專利名稱：通過熒光相關分光法迅速檢測和/或測定抗原的方法
技術領域：
本發明涉及一種迅速檢測和/或測定抗原的方法，該方法使用熒光相關分光法，迅速地檢測和/或測定像異常型prion這樣的病原性蛋白質或像食品材料中所含的有害蛋白質等抗原蛋白質等抗原。
背景技術：
近年來，在利用天然物質來源的食品材料和飼料材料時，這些材料中所含的有害蛋白質和病原性蛋白質等物質的存在已成為問題。作為有害蛋白質，可以例舉有例如，蕎麥，小麥，米等食品材料中所含的現已成為問題的過敏原蛋白質等，作為病原性蛋白質，可以例舉有例如食用肉，肉骨粉的原料中所含的已成為問題的異常型prion(感染型)這樣的病原性蛋白質等。如果通過例示來說明的話，可作為近年來已成為問題的病原性蛋白質的代表例來例舉的異常型prion是以牛海綿樣腦病(BSE)為代表的prion病的成因蛋白質。通常存在于動物的腦和神經細胞膜表面的正常型prion蛋白質是分子量為約3.3-3.5萬(33-35kDa)的糖蛋白質，其作為感染型prion蛋白質積蓄于腦內的細胞內(Lait，76571-578，1996)。異常型prion一旦侵入動物體內，在體內特定部位產生的正常型prion轉換為異常型prion，其結果是，異常型prion在這些部位積蓄。如果在腦中積蓄異常型prion，腦就形成海綿狀，動物就會死亡。
在利用這種食品材料和飼料材料時，為了防止人和動物攝取這些材料中所含的過敏原蛋白質等有害蛋白質和病原性蛋白質，需要檢測、測定該食品材料和飼料材料中所含的過敏原蛋白質等有害蛋白質和病原性蛋白質，防止含有這些有害蛋白質和病原性蛋白質的食品材料和飼料材料的利用。
以往，在Prion(異常型)等天然的生物體蛋白質的測定中，可以采用ELISA(固相酶免疫測定法)和Westernblot(immunoblot，免疫印跡法)等免疫測定法。ELISA是一種在固相上進行，用酶標識抗原或抗體，利用酶活性檢測抗體或抗原的存在的方法，例如，可以通過以如下方法進行通過Mab 3F4抗體結合固定在微量滴定板上的Prion，通過經由與其結合的酶催化著色反應的第二抗體檢測該抗體(美國專利第4806627號說明書)。此外，westernblot法是用電泳分離的蛋白質固定在疏水性膜上，用特異于抗原的抗體檢測目的蛋白質的方法。但是在Prion的檢測中可以通過例如如下方法進行用單克隆抗Prion蛋白質抗體Mab 13A5，進行westernblot檢測異常型Prion(J.Infect.Dis.154518-1986)。
但是，例如為了用ELISA和westernblot法等以往的方法進行Prion的檢測，測定，以往的方法中為了通過區分正常型Prion和異常型Prion來檢測，首先需要用蛋白酶K從被檢試樣中預先處理正常型Prion，預先進行分解，除去等處理。此外，westernblot法需要進行電泳，由于復雜需要花費時間，因此存在不適于短時間內檢查多種試樣這樣的問題。進而，ELISA，為了達到必要的敏感度，需要在Prion蛋白質的凝集狀態解除前進行用SDS的一次變性處理和用甲醇處理的蛋白質濃縮操作，在該甲醇處理前和胍硫氰酸處理前需要分別進行離心分離，因此該離心分離操作花費時間，由于該方法必須進行這種復雜的處理，因此存在不適于在短時間內檢查多種試樣這樣的問題。
因此，為了改善這些可以在Prion的檢測，測定中使用的ELISA和westernblot法的問題，最近已經提出了幾種方法。例如，在特開平10-267928號公報中公開了，應用ELISA，用抗Prion蛋白質抗體，用任意DNA片段標識該抗體，通過PCR檢測該DNA片段的免疫PCR法。此外，在特開2003-130880號公報中公開了以下方法作為不進行以往的ELISA和westernblot法的費時的電泳操作和離心分離操作而以高敏感度免疫測定異常型Prion的方法通過使用通過在磁性顆粒上固定與經變性劑處理的異常型Prion發生抗原抗體反應的第1抗體或其抗原結合性片段而成的試劑作為異常型Prion免疫測定試劑，可以不進行ELISA和westernblot法的電泳操作和離心分離操作而進行異常型Prion的測定，可以在短時間內檢查多種試樣的方法。
