傳感工具的制作方法

專利名稱：傳感工具的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種使用直徑為納米尺寸的粒子的生物傳感工具(biosensing tool)及傳感方法，其中所述粒子的特征為含有脂質膜和“具有形成粒子能力的蛋白質”且為中空結構。
背景技術：
近年，人們正在積極地從事通過標記特定分子或利用只有此分子具有的特異活性，使該分子與其他分子相區別，從而選擇性地傳感檢測(sensing)此分子的研究。特別是，在疾病的早期診斷或環境激素的測定等醫學或環境、食品檢查、生命科學領域等中，迫切要求能夠特異地且高靈敏地傳感檢測生物體內或環境中存在的極微量的蛋白質或核酸或化合物等，因此，人們正積極地從事物質的特異性標記方法或提高測定靈敏度的研究。
作為微量物質的高靈敏度傳感方法，大致包括利用熒光或發光等標記目標物質進行傳感的方法，或利用高靈敏度地檢測與物質的結合的表面等離振子共振技術(SPRSurface Plasmon Resonance)或石英晶體微量天平(QCMQuartz Crystal Microbalance)等進行傳感的方法，通過采用上述方法，能夠傳感檢測ng至pg單位的物質。采用熒光或發光等標記的傳感方法，是一種通過用產生熒光或發光等強信號的物質(例如作為綠色發光蛋白質的綠色熒光蛋白質(green fluorescentprotein)或作為發光酶的熒光素酶(luciferase)等)特異地標記想要檢測的物質，并傳感檢測此標記物質來提高靈敏度的方法(參見非專利文獻1)。近年，為了提高通過上述方法進行傳感的靈敏度，人們正在積極地從事應用納米大小的粒子的研究。例如，已經設計出以下方法將標記物質(特別是HRP等酶)包埋于由脂質構成的直徑為200～500nm的脂質體中，在交聯劑等作用下使抗體等生物識別分子與脂質體表面共價結合的方法(專利文獻1)，或在被稱為“量子點(quantum dot)”的直徑為10～15nm的熒光粒子表面上固定抗體或生物素或鏈霉親和素標記(streptavidin tag)等，通過熒光進行檢測的方法(專利文獻2、非專利文獻2)。此外還設計出以下方法利用由聚合物構成的微粒的方法，或在由微生物產生的直徑為100nm左右的磁性粒子表面通過某些方法固定二級抗體，以粒子具有的磁性作為檢測的標記物質進行檢測的方法(非專利文獻3)或利用膠體金(colloidalgold)的方法(非專利文獻4)等。另外，在測定的迅速且簡便化方面，開發了利用SBA(Suspension Beads Array)方法、可同時測定最多100種抗原的自動系統(非專利文獻5)。SPR是通過利用表面等離振子(plasmon)測定物質結合時金屬表面的電荷密度波的變化，測定物質的結合力或量的方法，其中所述表面等離振子為局部存在于金屬(衍生物)界面，并沿著該界面傳播的電磁波(參見非專利文獻6，7)。QCM是利用基本振動頻率與吸附到電極上的質量成比例地減少，在納克水平測定物質結合量或結合和解離的速度的方法(參見非專利文獻7，8)。
并且，人們也正在積極從事將蛋白質等呈遞(present)到細胞表面用于生物傳感檢測的研究。具體而言，人們正在嘗試將功能蛋白質或肽等呈遞到酵母等活細胞或病毒表面的方法(參見非專利文獻9～11、專利文獻3、4)。
非專利文獻1大島等著，Post-Sequence Protein Experimentation2，東京化學同人，2002年，p130-146非專利文獻2Ozkan，M.，Drug Discovery Today，2004年，第9卷，p1065-1071非專利文獻3田中 剛·松永是著，日本應用磁學會志，2004年，第28卷，p675-679非專利文獻4Penn，S.et al.，Current Opinion in ChemicalBiology，2003年，第7卷，p609-615
非專利文獻5Nolan，J.，Mandy，F.，Cell and Molecular Biology，2001年，第47卷，p1241-1256非專利文獻6岡本隆之·山口一郎著，表面等離振子共振和其在激光顯微鏡中的應用，激光研究，激光學會，1996年，24卷，10號，p1051-1053非專利文獻7大島等著，Post-Sequence Protein Experimentation3，東京化學同人，2002年，p115-137非專利文獻8岡 惠雄·古澤宏幸著，先端化學系列III，丸善株式會社，2003年，p67-73非專利文獻9Szardenings M，J.，Recept Signal Transduct Res.，2003年，23，p307-49非專利文獻10植田充美，生物科學與工業，(財)生物產業協會，1997年，55，p253-254非專利文獻11植田充美·村井稔幸，生物工程學，日本生物工程學會，1998年，76，p506-510專利文獻1特開2003-149246號公報專利文獻2美國專利6274323號專利文獻3特開2001-316298號公報專利文獻4特表2003-504506號公報發明內容在生物體內或環境中含有大量以pg以下超微量級存在、但具有非常重要的生理活性的分子。由于只用以上述方法為代表的傳感方法難于測定這些超微量存在的分子，因此需要通過濃縮或純化等放大傳感信號的工序。但是，這些工序十分繁瑣，并且由于非特異地附著在濃縮·純化時的裝置上，導致試樣損失，或試樣中大量存在的分子產生掩蔽效應等，特別是試樣中目標物質的含量越微量，其傳感檢測就越困難。所以，為了能夠傳感檢測生物體內或環境中以超微量存在的分子，人們期待確立一種能夠放大傳感信號的方法。并且，還期望此放大技術易于與目前的傳感技術(量子點、SPR、QCM等)合用，由此實現目前傳感方法靈敏度的提高。另外，在以DNA芯片或蛋白質芯片為代表的生物芯片之類的要求使用微量試樣進行定量且高靈敏度傳感檢測的情況下，傳感信號的放大技術是必不可少的技術。
作為提高上述生物傳感靈敏度的有效方法，考慮在易于傳感的結構體表面結合能夠特異地檢測目標物質的生物識別分子，通過傳感檢測與目標分子結合的該結構體，放大傳感信號。作為易于傳感的結構體，包括量子點、脂質體、聚合物、磁性粒子、膠體金等粒子或酵母等活細胞、病毒等。
