或者在去除固定劑后，樣品(在添加固定劑后)與去污劑溫育的作用。樣品在固定劑中溫育時間超過10分鐘則顯示出不完全的RBC溶解和細胞凝集(結果未示出)。與使用固定劑溫育10分鐘，洗滌，然后再采用去污劑處理的樣品(10分鐘～30分鐘)相比，存在固定劑時使用去污劑處理的樣品顯示出更完全的RBC溶解和更好的白細胞群體分離度(結果未示出)。此處，雖然全血樣品表現出良好的RBC溶解和良好的淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的分離度，但是對于磷酸基-ERK1/2的信噪比保持在5～8，表明仍存在對該細胞內表位的明顯屏蔽。實施例III醇暴露劑對p-ERK的影響和對CD3表達的影響該實施例表明了醇對淋巴細胞回收和對暴露表面表位的影響。為了“暴露”在使用交聯固定劑固定后變得非反應性的磷酸基-蛋白(和其他)表位，進行了一系列試驗以評估在去污劑處理后的醇處理的影響。在置于去污劑中30分鐘后，用冷(4℃)緩沖液(不含Ca2+或Mg2+的PBS)洗滌已固定的全血樣品并將其在4℃重懸浮于一系列不同濃度的甲醇或乙醇中。將每種樣品的一等分試樣在4℃保持過夜以研究在醇溶液中保存的影響。與以前相同，使用CD3-PE的抗體(以評估T-淋巴細胞的回收和染色)和磷酸基-ERK的抗體(以評估表位暴露)對樣品進行染色(在通過離心和在PBS中洗滌而去除醇以后)。如圖8中提供的結果所示，甲醇處理(從40％至60％終濃度)保留了WBC光散射概圖而同時保持了良好的CD3染色。乙醇處理導致更高百分比的碎片(圖8，左下圖)以及單核細胞的損失。因為很多實驗室通常將樣品保存在4℃的醇中不同時間段，所以作為研究的一部分，我們在分析前將兩份完全相同的樣品保存在醇溶液中過夜。結果如圖8所示(右圖)表明盡管在甲醇中保存過夜的溶液中碎片百分比有所增加，但是在甲醇處理的樣品中沒有光散射或者CD3表達的顯著劣化。相反，保存在乙醇中過夜的樣品(圖8，右下圖)表現出明顯的碎片、光散射的劣化和CD3染色的損失。實施例IV醇處理對白細胞群體的影響該實施例描述了醇處理對淋巴細胞群體的散射分離的影響以上實施例I～III描述了兩種用于全血樣品固定、溶解RBC，透化細胞的方法用以進行流式細胞計數法的細胞內抗原染色。在稱為固定/去污劑溶解技術的基本方法的一個實施方式中，可用4％甲醛在室溫固定全血樣品10分鐘，隨后在室溫不去除固定劑而加入1ml0.1％TritonX-100(方法B)。進一步可使用冷(4℃)50％甲醇(在蒸餾水或者緩沖液中)進行處理以暴露蛋白表位，且需要變性步驟(方法B′)。如圖9所示，通過方法B處理全血樣品導致WBC群體的良好的光散射分離，CD3在T-淋巴細胞上的高水平表達，但是與使用我們最初低滲溶解技術(方法A，圖9，那套上圖)處理的全血相比，p-ERK的表達水平較低(圖9第二套圖)。在去污劑處理后用50％甲醇處理的全血樣品(方法B′，圖9第三套圖)保留了WBC光散射特性，CD3表達和相對高水平的p-ERK(此處對于方法B′，S/N＝19.1；對于方法B，S/N＝8.1；以及對于方法A，S/N＝29)。為確定兩種技術(方法B和方法B′)對白細胞群體分離度的影響，進行了一系列試驗，比較了用Q-PrepTM系統(BeckmanCoulter，Inc.)，或者固定/去污劑溶解技術(方法B)，或固定/去污劑溶解后50％冷甲醇(方法B′)處理的全血樣品。使用三種不同技術對來自正常捐獻者個體的樣品進行處理，并通過流式細胞計數法測量(使用FALS對比SS)以確定淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的相對分離度，所述相對分離度通過如Riley在StatisticalanalysisandoptimalclassificationofbloodcellpopulationusingGaussiandistributions，博士論文FloridaInternationalUniversity；(2003)中所描述的測量光散射群體間費歇爾距離來進行。