進而，特開2003-215131號公報中公開了如下方法在體液試樣中，使Prion蛋白質與化學物質反應使之形成共價結合，由此被化學修飾，如果存在病原性Prion蛋白質，質譜中可以觀察到至少一個峰的Prion蛋白質的用質譜分析的方法。這些都是對以往方法的ELISA和westernblot法改良的方法，但是這些方法依然必須經歷各種處理，未必足以能夠簡便且快速地檢測、測定Prion等抗原蛋白質。此外，這些檢測測定方法不能稱為是一種適于自動或半自動地進行用于進行該檢測測定的處理過程，進行大量試樣測定的方法。
另一方面，近年來，作為尤其是可以在生物來源分子的分析等中常用，且不經歷試樣的物理的分離過程并且可以大致實時檢測測定例如蛋白質分子的數量，大小或形狀等物理量的分析方法，已知的有熒光相關分光法(FCSFluorescence correlationspectroscopy)(Chem.Phys.4，390-401，1974；Biopolymers，13，1-27，1974-hysical Rev.A，101938-1945，1974；in Topics in Fluorescence Spectyoscopy，1，pp.337-378，Plenum Press，New York and London，1991；R.Rigler，E.S.Elson(Eds.)，Fluorescence CorrelationSpectyoscopy.Theory and Applications，Springer，Berlin，2001.)。FCS通過以下方式來實行用激光共焦點顯微鏡在微小區域捕捉被熒光標識的目的分子的介質中的布朗運動，來分析熒光強度根據波動的擴增時間，測定目的分子的物理量(分子的數量，大小)，因此通過這種在微小區域捕捉分子波動的FCS的分析在以高敏感度檢測特異性分子間相互作用方面現已成為一種有效的手段。
作為在生物體試樣中所含的蛋白質等的檢測測定中使用FCS時的特征，存在以下特征不經歷物理分離過程就可以大致實時地檢測溶液中所含經熒光標識的目的分子的濃度和分子間相互作用。因此，在使用FCS的檢測系統中，可以省去可作為以往生物體分子的檢測系統的主流而使用的ELISA等分析手段中所必需的復雜的Bound/Free分離過程，因此可以在短時間內以高敏感度測定多量試樣，從而趨于自動化測定。
可是，為了用FCS進行抗原蛋白質等的檢測，使用熒光標識化抗體分子，利用該熒光標識化抗體與抗原蛋白質間的抗原抗體反應，利用該熒光標識化抗體以及由該熒光標識化抗體與抗原蛋白質間的抗原抗體反應形成的抗原抗體復合體分子的依賴于其所具有的形狀及其分子量的擴散速度的差異，進行分析。這里，所稱的擴散速度(擴散常數或D)是指單位時間內分子自由擴散的面積。另一方面，所謂擴散時間(Diffusion Time(DT)或τD)是指分子通過由裝置決定的焦點區域內所需要的時間。
因此，為了通過FCS進行試樣中的抗原蛋白質等的正確測定，必需要使用使標識化抗體的擴散速度與由該熒光標識化抗體與抗原蛋白質間的抗原抗體反應形成的抗原抗體復合體的擴散速度產生顯著的差異的抗原和抗體的組合。因此，以往，由于這種需要，可以通過FCS檢測的抗原蛋白質等的種類非常有限。作為解決這種問題的方法，以往進行的是考慮抗原和抗體的形狀和分子量對抗原抗體復合體進行各種修飾，給擴散速度設置顯著的差異(特開2001-272404號公報，特許第3517241號公報)。但是，即使使用這些方法，適用FCS的檢測方法的檢測對象也有限度。
專利文獻1特開平10-267928號公報。
專利文獻2特開2001-272404號公報。
專利文獻3特開2003-130880號公報。
專利文獻4JP，2003-215131號公報。
專利文獻5特許第3517241號公報。
非專利文獻1 J.Infect.Dis.154518-521，1986.
非專利文獻2 Chem.Phys.and 4，390-401，1974.
非專利文獻3 Biopolymers，13，and 1-27，1974.
非專利文獻4 Physical Rev.A，101938-1945，1974.
非專利文獻5 in Topics in Fluorescence Spectyoscopy，1，pp.337-378，Plenum Press，NewYork and London，1991.
非專利文獻6 R.Rigler，E.S.Elson(Eds.)，Fluorescence Correlation Spectyoscopy.Theory andApplications，Springer，Berlin，2001.