但是，由于量子點的識別物質僅限于熒光，所以其通用性受到制約，即不能利用在使用抗體作為生物識別分子的免疫學檢測方法等中最普遍的HRP(辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase))或AP(堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase))等酶作為識別物質。因此，為了能夠檢測量子點的熒光必須使用昂貴的檢測裝置。而且也存在量子點自身價格非常高的問題。另外，利用脂質體的方法，能夠使用靈敏度比熒光高的HRP或AP等酶，但必須將其包埋于粒子內，因此，必須進行高溫或渦流、超聲波之類易于使蛋白質變性的苛刻處理。由于該方法必須另外合成·純化并添加作為標記物質的酶，所以與量子點相同，生產成本高。并且，脂質體還存在物理學穩定性低的問題。另外，磁性粒子或膠體金不僅標記方法受限而且檢測靈敏度不充分。在由聚合物或金屬構成的微粒中自身發出熒光的材料較多，使用光學檢測器的熒光或發光等的傳感易于產生較高背景，從該方面考慮在材料的選擇中也存在較多的限制。如上所述，在現有的檢測信號放大技術(傳感技術)中存在靈敏度、通用性、生產成本、需要高價檢測裝置等妨礙其實用化的種種課題。
除上述課題外，作為現存檢測信號放大技術中共同的重大課題，可以舉出，抗體等生物識別分子與粒子結合時，由于在使生物識別分子方向一致的狀態下與粒子表面結合是非常困難的，因此以隨機方向與粒子結合的生物識別分子所致的非特異結合增加。上述非特異結合的增加可導致檢測精度降低。特別是，試樣中目標物質濃度越微量非特異結合的問題越大。為了防止上述非特異結合，考慮用脂質等覆蓋與目標物質結合的反應部位以外的部位。例如，通過使用由人工的、或來自生物的脂質膜構成的粒子來避免非特異結合，但人工的脂質顆粒(脂質體)除上述問題外，還存在生物識別分子的呈遞量少，及生物識別分子難于排列(align)等問題。
此外，在上述現存的檢測信號放大技術中共同存在的另一課題為，必須分別配制粒子、標記物質和生物識別分子，通過交聯結合等人工地使之結合。因此，存在質量難于控制、批量生產的質量參差不齊等生產率方面的問題。另外，在上述現存的檢測信號放大技術所用粒子的生產中，多使用有機溶劑等，也會讓人擔心對環境產生影響。如上所述，現存的檢測信號放大技術還存在檢測特異性或精度、生產率、環境安全性等問題。
另外，雖然可以通過基因工程方法等將生物識別分子呈遞并排列在活細胞或病毒的膜表面(參見微生物學和分子生物學評論，1171-1190，1998)，但是，在其應用中，在感染或對環境的影響等安全性方面受到諸多限制。并且，當使用活細胞時內源性酶或化合物能夠引起背景增加或阻礙傳感反應等。另外，目標物質以外的物質與表面(特別是細胞壁)結構非特異性結合，易于產生較高背景。
如特開2001-316298號公報中記載，“具有形成粒子的能力的蛋白質”在細胞內通過自我組織化引入(incorporate)細胞內的脂質雙層膜，同時形成納米尺寸的中空納米粒子，自我組織化形成的“具有形成粒子的能力的蛋白質”高密度地排列在該中空納米粒子表面。
但是，目前為止，尚無通過使用該粒子來放大傳感信號·提高靈敏度的應用例，僅用于通過檢測該粒子鑒定有無病毒感染，或用于臟器特異性地轉運藥物的DDS研究等。
因此，鑒于上述現狀，本發明提供一種能夠解決現有技術的問題、并能夠高精度且高靈敏度地傳感檢測目標物質(基因、蛋白質、化合物等)的通用工具及使用該工具的傳感方法。
本發明人等經潛心研究，結果發現，通過使用該中空納米粒子能夠徹底解決關于現存的高靈敏度傳感技術的上述課題，從而完成本發明。
即，此“具有形成粒子的能力的蛋白質”通過采用基因工程方法等實施改變·修飾，在粒子表面能夠高密度地結合·排列抗體等生物識別分子或標記物質，因此顯著地提高該粒子的檢測靈敏度。
此外，作為本發明的中空納米粒子的最重要的特征，可以舉出，由于其結構為脂質雙層膜包圍在自我組織化的“具有形成粒子的能力的蛋白質”的周圍，從而使與目標物質結合的反應部位以外的部位被脂質包覆，所以不易引發非特異性結合，因此，顯著地提高了檢測的特異性和精度。
此外，不僅多種生物識別分子可與粒子表面結合，而且能夠使用熒光體、酶、放射性同位素等作為粒子的標記物質，因此通用性廣泛。并且，當由細胞生產中空納米粒子時，不僅可以通過基因工程方法同時生產抗體等生物識別分子或作為標記物質的酶等，且可以通過克隆化穩定地生產均一質量的中空納米粒子，另外能夠采用易于處理的酵母等作為本粒子的生產體系，因此在生產率或生產成本方面具有優異的效果。由于能夠采用酶等作為標記物質，所以不一定需要使用昂貴的檢測裝置。此外，由于本粒子由細胞生產，其生產過程中不需要使用有機溶劑等，且該粒子為由蛋白質和脂質構成的可生物降解的粒子，因此具有優異的環境安全性。此外，從不使用活體細胞或病毒的方面看，沒有感染等危險性，同時也能避免由內源性酶或化合物所致的檢測阻礙或背景的問題。并且，該粒子具有下述特征，即自身無熒光，物理性質非常穩定，即使在熱或存在表面活性劑或者8M尿素的條件下等，仍然能夠維持其形態等。
為解決上述課題，本申請的第1項發明提供一種由生物識別分子與具有引入脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質結合形成的傳感工具。
本申請的第2項發明提供前述第1項發明中所述的傳感工具，其中，蛋白質為病毒表面抗原蛋白質。
本申請的第3項發明提供前述第1或第2項發明中所述的傳感工具，其中，選自熒光分子、發光分子、吸光分子、或具有放射性同位素的分子中的一種以上分子與中空納米粒子的脂質雙層膜、具有形成粒子能力的蛋白質、或生物識別分子結合，或者包埋于中空納米粒子中。
本申請的第4項發明提供一種使用平面膜狀生物識別分子排列體的傳感工具，所述排列體由前述第1至第3項發明中的中空納米粒子在基板上排列形成。
本申請的第5項發明提供一種使用前述第1至第4項發明中任一項所述的傳感工具的生物傳感方法。
本發明提供一種利用呈遞了生物識別分子的中空納米粒子、有效地傳感檢測生物體內或環境中極微量成分的通用工具及使用該工具的傳感方法。該工具及方法，由于利用基因工程方法等，改變·修飾“具有形成粒子的能力的蛋白質”，在粒子表面高密度地結合·排列抗體等生物識別分子或標記物質，因此顯著地提高了該粒子的檢測靈敏度。
作為本發明的中空納米粒子的最重要的特征，可以舉出，由于其結構為脂質雙層膜包圍在自我組織化后的“具有形成粒子的能力的蛋白質”的周圍，且用脂質包覆與目標物質結合的反應部位之外的部位，難以引起非特異結合，因此顯著地提高了檢測的特異性和精度。