簡言之，為確定不同全血制備技術對主要白細胞群體(淋巴細胞、單核細胞和粒細胞)的回收和鑒別的相對效果，進行試驗來通過前向角光散射相對于90度角光散射參數(均為線性)比較這三種群體的分離，其中采用如Riley，同上，2003所述測量費歇爾距離。如圖1所描述，該技術測量每一個基于光散射的群體團沿著兩條主要軸(X和Y)的中心，并計算直角三角形的斜邊，其中C=A2+B2.]]>在其中SD＝標準偏差。通過將每個群體沿X和Y的SD相加并除以2計算每個群體。雖然該計算沒有提供真實群體SD，但的確提供了能很容易計算的有效且有用的近似值。為計算費歇爾距離，在單個FC-500TM流式細胞儀上分析由三種技術中的每一種制備的樣品，如前所述，計數總數為45,000個事件。對于通過使用Q-PrepTM或者不含醇的方法B制備的樣品，將相同的增益和高電壓設置用于FALS和側散射檢測器。對于使用醇處理(方法B′)制備的樣品，將更高的電壓用于兩個散射檢測器(兩個電壓均高3.3倍)以獲得三個群體的分離度。使用FALS和側散射獲得淋巴細胞、單核細胞和粒細胞細目以計算單獨樣品的百分比分布。單獨數值(百分比)乘以使用CBC(從LH-750TM獲得)從那個捐獻者獲得的WBC計數。為評估試驗精確性(可重現性)，計算了每一套重復試驗(用CD45、3、19、13、14和33染色的試管)的平均數、標準偏差和變異系數。比較了樣品制備方法的費歇爾距離、CBC參數，和表面標記的MFF。方差分析和Tukey-Kramer檢驗用于比較各方法的費歇爾距離。對于單獨CD使用MFI和對于CBC參數使用差異繪圖在差異和總偏差方面比較各方法，如同在Bland和Altman，Lancet1307-31(1986)中所述。對于每個血液樣品的兩種方法間的差異在統計上可以被模型化為D＝TB+E其中D是差異，TB是總偏差，而E是隨機誤差。因為E主要與不精確性有關，所以其標準偏差的值也是試驗分析的不精確性的估計值。估算TB的詳細細節可在Magari，JournalofBiopharmaceuticalStatistics，2004(出版中)中找到。95％置信度和99％覆蓋度的容許限度根據估算的標準誤差計算。SAS(SASInstituteInc.，Carry，NC)用于所有統計分析。對所有三種技術進行比較的24個正常捐獻者的測量結果總結在表2中。對于使用Q-PrepTM制備的樣品，淋巴細胞和單核細胞間的費歇爾距離最大(費歇爾距離＝2.19)，表明對于測試的三種技術來說，該技術能最好地將單核細胞和淋巴細胞分離(和將單核細胞與粒細胞分離)。所述分析說明比較使用Q-PrepTM和方法B制備的樣品的費歇爾距離，具有顯著差異。然而，比較方法B和方法B′的淋巴細胞和單核細胞間的費歇爾距離，沒有顯著差異。因為使用六種不同的CD標記對每個樣品進行染色，所以我們也分析了樣品內部以及技術間的樣品差異性。該分析說明與通過相同技術制備的樣品間的差異性相比，測定內差異性更大。在對單核細胞和粒細胞間的費歇爾距離進行比較(表2)時，所有三種技術給出具有顯著性差異的結果，其中Q-PrepTM給出最好分離，隨后是方法B。雖然我們的總體分析指出方法B和B′提供的WBC群體的分離不如Q-PrepTM提供的分離好，但使用方法B或B′制備的全血樣品的散射測量(FALS和SS)提供的分離度足以清晰地分離WBC群體，并基本上提供了比我們的最初低滲溶解技術(參見圖9，上圖)明顯更好的分離度。圖2費歇爾距離計算的數據分析總結淋巴細胞對比單核細胞單核細胞對比粒細胞使用LH-750TM(BeckmanCoulter，Inc.)分析儀測量通過所有三種技術制備的全血樣品的等分試樣以得到淋巴細胞、單核細胞和粒細胞計數(CBC)，其目的在于確定任何血液細胞群體是否由于樣品制備而降低(損失)(使用低固定濃度，加上去污劑和醇處理的先前實驗已指出單核細胞的顯著損失和優先損失)。