發明內容
發明要解決的問題本發明的問題在于提供一種抗原的迅速檢測和/或測定的方法，該方法可以廣泛應用于異常型Prion等病原性蛋白質或食品材料中所含的有害蛋白質等抗原蛋白質等抗原的檢測和/或測定中，該方法可以以簡便的操作，迅速且正確地檢測和/或測定該抗原。
用于解決問題的方法本發明人為了解決上述問題進行的積極的研究中，近年來，著眼于已知作為尤其是生物來源的分子的分析等中常用的不經歷試樣的物理的分離過程并且可以大致實時檢測測定蛋白質分子的數量，大小或形狀等物理量的分析方法的熒光相關分光法(FCSFluorescence correlation spectroscopy)，用該FCS的蛋白質分子等的檢測測定中利用通過抗原抗體反應檢測的抗原分子的熒光標識化，而且，在通過該抗原抗體反應的熒光標識化時，通過使用熒光標識片段和通過抗原與該熒光標識抗體片段結合的非熒光標識化完全抗體，可以使在不與抗原結合的熒光標識抗體片段和由熒光標識抗體片段-抗原-非熒光標識化完全抗體間的抗原抗體反應形成的復合體之間在其擴散速度上形成顯著的差異，因此，發現不依賴于抗原的形狀和分子量，即使是分子量比較小的抗原蛋白質等抗原的情況下，用FCS也可以檢測測定抗原，可以測定大范圍的抗原，從而實現本發明。
也就是說，本發明由一種檢測和/或測定抗原的方法構成，該方法采用以抗原蛋白質等抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以該抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體，使抗原與熒光標識抗體片段以及非熒光標識化完全型抗體的形成抗原抗體復合體，通過熒光相關分光法檢測、分析形成的抗原抗體復合體。本發明的檢測和/或測定抗原的方法可以廣泛應用于異常型Prion等病原性蛋白質或食品材料中所含的有害蛋白質等抗原蛋白質等抗原的檢測和/或測定中，該方法可以以簡便的操作，迅速且正確地檢測和/或測定該抗原蛋白質。
如果對本發明的功能進行進一步說明，本發明由如下內容構成通過混合以抗原蛋白質等抗原(例如，異常型Prion等病原性蛋白質和過敏原蛋白質等有害蛋白質)的各個不同表位(抗原決定簇)為目標的熒光標識抗體片段和完全型抗體(或其混合物(本發明提供的抗原檢測試劑))和抗原，使之發生抗原抗體反應，FCS測定這種混合物。檢測和/或測定試樣中如果存在抗原蛋白質等抗原，這些熒光標識片段，非熒光標識化完全型抗體就會通過該抗原形成復合體(圖1)。
在用FCS的抗原的檢測和/或測定中，為了驗證使用非熒光標識化完全型抗體時抗原抗體復合體分子的布朗運動中對擴散速度的影響，不使用位于復合體中心的抗原，用完全型抗體和直接識別該抗原的標識化抗體片段進行FCS(圖2)。測定的結果是，只有標識化抗體片段的擴散速度與標識化抗體片段-抗體復合體的擴散速度之間獲得了顯著差異(圖3)。也就是說，如圖3所示，進行識別非熒光標識化完全型抗體(圖3，Ab)的Fc部分(圖2，表位C)的熒光標識抗體片段與非熒光標識化完全型抗體之間的抗原抗體反應，用FCS進行測定的結果是，只有標識化抗體片段(Ab(-))的擴散時間與由熒光標識抗體片段和非熒光標識化完全型抗體形成的復合體(Ab(+))的擴散時間理論上達到約600μs，900μs，與之相對，只有測定值達到約600μs，950μs的標識化抗體片段的擴散速度和標識化抗體片段-抗體復合體的擴散速度之間存在顯著差異。
這意味著，存在位于抗原抗體復合體的中心的抗原，形成熒光標識抗體片段-抗原-非熒光標識化完全型抗體的復合體時，這些熒光標識分子的擴散速度中必然產生顯著差異。因此，清楚了如果使用這種組合，不論抗原的分子量通過FCS測定都可以檢測抗原蛋白質等抗原。在本發明的方法中，用于制備使用的熒光標識抗體片段的抗體和非熒光標識化完全型抗體優選使用IgG類單克隆抗體。
并且，上圖2和3中所示的實驗例如下操作(使用的材料)Alexa Fluor647(Zenon One Mouse IgGl標識試劑盒)Fab647(Zenon One IgG1標識試劑)抗體(圖2中表示為Ab)(Zenon One封閉試劑(小鼠IgG))(FCS測定裝置)MF-20(分子間相互作用分析系統Olympus光學工業株式會社)(操作)將經N101(日本油脂)封閉處理的只有10nM的Fab647(小鼠IgG抗體)的溶液和與100nM完全型抗體混合的Fab647混合物提供給384孔板(Olympus)，用MF20(Olympus)測定。測定以激光功率100μW進行30秒×3次的測定。用MF20的處理軟件以擴散時間為首導入各參數。