多種生物識別分子能夠與粒子表面結合，除此之外，能夠使用熒光體、酶、放射性同位素等作為粒子的標記物質，因此通用性廣泛。此外，當由細胞生產該中空納米粒子時，由于不僅可以通過基因工程方法同時生產抗體等生物識別分子或作為標記物的酶等，而且可以通過克隆化穩定地生產質量均一的中空納米粒子，另外能夠使用易于處理的酵母等作為本粒子的生產體系，因此在生產率或生產成本方面都很優異。并且，由于能夠使用酶等作為標記物質，所以不一定需要昂貴的檢測裝置。此外，由于本粒子由細胞生產，所以在其生產過程中不需使用有機溶劑等，并且本粒子為由蛋白質和脂質構成的可生物降解的粒子，因此具有優異的環境安全性。從不使用活細胞或病毒的方面看，無感染等危險性，也能夠避免由內源性酶或化合物所致的檢測阻礙或背景問題。此外，具有自身無熒光、物理性質非常穩定等特征。而且，該工具及方法能夠在SPR、QCM、量子點等現有的物質測定技術中直接應用等，因此，產業上的利用性也很高。


圖1為表示本發明實施例中HBsAg基因的各蛋白質區域的模式簡圖。1～8表示表面抗原的各部位的作用。
圖2為舉例說明本發明實施例中使用基因重組酵母的HBsAg粒子的表達及純化操作的簡圖。(a)基因重組酵母的制作，(b)在High-Pi培養基中培養，(c)在8S5N-P400培養基中培養，(d)破碎，(e)密度梯度離心分離，(f)HBsAg粒子。
圖3表示本發明實施例中HBsAg粒子產生的SPR信號放大效果。X軸表示反應時間(sec)，Y軸表示信號大小。
圖4為本發明實施例中pGLDLIIP39-RcT GFP的模式簡圖。His6-GFP插入限制酶NotI部位之外的部分如圖1所示。
圖5為表示用SPR測定本發明實施例中GFP融合粒子的傳感信號放大效果的結果的圖。X軸表示反應時間(sec)，Y軸表示信號大小。
圖6為表示本發明實施例中由GFP融合粒子形成的平面膜狀生物識別分子排列體的非特異結合抑制效果和生物識別分子的排列效果的圖。X軸表示反應時間(sec)，Y軸表示信號大小。
圖中符號說明1、釋放抑制2、受體3、糖鏈14、聚合血清白蛋白受體
5、跨膜6、穩定化7、糖鏈28、跨膜 低聚合化·分泌本說明書包括作為本申請優先權基礎的特愿2004-104702號說明書中記載的內容。
具體實施例方式
本發明為生物識別分子與蛋白質結合形成的傳感工具，該蛋白質具有引入脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力。
本發明優選結合為共價結合的傳感工具。
本發明優選納米大小的粒子為中空納米粒子的傳感工具。
本發明優選蛋白質為病毒表面抗原蛋白質的傳感工具。
本發明優選蛋白質為B型肝炎病毒的表面抗原蛋白質的傳感工具。
本發明優選蛋白質為具有引入來源于真核細胞的脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質的傳感工具。
本發明優選蛋白質為具有引入來源于酵母的脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質的傳感工具。
本發明優選蛋白質為具有引入來源于動物或昆蟲細胞的脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質的傳感工具。
本發明優選生物識別分子為細胞功能調節分子的傳感工具。
本發明優選生物識別分子為抗原、或抗體、或抗體的一部分、或抗體類似物的傳感工具。
本發明優選生物識別分子為與配體物質結合的細胞表面或細胞內部的受體蛋白質、或其變體、或其一部分、或與其結合的物質的傳感工具。
本發明優選生物識別分子為酶、或其變體、或其一部分、或與其結合的物質的傳感工具。
本發明優選使選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子與生物識別分子結合的傳感工具。
本發明優選使選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子與具有形成粒子能力的蛋白質結合的傳感工具。
本發明優選使選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子與脂質雙層膜結合的傳感工具。
本發明優選使選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子包埋于中空納米粒子的傳感工具。
本發明優選采用納米大小的粒子在基板上排列形成的平面膜狀生物識別分子排列體的傳感工具。
本發明為一種使用傳感工具的生物傳感方法，該傳感工具是具有引入脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質與生物識別分子結合構成的。
在本發明中所謂“脂質雙層膜”是指厚度為5～20nm的由2層脂質層構成的膜，在各層中兩性脂質的極性頭部與親水性溶劑接觸，非極性的烴部分朝向雙層的內部。作為脂質雙層膜的例子，可以舉出細胞膜或核膜、內質網膜、戈爾吉體膜、液泡膜之類活細胞中的生物膜，或人工制作的脂質體等。其中，更優選來源于內質網膜的脂質雙層膜。作為脂質雙層膜，優選來源于真核生物，例如動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆蟲細胞等的脂質雙層膜，特別優選來源于酵母的脂質雙層膜。
本發明中所謂“識別”是指2種以上物質根據相互的結構或性質特異地結合。此結合通過共價鍵、離子鍵、疏水鍵、氫鍵、金屬鍵等所有分子間相互作用而形成，即使被識別的對象物質包含在雜質中也能特異地結合。
本發明中“生物識別分子與具有形成粒子的能力的蛋白質結合”的方式無特殊的限定，但優選生物識別分子根據基因工程方法通過共價鍵與“具有形成粒子的能力的蛋白質”融合(肽鍵)，即生物識別分子與“具有形成粒子的能力的蛋白質”以在細胞中作為融合蛋白質被表達的狀態下形成粒子，或生物識別分子通過物理的或化學的修飾或吸附等方法與“具有形成粒子的能力的蛋白質”結合。此處所謂的“物理的或化合的”修飾或吸附是指利用例如離子鍵、疏水鍵、氫鍵、金屬鍵、或二硫鍵等共價鍵等，或通過上述組合的修飾或吸附。
當然，可以是多個生物識別分子與“具有形成粒子的能力的蛋白質”結合。也可以將多個生物識別分子組合形成一個生物識別分子。此時，生物識別分子之間的結合方式沒有特殊的限定，可以通過共價鍵、離子鍵、疏水鍵、氫鍵、金屬鍵等，或其相互組合形成。
本發明中所謂“中空納米粒子”是指納米尺寸的粒子，優選直徑為20～500nm、更優選50～200nm、進一步優選為80～150nm的粒子，是粒子內部具有裝入多種物質(例如，熒光色素或蛋白質、核酸、化合物等)的空間的粒子。該空間不一定是氣體類空間，也可以是能夠穩定地維持進入內部的物質的溶液類空間。