使用偏差圖(圖10)進行分析以確定是否在回收不同WBC群體時有顯著差異。與CBC測定相比，所有三種全血制備技術的淋巴細胞群體(圖10，上圖)始終被過高估計，而當比較三種全血技術時淋巴細胞的測定值沒有明顯差異。三種流式細胞計數淋巴細胞測定和CBC之間的差異可以解釋為在淋巴細胞門中包括低散射(碎片、血小板)等事件的結果。對單核細胞(圖10，中圖)和粒細胞(圖10，下圖)回收進行的比較顯示對于任何用于單核細胞的全血技術來說，沒有顯著差異；與CBC相比，所有三種全血技術在回收粒細胞方面有小但不明顯的降低。實施例V全血固定技術對代表性CD標記表達的影響該實施例表明各種固定、RBC溶解和透化技術(加入或不加入50％冷甲醇)對具有代表性的一套細胞表面標記的影響。最后一組實驗研究了固定、RBC溶解和透化技術(加入或不加入50％冷甲醇)對細胞表面標記的影響，所述細胞表面標記對于淋巴細胞為CD3、CD19，對于單核細胞為CD13、CD14，對于粒細胞為CD13和CD33。如前所述，使用Q-PrepTM或者使用或不使用醇的固定/去污劑溶解法制備全血樣品。在洗滌后，將樣品與單抗體(所有均作為PE結合物)溫育，并通過流式細胞計數法進行分析以測定陽性細胞百分比和平均熒光強度(MFI)。24個捐獻者個體的CD標記測量的結果提供在表3和圖11中。如表3所示，盡管在三種不同全血制備技術的比較中，對于任何一種標記的MFI都有些差異，但是唯一的染色強度顯著降低見于使用50％甲醇(方法B′)處理的全血樣品中的CD19。如用于CD19表達的偏差圖所示(圖11，第三圖)，在使用方法B或B′制備的樣品中該標記的表達具有相當的差異性，提示該表位在血液捐獻者個體中對甲醛/Triton(和甲醇)處理具有不同敏感度。不管所使用的全血制備技術如何，在所有捐獻者中可以很容易檢測到CD19陽性細胞。盡管在不同方法的比較中，其他標記在染色強度(MFI)方面表現出一些升高或降低，但是對于這些六種代表性CD標記，在所有情況下均有足夠的染色強度使得可容易地區分出陽性細胞群體和陰性細胞群體。表3使用不同全血制備技術在不同WBC群體上CD標記表達的強度a由光散射測定的WBC群體(FALS對比SS)b與Q-PrepTM相比，CD表達水平的顯著降低貫穿本發明在插入語中參考了多篇文獻。將這些文獻的公開內容以參考方式整體引入本申請以更完整地描述本發明所屬領域的情況。雖然通過參考所公開的實施方式描述了本發明，本領域技術人員可以容易地理解，上述這些特定實施例和詳細研究僅用于示例性說明本發明。應當理解，可以做出各種修改而不背離本發明的精神。因此，本發明僅受如下權利要求的限制。權利要求1.一種用于測量蛋白表位的含有紅細胞的生物樣品的制備方法，該方法使得能保留用于檢測的細胞內蛋白表位，該方法包括如下步驟(a)固定步驟，該固定步驟包括將所述樣品與固定劑接觸，其中所述固定劑的加入量使得所達到的終濃度足以交聯蛋白質、脂質和核酸分子；(b)去污劑步驟，該去污劑步驟包括向所述樣品中加入去污劑，其中所述去污劑的加入量使得所達到的終濃度足以溶解所述紅細胞和透化白細胞；以及(c)標記步驟，其中所述樣品與對一個或多個表位具有特異性的可檢測結合劑接觸。2.如權利要求1所述的方法，該方法還包括醇步驟，該醇步驟包括將所述樣品與醇接觸，所述醇的量使得所達到的終濃度足以暴露所述細胞內表位而不降低細胞表面表位的反應性。3.如權利要求2所述的方法，其中所述醇濃度為大約25％～大約75％。4.如權利要求3所述的方法，其中所述醇濃度為大約40％～大約60％。5.如權利要求2所述的方法，其中所述醇選自由乙醇和甲醇組成的組。6.如權利要求5所述的方法，其中所述醇是甲醇。7.如權利要求1所述的方法，其中步驟(a)和(b)是在室溫進行的。8.如權利要求1所述的方法，其中步驟(a)和(b)是在37℃進行的。