也就是說，具體的是，本發明由以下內容構成(1)一種通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于使用以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體，使之形成抗原與熒光標識抗體片段以及非熒光標識化完全型抗體的抗原抗體復合體，通過熒光相關分光法檢測、分析形成的抗原抗體復合體；和(2)根據前述(1)記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述抗原是抗原蛋白質；和(3)根據前述(1)或(2)記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述通過熒光相關分光法檢測、分析形成的抗原抗體復合體是利用基于熒光標識化熒光標識抗體片段與形成的標識化抗原抗體復合體的擴散速度差異的識別對抗原進行檢測、分析；和(4)根據前述(1)-(3)中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述抗原的迅速檢測和/或測定是基于通過熒光相關分光法對形成的抗原抗體復合體進行的檢測、分析，對抗原的存在，抗原的濃度，抗原的大小或抗原的形狀的檢測和/或測定；和(5)根據前述(1)-(4)中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段是由以抗原作為免疫原制備的單克隆抗體而制備的，所述以抗原蛋白質的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體是以抗原作為免疫原制備的單克隆抗體。
此外，本發明還由以下內容構成(6)一種通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于在被檢試樣中添加以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體，使之進行抗原抗體反應，通過熒光相關分光法檢測、分析所形成的抗原與熒光標識抗體片段以及非熒光標識化完全型抗體的抗原抗體復合體；和(7)根據前述(6)記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述抗原是抗原蛋白質；和(8)根據前述(6)或(7)記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述通過熒光相關分光法的抗原的檢測和/或測定不經歷被檢試樣中所含的抗原的物理的分離過程而進行；和(9)根據前述(6)-(8)中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于自動或半自動地進行以下過程在被檢試樣中添加以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體的過程，通過該被檢試樣，熒光標識抗體片段和非熒光標識化完全型抗體進行抗原抗體反應的過程，和用熒光相關分光法檢測分析進行了該抗原抗體反應的被檢試樣的過程；和(10)根據前述(6)-(9)中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述被檢試樣是生物體蛋白質試樣，所述抗原是病原性蛋白質抗原。
進而，本發明還由以下內容構成(11)根據前述(10)中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述病原性蛋白質抗原是異常型Prion；和(12)根據前述(6)-(9)中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述被檢試樣是食品材料，所述抗原是食品材料中所含的有害蛋白質抗原；和(13)一種用于通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定的檢測試劑，其由以檢測和/或測定的抗原表位為目標的熒光標識化熒光標識抗體片段和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體構成；和(14)一種用于通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定的試劑盒，其裝備有前述(12)記載的檢測試劑。
圖1是表示本發明的用FCS對抗原進行迅速檢測和/或測定的方法的概略圖；圖2是表示為了證明本發明的用FCS對抗原進行迅速檢測和/或測定的方法的功能，表示就在只有熒光標識抗體片段時與有熒光標識抗體片段和完全型抗體的復合體時的擴散速度的差異進行的試驗的概略圖；圖3是表示為了證明本發明的用FCS對抗原進行迅速檢測和/或測定的方法的功能，表示就在只有熒光標識抗體片段時與有熒光標識抗體片段和完全型抗體的復合體時的擴散速度的差異進行的試驗的概略圖；圖4是表示本發明中使用的FCS測定裝置的概略的圖；圖5是表示在本發明的用FCS對抗原進行迅速檢測和/或測定的方法中使用的熒光標識抗體片段的制備的概況的圖；