本發明中所謂的“配體物質”是指激素(用于溝通(communicate)生物個體中某部位細胞與其他部位細胞的分子)或生長因子(控制細胞增殖的物質)、神經遞質(在突觸傳遞神經信息的物質)之類與對應受體結合后傳遞細胞內或細胞間的信號的物質，包括肽或蛋白質或甾體性或低分子化合物。
本發明中所謂“細胞表面”是指細胞壁或細胞膜中或其表面。上述配體物質可以通過下述方法獲得，即由活細胞純化的方法；通過基因重組制作表達配體物質的質粒，使用大腸桿菌或酵母、昆蟲、動物、植物等細胞、或不用細胞的無細胞蛋白質合成體系進行生產、純化的方法或化學合成。
本發明中所謂的“細胞內”是指由細胞膜包圍的全部部分。另外所謂“受體蛋白質”是指與配體物質結合，參與細胞內或細胞間信號傳遞的一系列蛋白質群，作為其例，例如有鳥嘌呤核苷酸結合蛋白或核內受體之類蛋白質群，其存在于細胞膜或細胞內，與激素等配體物質結合，從而將此信號從細胞外向細胞內或從細胞質向細胞核傳遞；或與作為配體物質的生長因子結合的受體酪氨酸激酶或腎上腺素受體之類的識別神經遞質傳遞其信號的蛋白質群等。
本發明中所謂“受體蛋白質”，除上述以外，還包括存在于細胞各膜內、參與金屬離子等的主動轉運的蛋白質群。上述“受體蛋白質”通過下述方法獲得，例如，由活細胞純化的方法；通過基因重組制作表達配體物質的質粒，使用大腸桿菌或酵母、昆蟲、動物、植物等細胞、或不用細胞的無細胞蛋白質合成體系進行生產、純化的方法或化學合成。本發明中“受體蛋白質”不需要全長，只要具有與配體特異結合的能力即可，可以為伴有氨基酸取代·缺損·附加等的變體或受體蛋白質的一部分。
本發明中所謂“酶”為通過在細胞內外修飾、剪切、融合、變性、結合核酸或糖、脂質、或其他的蛋白質而控制細胞生命現象的一系列蛋白質群，例如可以舉出蛋白酶或磷酸·糖鏈修飾酶、核酸裂解(限制)酶、糖·脂質分解酶、核酸·蛋白質·糖·脂質的生物合成酶等，并且其自身無活性但有助于其他酶的活性的輔酶也包括在其中。
本發明中作為受體蛋白質或酶的“變體”，包括通過基因工程技術在蛋白質的一處或多處發生氨基酸取代而形成的變體，或從蛋白質的全長中切除一部分或增加新的蛋白質序列形成的變體，及通過核酸·糖·脂質·化合物等對蛋白質的一部分進行修飾形成的、且具有識別與突變前的受體蛋白質或酶作為生物識別分子識別的目標分子相同的分子的活性的變體。為制作上述變體，使用用于在含有表達該蛋白質的基因的環狀質粒上進行氨基酸的缺失、置換或附加的引物以及QuikChange定點突變試劑盒(site-directed mutagenesis kit)、或QuikChange多點突變試劑盒(multi site-directed mutagenesis kit)、或QuikChange XL定點突變試劑盒(STRATAGENE社)等用于引發突變的試劑盒，進行12～18個PCR循環，用限制酶DpnI剪切其產物，轉化至大腸桿菌中即可制作變體。作為通過核酸·糖·脂質·化合物等對蛋白質的一部分進行修飾的具體例子如下，利用磷酸化酶的蛋白質中絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化，利用糖基化酶的天冬氨酸、或絲氨酸、或蘇氨酸殘基的糖基化，或利用還原·烷基化劑的半胱氨酸殘基的還原·烷基化，為制作上述物質，可在蛋白質中混入磷酸、或糖鏈等，加入磷酸化酶或糖基化酶，維持此酶發揮作用的最佳條件(溫度、pH、鹽濃度等)，或在加入了蛋白質的溶液中加入還原劑二硫蘇糖醇或巰基乙醇等使其最終濃度為5mM，在溫度為60℃左右、pH為中性以上的條件下，反應1小時，再加入作為烷基化劑的濃度為5～15mM的碘乙酰胺，在室溫下反應1小時以上。當然除上述舉出的修飾外，還可以考慮針對蛋白質的各種修飾。
另外，本發明中所謂受體蛋白質或酶的“一部分”是指通過基因工程或蛋白質工程取出或合成的具有上述蛋白質全部或部分特性的一部分序列(至少5個以上的氨基酸連續一致的序列)，該序列具有能夠識別與整體的受體蛋白質或酶所能識別的目標物質相同的物質的活性。
另外，本發明中所謂與受體蛋白質或酶“結合的物質”是指能夠與受體蛋白質或酶的活性部位特異結合的物質，如受體蛋白質的配體物質、或酶的底物或抑制劑。或是指在細胞內與上述蛋白質穩定地結合存在的物質，或者通過結合來維持其結構的物質，或發揮輔助或補充其活性的作用的物質，例如，在核內受體中輔助分子伴侶蛋白或酶的活性的金屬離子等輔酶，或具有將受體或酶準確地轉運至細胞內特定部位或將膜結合型受體蛋白質·酶固定到膜上的作用的一系列膜蛋白質群等。
本發明中所謂“具有熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素的蛋白質、或蛋白質衍生物”是指綠色熒光蛋白質或其變體之類的蛋白質自身接受一定波長的光后發出熒光的蛋白質、或通過使用化學修飾法與發出熒光的化合物結合的蛋白質；或熒光素酶、HRP、或AP之類具有使底物發光的活性的蛋白質、或與上述蛋白質結合的蛋白質；或血紅素蛋白之類對特定波長具有強吸收的蛋白質、或與具有光吸收能力的化合物結合的蛋白質、或與具有光吸收能力的肽或蛋白質結合的蛋白質；或者半乳糖苷酶或HRP、AP之類能夠使底物顯色的蛋白質、或與上述蛋白質結合的蛋白質；或通過向蛋白質表達時的培養基中加入放射性同位素H3或C14、N15、P32、S35、Co57、Se75、I125等，或通過化學修飾進行標記的蛋白質。另外，作為上述蛋白質的衍生物，是指通過采用基因工程方法或蛋白質工程方法剪切一部分蛋白質，與其他分子即核酸或糖鏈、脂質、其他蛋白質、或化合物共價結合的物質，另外，蛋白質衍生物還包括使用化學修飾法或酶等使化合物與蛋白質共價結合形成的物質、或用糖基或核酸、脂質等修飾蛋白質形成的物質。此時，熒光、發光、吸光、或放射性同位素可以不標記在蛋白質自身上，而是標記在蛋白質衍生物中的與蛋白質結合的核酸、糖鏈、脂質等上。