9.如權利要求2所述的方法，其中所述樣品可以保存在低于凝固點而不降低所述細胞內表位的可接近性的溫度。10.如權利要求9所述的方法，其中所述溫度是大約-20℃。11.如權利要求1所述的方法，該方法還包括T-淋巴細胞的豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)激活的初始步驟。12.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞內表位包括磷酸化的表位。13.如權利要求12所述的方法，其中所述細胞內蛋白與信號轉導途徑相關。14.如權利要求1所述的方法，其中所述檢測由細胞計數法完成。15.如權利要求14所述的方法，其中所述細胞計數法是流式細胞計數法。16.如權利要求14所述的方法，其中所述細胞計數法是激光掃描細胞計數法。17.如權利要求14所述的方法，其中所述細胞計數法是圖像細胞計數法。18.如權利要求1所述的方法，該方法還包括第一溫育步驟，該第一溫育步驟包括在步驟(a)之后和步驟(b)之前對所述樣品進行溫育。19.如權利要求18所述的方法，其中所述第一溫育步驟的持續時間為大約30秒～大約1小時。20.如權利要求1所述的方法，該方法還包括第二溫育步驟，該第二溫育步驟包括在步驟(b)之后和步驟(c)之前對所述樣品進行溫育。21.如權利要求1所述的方法，其中所述第二溫育步驟的持續時間為大約30秒～大約1小時。22.如權利要求21所述的方法，其中所述持續時間是大約10分鐘。23.如權利要求1所述的方法，其中所述固定劑濃度為大約0.1％～大約20％。24.如權利要求23所述的方法，其中所述固定劑濃度為大約2％～大約4％。25.如權利要求1所述的方法，其中所述固定劑是甲醛。26.如權利要求1所述的方法，其中所述去污劑濃度為大約0.1％～大約8％。27.如權利要求26所述的方法，其中所述去污劑濃度為大約0.1％～大約1％。28.如權利要求1所述的方法，其中所述去污劑是離子型去污劑。29.如權利要求28所述的方法，其中所述離子型去污劑選自由TritonX-100、NonidetP-40(NP-40)和Brij-58組成的組。30.如權利要求29所述的方法，其中所述去污劑是TritonX-100。31.如權利要求1所述的方法，該方法還包括第一離心步驟，該第一離心步驟包括在步驟(b)之后和步驟(c)之前對所述樣品進行離心。32.如權利要求1所述的方法，該方法還包括再次離心步驟，該再次離心步驟包括在步驟(e)之后對所述樣品進行離心。33.如權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品選自由血液、骨髓抽吸物和腹膜液組成的組。34.如權利要求33所述的方法，其中所述生物樣品包括未稀釋的外周血。全文摘要本發明涉及用于細胞信號途徑的細胞計數分析的全血制備，具體地說，本發明涉及用于測量蛋白表位的生物樣品的制備方法，該方法使得可以保持細胞內蛋白表位和基于俘獲表位的瞬時激活態的能力檢測信號轉導途徑。本發明提供的方法使得可以快速固定含有紅細胞的生物樣品，以保證信號轉導分子的表位和其他細胞內蛋白表位保持在活化態。本發明的方法進一步使得可溶解紅細胞，因此使其成為一種用于對生物樣品進行細胞計數分析的有用方法，所述生物樣品包括例如全血、骨髓抽吸物、腹膜液以及其他含紅細胞樣品。本發明還提供了一種復原或“暴露”細胞內抗原上由于固定樣品所需的交聯固定劑而導致隱蔽的表位。重要的是，本發明的方法使得可以保持和分析直接取自患者的生物樣品中磷酸基表位水平以確定疾病特異性特征。文檔編號G01N1/00GK101027557SQ200580028947公開日2007年8月29日申請日期2005年8月12日優先權日2004年8月27日發明者休·喬,戴維·赫德利,T·文森特·尚克伊,帕特里夏·格羅姆申請人:貝克曼庫爾特有限公司,健康網絡大學