圖6是表示在本發明的實施例中，使用熒光標識抗體片段和完全型抗體，就由該抗體與抗原蛋白質的復合體的形成所產生的擴散時間的差異進行試驗的結果的圖。
具體實施例方式
本發明的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法由以下內容構成使用以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體，使抗原與熒光標識抗體片段以及非熒光標識化完全型抗體的形成抗原抗體復合體，通過熒光相關分光法(FCS)檢測、分析所形成的抗原抗體復合體。
也就是說，為了實施本發明，通過以下方式來進行在被檢試樣中添加以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體，混合添加了該抗體的試樣使之進行抗原抗體反應，通過熒光相關分光法檢測、分析所形成的抗原與熒光標識抗體片段以及非熒光標識化完全型抗體的抗原抗體復合體，迅速檢測和/或測定試樣中的抗原的存在，大小，濃度等來進行。本發明的通過FCS的檢測和/或測定中的處理操作不經歷被檢試樣中所含抗原的物理的分離過程，只添加混合試樣和由熒光標識抗體片段和非熒光標識完全型抗體構成的檢測試劑的操作，然后就可以進行自動或半自動地進行抗原的檢測測定的過程。
(抗蛋白質抗體的制備)在本發明中，制備特異性結合于抗原的抗體以制備作為檢測試劑使用的熒光標識抗體片段和非熒光標識化完全型抗體。作為可以在本發明中使用的特異性結合抗原的抗體，可以例舉有多克隆抗體和單克隆抗體等，但是其中單克隆抗體在其特異性方面更為優選。為了制備針對這種抗原的抗體，首先純化，獲得檢測抗原。該抗原可以用公知的純化方法從來源分離純化，此外，如果抗原是抗原蛋白質，該抗原蛋白質的氨基酸序列是公知的，也可以通過基因工程學方法，用微生物或動物細胞等使之產生該抗原蛋白質，從而純化獲得。可能的情況是，通過肽的化學合成法制備該抗原蛋白質。肽的化學合成可以采用公知的合成方法。例如，可以例舉有疊氮法，酸氯仿法，酸酐法，混合酸酐法，DCC法，活性酯法，羰基咪唑法(carbo imidazole)，氧化還原法等。
為了制備針對該抗原的抗體，使用該抗原，用常用的方法使動物或植物致敏，進行制備。例如，在單克隆抗體的制備中，可以使用帶來連續細胞系的培養物產生的抗體的雜交瘤法(Nature 256，495-497，1975)，TORIOMA法，人B細胞雜交瘤法(Immunology Today 4，72，1983)和EBV-雜交瘤法(MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)等任意方法。
為了制備抗原蛋白質等抗原的單克隆抗體，對大鼠，小鼠，家兔等哺乳動物施以該抗原蛋白質作為抗原，使之致敏。根據需要，還可以使用等弗氏(freund′s)完全佐劑(FCA)，弗氏不完全佐劑(FIA)等佐劑。免疫主要通過注入于靜脈內，皮下，腹腔內中來進行。此外，免疫的間隔沒有特別的限定，在數日至數周間隔，進行1-10次免疫。然后，自最終的免疫日起1-60天后收集抗體產生細胞。作為抗體產生細胞，可以例舉有脾臟細胞，淋巴結細胞，外周血細胞等。為了獲得雜交瘤，進行抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合。作為與抗體產生細胞融合的骨髓瘤細胞，可以使用一般可以獲得的確立細胞系。作為使用的細胞株，可以使用具有藥物選擇性，具有在未融合狀態下在HAT選擇培養基(含有次黃嘌呤，氨喋呤，胸腺嘧啶脫氧核苷)中無法生存且只能在于抗體產生細胞融合的狀態下生存的性質的骨髓瘤細胞。
從細胞融合處理后的細胞中選擇雜交瘤。作為從建立的雜交瘤中收集單克隆抗體的方法，可以采用通常的細胞培養法或腹水形成法等。上述抗體的收集方法中需要純化抗體時，可以適當選擇硫酸銨鹽析法，陽離子交換層析，凝膠過濾，親合層析等公知的方法，或者通過它們的組合來純化。
在本發明中，作為本發明中使用的抗原蛋白質的抗體，除了如上所述的制備外，存在已經制備好的市售的抗體時可以使用該抗體。
(熒光標識抗體片段的制備)本發明的抗原的迅速檢測和/或測定法中，作為與抗原進行抗原抗體反應用于檢測的檢測試劑，可以使用由該抗原制備的熒光標識抗體片段。在本發明中，可以在熒光標識抗體片段的制備中使用的抗體，可以選擇相同的本發明中可使用的非熒光標識化完全型抗體和其結合的抗原的表位不同的抗體。在該熒光標識抗體片段的制備中，通過用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等酶將抗原的完全型抗體片段化，用2-巰基甲胺或2-巰基乙醇等將其還原形成單體后，標識化來制備。該標識化中，可以使用熒光色素，例如可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)，Alexa532等熒光色素。