本發明中所謂的帶有熒光的“化合物”是指吸收特定波長的光后，在與吸收波長不同的波長范圍內發出熒光的物質，例如可以舉出，熒光素、羅丹明、丹酰、熒光黃VS、傘形酮酰、稀土螯合物、Cy2、Cy3、Cy5、異硫氰酸熒光素(FITC)、ALEXA(注冊商標)(Molecular Probe社)、量子點等。本發明中所謂“基板”，如果為金屬、塑料、有機·無機高分子材料，則沒有特殊限定，但優選使用例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚砜、聚四氟-特氟隆(polytetrafluoro-Teflon)(PVDF)、纖維素、硅、云母、聚甲基戊烯(PMP或TPX(注冊商標))、聚苯乙烯(PSt)、聚四氟乙烯(PTFE)、ABS樹脂、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等樹脂，含有上述高分子化合物的共聚物或復合體，石英玻璃、Pyrex(注冊商標)玻璃、蘇打玻璃、硼酸玻璃、硅酸玻璃、硼硅酸玻璃等玻璃類及其復合體，金、銀、銅、鎳、鈷等金屬及其復合體，陶瓷及其復合體等。另外，優選用上述物質覆蓋基板的整個表面或至少覆蓋進行傳感的部分表面。當然上述基板材料也可以多種組合使用。例如，優選使用金屬覆蓋玻璃基板的組合或用金屬覆蓋樹脂基板的表面形成的基板等。另外，本發明的“基板”也包括為了易于傳感利用親水性聚合物(例如，聚乙二醇或聚乙烯醇等)對表面進行覆蓋或接枝(graft)等處理的基板、或疏水化基板、自由基(radical)化基板、用抗體等蛋白質或DNA等核酸或糖等覆蓋、修飾、處理上述基板得到的基板。
本發明中所謂“平面膜狀生物識別分子陣列體”是指通過本發明定義的中空納米粒子與基板結合，使基板處于由粒子覆蓋的狀態。此制作可采用下述方法，例如使中空納米粒子物理吸附于基板表面的方法、或通過事先用與本中空納米粒子特異地結合的蛋白質或肽、核酸、糖鏈、脂質、金屬等修飾基板表面，從而使中空納米粒子表面的蛋白質或脂質或糖鏈等能夠與基板特異結合的方法等。在本發明的“平面膜狀生物識別分子排列體”中，根據需要，中空納米粒子可以以粒子狀與基板結合，或粒子與基板結合后通過干燥或超聲波處理、電擊等方法破壞粒子，形成平面膜狀的膜與基板結合，因此“平面膜狀生物識別分子陣列體”的厚度為5nm～500nm。本發明中“平面膜狀生物識別分子陣列體”的特征為，本發明的粒子通過“具有形成粒子能力的蛋白質”自我組織化形成，因此，與“具有形成粒子能力的蛋白質”結合的生物識別分子以高密度且有規則地排列在由粒子制作的“平面膜狀生物識別分子陣列體”的表面，這在傳感的精度·靈敏度方面是合適的。并且，還具有下述特征，即在本“平面膜狀生物識別分子陣列體”表面，“具有形成粒子能力的蛋白質”以外的部分由脂質雙層膜構成，難于引起與不參與反應的雜質的非特異結合。
本發明的具有含有脂質和蛋白質且為中空結構的納米大小的粒子的微量生物傳感工具及使用其的傳感方法，通過在具有形成粒子能力的蛋白質上結合生物識別分子，顯著地放大其傳感信號，并且特異地識別各種目標分子，因此通過該發明，也能夠傳感檢測至今難于或不可能傳感檢測的生物體內或環境中的微量成分。
此處，所謂“傳感工具”是指通過將目標物質固定在基板上、并且結合中空納米粒子檢測熒光、發光、吸光、放射性強度等的變化的裝置，其中所述中空納米粒子含有識別目標物質的生物識別分子；或是指通過向含有目標物質的溶液中加入結合有識別目標物質的生物識別分子的該中空納米粒子，檢測濁度、熒光、發光、吸光等的變化的裝置。本發明的“傳感工具”也包括將該粒子作為“平面膜狀生物識別分子陣列體”固定在基板上，與目標物質結合，或在將該粒子固定在溶液中、或基板上的狀態下，與目標物質結合后，再與含有識別目標物質的其他生物識別分子的該粒子反應，通過三明治(sandwich)方式傳感檢測目標物質的裝置。另外，本發明的“傳感工具”還包括為進一步增強傳感靈敏度而實施各種改變的裝置。例如，如下的中空納米粒子裝置也是本發明的變形例之一，即，用識別固定于基板上的目標物質的抗體處理該目標物質，使用在粒子表面結合有能夠特異性識別上述抗體的其他抗體、并且熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素被呈遞至其表面或包埋于其中的中空納米粒子。本發明涉及的生物傳感工具中的中空納米粒子如圖1所示，具有在細胞內能夠高水平表達蛋白質的啟動子序列，其下游為蛋白質的起始密碼子，之后連接能夠將蛋白質運送到內質網的信號蛋白序列與“具有形成粒子能力的蛋白質”序列，且在信號蛋白序列和“具有形成粒子能力的蛋白質”序列之間，或在“具有形成粒子能力的蛋白質”序列內部或下游導入生物識別分子序列，該中空納米粒子可以如下制備制備具有上述序列的表達載體，將其轉化至細胞中，誘導中空納米粒子表達，之后經純化制備得到中空納米粒子。
實施例1和2中舉例說明使用酵母表達·純化中空納米粒子。此處，作為制備中空納米粒子的細胞只要是具有脂質雙層膜，特別優選具有內質網，沒有特殊的限定，優選使用真核生物細胞，例如動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆蟲細胞等，特別優選酵母。其原因在于，酵母具有易于處理、容易進行重組，并且蛋白質的表達效率優良等優選性質。
使用此中空納米粒子的本發明生物傳感工具，通過組合“基板”、“中空納米粒子”及“檢測器”而構成，其中“基板”用于與含有被傳感檢測的目標物質的試樣結合；“中空納米粒子”能夠從與基板結合的試樣中特異地傳感檢測出目標物質，結合用于放大傳感信號的能夠特異地識別目標物質的生物識別分子，并且將熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素呈遞至其表面或包埋于其中；“檢測器”能夠檢測來源于中空納米粒子的熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素的量。使用上述工具的傳感檢測按下述進行使試樣與基板結合，在其上與中空納米粒子反應后，沖洗未與被傳感檢測的目標物質結合的中空納米粒子，之后通過檢測器檢測基板上殘留(即，與被傳感檢測的目標物質特異性結合)的中空納米粒子發出的熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素的量，從而完成傳感檢測。此處，試樣與基板結合的方法有通過干燥試樣使其成為粉末狀態或使其懸濁或溶解在溶液中與基板反應，引起物理吸附的方法；或預先用與被傳感檢測的目標物質特異結合的蛋白質或肽、核酸、糖鏈、脂質、金屬、平面膜狀生物識別分子陣列體等修飾基板，使被傳感檢測的目標物質特異地與基板表面結合的方法。此處，為了促進基板與被傳感檢測的目標物質之間或目標物質與中空納米粒子之間的結合，優選對反應體系進行振動、或旋轉、或溫度控制等。