(用FCS進行檢測測定)本發明的抗原的迅速檢測和/或測定法中，在被檢試樣中添加，混合熒光標識抗體片段和非熒光標識化完全型抗體作為檢測試劑，通過FCS(熒光相關分光法)對進行了抗原抗體反應的被檢試樣進行抗原的檢測和/或測定。FCS是一種利用溶液中的熒光分子的布朗運動，獲得分子的“大小”和“數量”等物理量的方法。
FCS的特征有不經歷被檢試樣中所含抗原的物理的分離過程，就可以大致實時檢測。因此，在采用FCS的檢測系統中可以省去作為主流的以往的生物體分子檢測系統中(例如ELISA等)所必需的復雜的Bound/Free分離過程。因此，可以在短時間內以高敏感度且自動測定多量試樣。FCS已知有多種種類，但是只要在本發明中不阻礙本發明的檢測、測定對象的檢測測定，也可以使用任意一種方法(蛋白質核酸酶，Vol.44，No.9，1431-1438，1999；Bioindustry，4月刊，p52-59，2003；特開2001-272404號公報；特許第3517241號公報)。
(FCS測定裝置)可以在使用FCS的檢測和測定中使用的裝置的基板結構示于圖4中。如果通過附圖來概述，(A)表示FCS(熒光相關分光法)裝置的模式圖。由激光發出的激發光通過分色鏡(DM)和接物鏡被導向蓋玻片上的試樣溶液中。熒光發光通過long pass filter或帶通濾波器(F)，在共焦點上的小孔處去除共焦點面以外的背景光，被導向雪崩光電二極管檢測器(APD)或光電擴增管(PMT)，進而用數字相關器分析其信號。(B)表示觀測區域的擴大模式圖。表示布朗運動的熒光分子通過用接物鏡擠壓到極限的共焦點區域的樣子。(C)表示熒光相關分光分析后的相關曲線。通過用公式分析觀測的熒光強度的波動，可以獲得分子的數量和大小等物理量。
在通過FCS的測定中，通過使用共焦點光學系統，檢測發自試樣溶液的極微小區域(直徑約400nm，軸長約2μm，體積～10-16)的熒光(圖4)。在本發明的實施例中使用Olympus公司制造的MF20作為FCS測定裝置。測定通過在波長543,633nm處進行3次30秒鐘的測定的方法實施。
(觀測的熒光強度的波動)在通過FCS的測定中，由于觀測區域是開放系統，熒光分子按照布朗運動出入區域內。于是，觀測區域中的分子的數量以某值為中心變動，發生數次波動。然后，觀察到由這種數次波動引起的熒光強度的波動(蛋白質核酸酶，Vol.44，No.9，1431-1438，1999)。
(波動的分析)通過用以下公式(1)-(4)分析所觀察的熒光強度的波動，可以獲得分子的“大小”和“數量”等物理量。
也就是說，用自相關函數從波動的信號引出信息。FCS中使用的自相關函數由公式(1)表示。
公式1C(τ)=1+1N[11+τ/τD][11+(1/S)2(τ/τD)]1/2]]>這里，s為s＝z/w，表示觀測區域的半徑(w)和半長軸的比。τD稱為擴散時間(或相關時間)，表示熒光分子通過擴散通過觀測區域的平均時間。N表示在一定時間內存在于觀測區域中的分子的平均數。
如果用公式(1)分析波動，可以獲得如圖4(C)中所示的曲線，由此可以獲得表示分子的“波動”擴散時間τD和分子的“數量”N。如果分子的尺寸(大小)通過與其它分子會合等變大，相關曲線就向右移動，相反，如果通過解離等大小變小就向左移動。
公式(1)所得的擴散時間τD存在擴散常數D與公式(2)的關系。
公式2τD＝w2/4D進而，根據假定分子為球的情況的Einstein-Stokes公式，擴散常數D與分子半徑r存在公式(3)所示的關系。
公式3D=κDT6πηr]]>這里，κB，T和η分別是玻耳茲曼常數，絕對溫度和溶劑的粘性。因此，根據公式(2)和(3)擴散時間τD與相當于分子的“大小”(尺寸)的分子的半徑r的關系如公式(4)所示。
公式(4)τD∝/D∝r通過用公式(1)和(4)分析這種熒光強度的波動，可以獲得存在于觀察區域內的分子的“數量”和“大小”。與波動和自相關函數相關的詳細說明在說明書中解說(武者利光著《Bluebacks波動》，講壇社，1980；D，Eisenberg等人名著《用于生命科學的物理學(下)》，培風館，p596-600，1988；日野干雄著《光譜分析》朝倉書店，p25-39，1977)。
(使用FCS測定的場合的操作，需要時間)對于本發明的通過FCS對抗原蛋白質進行檢測和/或測定的操作，所需時間，通過與使用以往方法ELISA的抗原蛋白質的檢測和/或測定法的情況進行比較來表示。
(1)操作的比較(簡便性的比較)本發明的通過FCS對抗原蛋白質進行迅速檢測和/或測定的方法的各個步驟中的操作示于表1。
表11.操作的比較(簡便性的比較)
(2)所需時間的比較(迅速性的比較)本發明的通過FCS對抗原蛋白質進行迅速檢測和/或測定的方法的各個步驟所需時間示于表2中。
表22.所需時間的比較(迅速性的比較)
以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明，但是本發明的技術范圍不受這些示例的限定。