作為此傳感工具的具體用途之一例，例如，可用于對某種疾病患者的血液中特異存在的蛋白質的存在或含量進行確認·定量，具體方法如下，使該特異存在的蛋白質的抗體或抗體的一部分與基板結合，更優選使用平面膜狀生物識別分子陣列體在陣列狀態下結合，使患者的血液與基板反應，患者特有的蛋白質與基板上的抗體結合·排列后，使用如下所述的中空納米粒子識別與基板結合的患者特有的蛋白質，所述中空納米粒子是表面結合有特異識別上述蛋白質的其他抗體，并且熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素被呈遞至其表面或包埋于其中的中空納米粒子，通過測定來源于中空納米粒子的熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素的量對該蛋白質的存在或含量進行確認·定量。使用此生物傳感工具的傳感檢測，由于具有放大微量信號的效果，所以當患者特有的蛋白質為nmol以下極微量時，發揮其威力。另外，也能夠應用于環境激素的測定，以二氧芑為例進行說明，“AhR”蛋白質為哺乳動物體內的二氧芑受體，在陣列狀態下將“AhR”蛋白質全長或只有二氧芑結合部位與SPR用金屬基板結合，從可能被二氧芑污染的土壤、河水、母乳等中獲得的經過粗制、或未經處理的試樣與基板反應，用不含二氧芑的緩沖液清洗基板后，使表面結合有與二氧芑-AhR結合體特異地結合的核內蛋白質“ARNT”或二氧芑抗體的中空納米粒子與基板反應，根據其表面等離振子的變化，對試樣中二氧芑的有無或含量進行確認、定量。
使用本發明的生物傳感工具測定環境激素，除SPR以外，還可以采用使用QCM的方法或使用將熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素呈遞至其表面或包埋于其中的中空納米粒子的傳感方法等。此時，環境中二氧芑的量非常少，一般情況下，為了定量必須進行從試樣中萃取二氧芑再進行高度濃縮的前處理，需要數日至數周較長時間，期望通過本發明傳感工具的信號放大效果，即使不進行前處理或通過比較簡單的前處理也能進行測定，且測定時間也縮短至數小時～數日。
另外，作為本發明傳感工具的其他用途之一例，含有作為被傳感檢測的目標物質的蛋白質或核酸等的試樣通過SDS-PAGE或瓊脂糖凝膠等進行電泳后，在電或滲透壓的作用下轉印(transfer)至PVDF或纖維性膜上，使轉印后的膜在含有如下所述的中空納米粒子的緩沖液中反應，即結合有能夠特異地識別目標物質的生物識別分子結合，并將熒光、發光、吸光、或放射性同位素呈遞至其表面或包埋于其中的中空納米粒子，轉印到膜上的目標物質或核酸等與中空納米粒子結合。之后用不含中空納米粒子的緩沖液清洗未結合的中空納米粒子，檢測殘留在膜上的來源于中空納米粒子的熒光、發光、吸光、或放射性同位素的量。
作為由“具有形成粒子的能力的蛋白質”構成的中空納米粒子，能夠舉出通過在真核細胞中表達蛋白質獲得的中空納米粒子。即，當在真核細胞中表達“具有形成粒子的能力的蛋白質”時，該蛋白質作為膜蛋白質表達、蓄積在內質網膜上，作為粒子釋放。此時，作為真核細胞能夠使用酵母或昆蟲細胞等。在本發明中酵母或動物細胞、昆蟲細胞中還包括基因重組的酵母或動物細胞、昆蟲細胞。使用酵母形成中空納米粒子的方法，從由菌體內的可溶性蛋白質以高效率生成粒子的方面考慮，是優選的方法。另一方面，昆蟲細胞可以說是比酵母更加接近高等動物的真核細胞，從能夠修飾用酵母不能修飾的糖鏈等高級結構的方面考慮，可以說是在外源蛋白質的大量生產中優選的方法。
由于目前的昆蟲細胞類使用桿狀病毒且伴有病毒粒子的表達，因此，在蛋白質表達時細胞易于死亡或溶解。結果，存在從死亡細胞中游離出的蛋白酶分解表達的蛋白質的問題。另外，分泌表達蛋白質時，由于蛋白質中混入大量培養基中含有的胎牛血清，所以多存在即使分泌到培養基中也難于純化的情況。但是最近，Invitrogen社開始銷售不使用桿狀病毒的昆蟲細胞系或無血清培養試劑。所以，通過利用上述材料，能夠得到易于純化并且能夠維持高級結構、糖基化修飾的蛋白質粒子。作為上述“具有形成粒子的能力的蛋白質”能夠使用從多種病毒中獲得的亞病毒粒子。具體可舉出，B型肝炎病毒(Hepatitis BVirusHBV)或C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)、微小病毒(microvirus)、噬菌體病毒(phage virus)、腺病毒(adeno virus)、Hepasonavirus、Parbo virus、乳多空病毒(papova virus)、逆轉錄病毒(Retrovirus)、呼腸孤病毒(Reo virus)、冠狀病毒(Corona virus)、家蠶質型多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)等表面抗原，或多角體蛋白等。
發明人等發現并報道了如下制備的中空納米粒子，即，如后述實施例所示，通過采用基因重組酵母表達前述HBV表面抗原L蛋白質，能夠形成短徑約為20nm、長徑約為150nm的橢圓狀中空納米粒子，該中空納米粒子利用HBV表面抗原L蛋白質在來源于酵母內質網的脂質雙層膜中包埋大量的該蛋白質(J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992)。上述粒子，由于完全不含HBV基因組或其他HBV蛋白，所以不具有作為病毒的功能，對人體的安全性極高。進而，使用酵母生產該中空納米粒子，由于不使用對人體有病原性危險的牛血清，因此，對人體的安全性進一步提高。
本發明的含有脂質的中空納米粒子中，通過將根據如上所述的各種方法獲得的粒子表面的“具有形成粒子能力的蛋白質”變為任意的生物識別分子或與任意的生物識別分子相結合，能夠特異地識別各種物質(核酸、蛋白質、肽、及化合物等)，顯著地增強其傳感靈敏度。
當然，“具有形成粒子能力的蛋白質”并不僅限于上述B型肝炎病毒表面抗原蛋白質，只要是能夠形成粒子的蛋白質即可，可以使用任一種蛋白質。例如來源于動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、病毒、噬菌體、細菌類、菌類等的天然蛋白質或通過基因重組獲得的蛋白質、各種合成蛋白質等，但優選使用來源于病毒的蛋白質，進一步優選來源于肝炎病毒的蛋白質，更優選來源于B型肝炎病毒的蛋白質。
作為與“具有形成粒子能力的蛋白質”結合的生物識別分子，例如可以舉出細胞功能調節分子。在本發明中所謂“細胞功能調節分子”是指能夠控制細胞生存所必需的各種生命現象的因子，例如，抗體或抗體類似物、各種抗體的抗原物質、與抗體結合的蛋白質、生長因子、細胞因子、酶、細胞表面或內部的各種配體物質的受體蛋白、生物激素或環境激素、伴侶蛋白、淀粉樣蛋白等。實際作為生物識別分子使用時，不一定需要上述列舉分子的全長，可以為其一部分或衍生物。上述生物識別分子的組成為，蛋白質或肽、核酸、糖鏈、脂質等和其衍生物，例如經糖鏈或磷酸、化合物等修飾的蛋白質或肽、或核酸等。同樣也可以為用蛋白質、肽、核酸等修飾的糖或脂質。
作為本發明的“細胞功能調節分子”的獲得方法，例如，用各種純化柱從活細胞中純化的方法或通過基因重組制作表達細胞功能調節分子的質粒，使用大腸桿菌或酵母、昆蟲、動物、植物等的細胞、或不用細胞的無細胞蛋白質合成體系進行生產、純化的方法等。采用基因重組法時，為了便于純化，也可以在細胞功能調節分子中加入組氨酸標簽(His-tag)等標簽物質。作為未加入標簽簡單地表達·純化細胞功能調節分子的方法，也可以使用無細胞體系的純化體系(puresystem)(PGI社)的方法。另外，作為本發明的生物識別分子的細胞功能調節分子不為蛋白質時(例如，核酸或類固醇物質等)可以通過從生物體純化或化學合成進行制備。
在本發明中所謂“抗體類似物”是指從生物體獲得的抗體以外的能夠特異性地識別成為抗原的物質的來自生物體的或人工合成的化合物，例如可以舉出，通過基因重組只改變抗體的抗原識別部位得到的單鏈抗體(single chain antibody)或親和抗體(affibody)、或能夠特異識別含有被DNA結合蛋白質特異地識別的DNA序列的核酸分子或核酸的某段序列的蛋白質、或能夠特異地識別淀粉狀纖維結構的蛋白質或化合物等。可以根據目標物質(蛋白質、核酸、化合物、細胞、或組織等)適當選擇上述物質。作為此抗體類似物的獲得方法，可以舉出根據基因重組制備表達抗體類似物的質粒，使用大腸桿菌或酵母、昆蟲、動物、植物等的細胞、或不用細胞的無細胞蛋白質合成體系進行生產、純化的方法；或用蛋白質分解酶等剪切抗體，對其一部分進行純化、使用的方法；或當抗體類似物不是蛋白質時，可以使用通過化學合成或從細胞萃取所得的產物等。采用基因重組方法時，為了簡便純化也可以在抗體類似物中加入組氨酸標簽等標簽物質。作為不加入標簽簡單地表達·純化抗體類似物的方法，也可以使用無細胞體系的純化體系(PGI社)的方法。當然，本發明中的“生物識別分子”并不僅限于細胞功能調節分子，具有與被傳感檢測的目標物質特異結合的能力的分子均能滿足要求。
另外，制備本粒子時，根據目的可以采用多種方法。例如，也可以通過電穿孔、或超聲波、或自然擴散法等方法，將能夠發出熒光、或發光、或吸光、或放射性同位素的物質包埋在中空納米粒子中，放大傳感信號。此時所謂的“電穿孔”是指通過電擊導入物質的方法，根據包埋物質的性質或濃度等的不同，最佳條件也不同，但一般為在約200mV～1000V的電壓下經幾毫秒～幾分鐘的處理，可在粒子中包埋多種物質。通過超聲波或自然擴散法的包埋，是通過使中空納米粒子和待包埋的物質在水或緩沖液中共存，并進行攪拌或靜置，或在10～400瓦特的強度下超聲波處理10秒～2小時后完成。另外，可以通過化學修飾法或基因工程方法在“具有形成粒子的能力的蛋白質”的一部分上結合除目標生物識別分子之外的下列物質用于純化本粒子的標簽蛋白質、或用于簡化傳感檢測的發出熒光、發光、吸光、或放射性同位素的物質、還有為了使上述蛋白質的一部分固定在各種傳感基板(使用SPR或QCM等特異性傳感物質時的基板)上的物質等，由此可以使多個分子同時與一個中空納米粒子結合。多個分子與上述粒子表面(粒子的外側或內側)的結合，可以不是通過一個表達載體，而是通過分別使不同的分子與“具有形成粒子能力的蛋白質”結合形成的多個表達載體同時在一個細胞中表達而完成。使蛋白質呈遞至表層的技術，已知有噬菌體展示法或使蛋白質呈遞至酵母表層的方法、抗體等與聚合物或金屬制粒子表面結合的方法(Szardenings M，J.ReceptSignal Transduct Res.，23，307-349，2003；植田充美，Bioscience andIndustry，55，253-254，1997；植田充美，村井稔幸，生物工程，76，506-510，1998)等。但上述技術在安全性或粒子尺寸或制作容易性等方面存在問題，在作為傳感系統的應用中受到限制。由于本申請的納米大小的粒子為純化的蛋白質粒子，所以無感染性、不易受溶劑等環境變化的影響。另外，從可操縱性的方面來看，優選直徑為20～500nm，更優選為50～200nm。此外，作為該納米大小的粒子的應用，如發明人等的論文Anal.Biochem.，Vol.309，196-119，2002所述，由于本發明的納米大小的粒子在硅等基板上展開形成平面膜結構，所以，與粒子表面結合的蛋白質通過脂質雙層膜排列在基板上，從而形成“平面膜狀生物識別分子陣列體”。同時，在基板上此“平面膜狀生物識別分子陣列體”覆蓋脂質雙層膜，從而具有防止目標蛋白以外的蛋白質等非特異地附著到基板上的效果。
如上所述，本發明的使用中空納米粒子的生物傳感工具，為了排列與粒子表面結合的蛋白質的方向性或防止非特異性附著，也可以在基板上展開中空納米粒子傳感檢測物質。此外，本發明的使用中空納米粒子的生物傳感工具也可以用作ELISA法中常用的三明治方式的傳感工具，即，使被傳感檢測的目標物質與“平面膜狀生物識別分子陣列體”結合后，從其上方再用其它中空納米粒子傳感檢測目標物質，由此能夠抑制對基板的非特異性吸附，同時提高目標物質的傳感靈敏度。因此，通過本發明的使用中空納米粒子的生物傳感工具利用各種應用，能夠獲得目前生物傳感工具不能得到的靈敏度和特異性。
如上所述，本發明涉及生物傳感工具及使用該工具的傳感方法，所述傳感工具使用特征為含有脂質和蛋白質且為中空結構的納米大小的粒子，其中，該粒子物理性質非常穩定，由于在粒子表面含有脂質膜成分而產生流動性，而且能夠抑制物質的非特異吸附。其特征為，與將蛋白質呈遞至細菌或病毒等的表面的方法相比較，本發明的方法安全，且由于粒子直徑在100nm左右，也易于應用于SPR等現有的生物傳感方法，能夠有效地放大微量傳感信號。此外，由于使用該工具能夠有效地放大傳感檢測極微量存在的分子時的信號，所以可以應用于以簡便或高靈敏度地傳感檢測生物體或環境中微量成分為目的的多種領域，如蛋白質芯片、醫療中診斷標記的傳感·評價、環境物質測定、生物化學的物質測定·分析等。
實施例以下，根據附圖列舉實施例，更加詳細地說明本發明的實施方案。當然，本發明并不僅限于下述實施例，也可以在細節部分作多種改變。
在以下實施例中，使用實施例1和3的組合了與金屬基板結合的中空納米粒子和金屬基板的SPR裝置或實施例2的組合了帶有抗組氨酸標簽的96孔板和GFP融合粒子以及熒光平板讀數儀的熒光中空納米粒子測定裝置作為本發明的傳感工具。