實施例1[使用FCS的抗原(抗原蛋白質)的檢測測定](裝置和材料)(1)裝置FCS裝置分子間相互作用分析系統(MF-20，Olympus光學工業株式會社制)(2)材料熒光標識抗體片段的制備該實施例中，以抗Prion抗體的熒光標識抗體片段(Fab’-Alexa532)作為例子。
Fab’-Alexa532的制備的概況示于圖5中。使用PD-10柱(Pharmacia)以檸檬酸溶液(pH6.3)平衡抗PrP抗體溶液后，添加胃蛋白酶(1％(w/w))(37℃，約30分鐘)，制備F(ab′)2。用HPLC(柱；G300SWXL)確定消化程度。然后，用0.1M磷酸緩沖液(pH6.3)，用FPLC(柱；Superdex 200(16/60))純化后，濃縮保存。進而，添加2-mercaptomonomethylamine(0.01M)還原(37℃，約1.5小時)，制備F(ab′)2。用HPLC(柱；G300SWXL)確定還原的程度。然后，使用PD-10柱(Pharmacia)，以檸檬酸緩沖液(pH3.5)平衡化后，迅速加入2當量的Alexa532順丁烯二酰亞胺(分子探針)，于4℃放置一晚進行結合。然后，用0.05M磷酸緩沖液(pH7.8，0.05％NH3)，用FPLC(柱；Superdex 200(16/60))純化，于-80℃冷凍保存。兩種抗PrP抗體(上述標識片段化的抗體，作為完全型抗體使用的抗體)和重組牛PrP(抗原)都是由富士REBIO(株)提供的。
(抗原蛋白質的檢測，測定實驗操作)在用N101(日本油脂)封閉處理的384孔板(Olympus光學工業株式會社)上，按順序加入Fab’-Alexa532(熒光標識抗體片段)(6.86E-10M)，prion蛋白質(抗原蛋白質)(6.12E-8M)和完全型抗體(抗牛重組prion抗體)(8.76E-7M)，用移液管充分攪拌。37℃放置1小時后，用MF20(FCS測定裝置Olympus光學工業株式會社)測定。測定時的激光功率設為150μW，進行30秒×3次的測定。使用MF20的處理軟件以擴散時間為首導入各參數。
(實驗結果)實驗結果示于圖6。在該實施例中，Prion蛋白質的分子量為約30kDa，因此存在不使用完全型抗體時擴散時間不存在顯著差異的可能性。具體的是，熒光標識抗體片段和復合體(熒光標識抗體片段和+Prion蛋白質)的理論的擴散時間分別為約600μs，650μs。在實驗中，熒光標識抗體片段和復合體(熒光標識抗體片段和+Prion蛋白質)的擴散時間分別達到約600μs，650μs，不會產生顯著的差異(圖6)。另一方面，熒光標識抗體片段和復合體(熒光標識抗體片段和+完全型抗體+Prion蛋白質)的理論的擴散時間分別為約600μs，900μs，會產生顯著的差異。在實驗中，熒光標識抗體片段和復合體的擴散時間分別達到約600μs，950μs，接近于理論值，產生了顯著的差異(圖6)。因此，通過該實施例，驗證了使用本方法可以檢測如果不使用本發明的方法就無法檢測的分子量小的抗原。
工業上利用的可能性本發明的通過熒光相關分光法(FCS)對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，不依賴于檢測和/或測定的抗原蛋白質等抗原的形狀和分子量，即使是異常型Prion等病原性蛋白質和食品材料中所含的有害蛋白質等分子量比較小的抗原蛋白質等抗原的情況下，也可以檢測和測定，因此可以用于檢測和/或測定大范圍的抗原。此外，本發明的檢測和/或測定法通過FCS進行檢測和/或測定，不經歷試樣的物理的分離過程，就可以大致實時檢測測定蛋白質分子的數量，大小或形狀等物理量，可以用簡便的操作，迅速且正確地檢測和/或測定抗原。
進而，通過FCS進行檢測和/或測定的本發明的方法，用于用FCS檢測和測定的處理操作是混合被檢試樣(包括抗原)和由熒光標識抗體片段和非熒光標識化完全型抗體構成的檢測試劑，只進行抗原抗體反應的操作，并且，由于其測定結果可以實時監測，因此被檢試樣與檢測試劑的混合直至反應得到的測定結果的表示趨于自動或半自動進行。此外，與以往可以在Prion等抗原蛋白質的測定中使用的ELISA和westernblot法等方法比較，該方法分析操作中涉及的步驟少，試樣即使為 也可以測定，因此可以經濟地且大量地進行被檢試樣的測定，可有望作為一種實用的抗原蛋白質的測定方法來使用。
權利要求
1.一種通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于使用以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體，使之形成抗原與熒光標識抗體片段以及非熒光標識化完全型抗體的抗原抗體復合體，通過熒光相關分光法檢測、分析形成的抗原抗體復合體
2.根據權利要求1記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述抗原是抗原蛋白質。
3.根據權利要求1或2記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述通過熒光相關分光法檢測、分析形成的抗原抗體復合體是利用基于熒光標識化熒光標識抗體片段與形成的標識化抗原抗體復合體的擴散速度差異的識別對抗原進行檢測、分析。
4.根據權利要求1-3中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述抗原的迅速檢測和/或測定是基于通過熒光相關分光法對形成的抗原抗體復合體進行的檢測、分析，對抗原的存在，抗原的濃度，抗原的大小或抗原的形狀的檢測和/或測定。
5.根據權利要求1-4中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于，所述以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段是由以抗原作為免疫原制備的單克隆抗體而制備的，所述以抗原蛋白質的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體是以抗原作為免疫原制備的單克隆抗體。
6.一種通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于，在被檢試樣中添加以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體，使之進行抗原抗體反應，通過熒光相關分光法檢測、分析所形成的抗原與熒光標識抗體片段以及非熒光標識化完全型抗體的抗原抗體復合體。
7.根據權利要求6記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述抗原是抗原蛋白質。
8.根據權利要求6或7記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述通過熒光相關分光法的抗原的檢測和/或測定不經歷被檢試樣中所含的抗原的物理的分離過程而進行。
9.根據權利要求6-8中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于自動或半自動地進行以下過程在被檢試樣中添加以抗原的表位作為目標的熒光標識化的熒光標識抗體片段，和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體的過程，通過該被檢試樣，熒光標識抗體片段和非熒光標識化完全型抗體進行抗原抗體反應的過程，和用熒光相關分光法檢測分析進行了該抗原抗體反應的被檢試樣的過程。
10.根據權利要求6-9中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述被檢試樣是生物體蛋白質試樣，所述抗原是病原性蛋白質抗原。
11.根據權利要求10中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述病原性蛋白質抗原是異常型Prion。
12.根據權利要求6-9中任一項中記載的通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定方法，其特征在于所述被檢試樣是食品材料，所述抗原是食品材料中所含的有害蛋白質抗原。
13.一種用于通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定的檢測試劑，其由以檢測和/或測定的抗原表位為目標的熒光標識化熒光標識抗體片段和以抗原的其它表位為目標的非熒光標識化完全型抗體構成。
14.一種用于通過熒光相關分光法對抗原進行迅速檢測和/或測定的試劑盒，其裝備有權利要求12記載的檢測試劑。
全文摘要
本發明提供一種通過簡便的操作能夠迅速且正確地檢測和/或測定異常型prion或像食品材料中所含的有害蛋白質這樣的抗原蛋白質等抗原的檢測和/或測定方法。在使用熒光相關分光法(FCS)的抗原分子的檢測，測定中，通過使用熒光標識抗體片段和通過抗原與該熒光標識抗體片段結合的非熒光標識化完全抗體，使在不與抗原結合的熒光標識抗體片段和由熒光標識抗體片段－抗原－非熒光標識化完全抗體之間的抗原抗體反應形成的復合體之間產生了擴散速度中的顯著差異，使之不依賴于抗原的形狀和分子量，即使是像分子量較小的抗原蛋白質這樣的抗原的情況也可以使用FCS檢測測定抗原，可以迅速測定大范圍的抗原。
文檔編號G01N33/558GK1997894SQ20058001803
公開日2007年7月11日 申請日期2005年6月1日 優先權日2004年6月3日
發明者金城政孝, 堀內基広, 藤井文彥, 坂田啟司, 田村守, 上野雅由, 柳谷孝幸 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構