在以下實施例中，所謂HBsAg表示B型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface Antigen)。HBsAg是HBV的包膜蛋白，如圖1的模式圖所示，在HBsAg中有S蛋白、M蛋白、L蛋白3種蛋白。其中S蛋白是3種蛋白中共有的且重要的包膜蛋白，M蛋白是在S蛋白的N末端側延伸55個氨基酸(pre-S2肽)的蛋白。另外，L蛋白是在M蛋白的N末端側延伸108或119個氨基酸(pre-S1肽)的蛋白。已知HBV與肝細胞結合時，HBsAg L蛋白的Pre-S區域(pre-S1、pre-S2)分別發揮重要的作用。Pre-S1具有與肝細胞直接結合的部位，pre-S2具有通過血中聚合白蛋白與肝細胞結合的聚合白蛋白的受體。在真核細胞中表達HBsAg時，該蛋白作為膜蛋白表達、蓄積在內質網上。HBsAg的L蛋白在分子間引起凝集，進入內質網的同時以芽殖方式作為粒子釋放到腔(lumen)側。在以下的實施例中，使用HBsAg的L蛋白和其變體。圖2為以下實施例所述的HBsAg粒子的表達及純化操作的說明簡圖。
1、利用基因重組酵母表達HBsAg粒子根據發明人等報道的J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992中記載的方法，在合成培養基High-Pi及8S5N-p400中培養具有pGLDLIIP39-RcT的基因重組酵母(釀酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)AH22R-株)，表達HBsAg L蛋白粒子。(圖2a、b)使用酵母蛋白提取試劑(Yeast Protein Extraction Reagen)(Pierce ChemicalCo.制)，由處于穩定期(約72小時后)的基因重組酵母配制全細胞提取液(whole cell extract)，所得提取液用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離，通過銀染色和使用HBs蛋白抗體的免疫印跡法(western blotting)(初級抗體抗HBsAg單克隆抗體)，鑒定試樣中的HBsAg蛋白。
2、從基因重組酵母中純化HBsAg粒子(1)將在合成培養基8S5N-P400中培養的基因重組酵母(濕重量26g)懸濁于100ml緩沖液A(7.5M尿素、0.1M磷酸鈉、pH7.2、15mMEDTA、2mM PMSF、0.1％Tween 80)中，在珠磨式組織研磨器(BEAD-BEATER)中使用玻璃微珠(glass beads)破碎酵母。破碎后通過離心回收上清液(圖2c，d)。
(2)然后，將上清液與0.75倍容量的33％(w/w)PEG6000混合，冰浴冷卻30分鐘。之后，進行離心(7000rpm，30分鐘)，回收沉淀(pellet)。使該沉淀再次懸濁于不含Tween80的緩沖液A中。
(3)將再次懸濁的溶液疊放于具有10～40％梯度的CsCl上，以28000rpm超速離心分離16小時。將離心后的試樣分成12級分，通過免疫印跡法鑒定含有HBsAg的級分。再用不含Tween80的緩沖液A透析含有HBsAg的級分。
(4)將(3)中得到的透析液(12ml)疊放于具有5～50％梯度的蔗糖上，以28000rpm超速離心分離16小時。離心后，與(3)相同地鑒定含有HBsAg的部分，用不合尿素和Tween80、而含有0.85％NaCl的緩沖液A透析含有HBsAg的級分((2)～(4)圖2e)。
(5)反復進行與(4)相同的操作，用超濾器(Ultra Filter)Q2000(Advantech社制)濃縮透析后的試樣，于4℃下冷藏保存至使用時(圖2f)。根據CsCl平衡離心后的蛋白質印跡法(3)的結果，確認HBsAg為分子量52kDa且具有S抗原性的蛋白質。最終從來自2.5L培養基、濕重量26g的菌體中獲得約24mg的純HBsAg粒子。采用銀染色SDS-PAGE分析一系列純化過程中所得級分。另外，為了確認通過純化已除去來自酵母的蛋白酶，將(5)中所得的HBsAg粒子在37℃培養12小時后，進行SDS-PAGE，通過銀染色進行鑒定。結果確認經一系列的純化過程完全除去了來自酵母的蛋白酶。
3、利用納米大小的粒子放大表面等離振子信號在25℃下進行全部的SPR操作。按照上述方法使從酵母中純化得到的HBsAg粒子以50mg/ml的濃度吸附到日本激光電子社的納米傳感器(Nanosensor)用SPR測定芯片上。作為對照，采用相同方法使牛血清白蛋白(BSA)蛋白質吸附在芯片上，測量兩蛋白與SPR的金屬基板結合時的信號變化。此結果如圖3所示，與BSA相比HBsAg粒子的SPR信號為其6倍以上。利用相同的方法，與GFP、IgG等各種蛋白質的SPR信號相比，結果確認HBsAg粒子與SPR基板結合時的SPR的信號比上述蛋白質放大5～10倍以上。根據上述結果確認，使用本發明中的粒子傳感檢測物質的方法能夠顯著地提高其傳感靈敏度。
1、利用基因重組制作融合了生物識別蛋白的HBsAgL粒子的表達載體首先，如發明人等報道的日本專利公開2001-316298所述，對根據作者等的報告J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992記載的方法制作的pGLDLIIP39-RcT進行修飾，制作本實施例中“融合了生物識別蛋白的HBsAg粒子的表達載體”的“pGLDLIIP39-RcT-GFP”。以下簡單說明其制作方法。首先，使用序列號1和2的引物，用限制酶NotI位點(gcggccgc)的序列取代存在于上述pGLDLIIP39-RcT中的HBsAg的L蛋白序列的一部分(3～77編碼區)，制作空pGLDLIIP39-RcT。該取代，使用QuikChange(注冊商標)定點突變試劑盒(Stratagene社)，并按照該試劑盒附帶的說明(protocol)進行，序列號1和2的引物是為了進行上述取代而按照該試劑盒附帶的說明設計的互補序列的引物。然后使用序列3和4的引物進行PCR，進行GFP基因的擴增。序列號3的引物，在5’末端具有限制酶NotI位點的序列，在其下游連接有編碼6個連續組氨酸殘基的序列和識別GFP基因5’末端的29個堿基的序列，另外，序列號4的引物在其5’末端具有限制酶NotI位點的序列，在其下游連接有識別GFP基因3’末端的20個堿基的序列。用限制酶NotI處理通過此序列號3和4的引物擴增的PCR產物，并將其插入·連接在同樣地用NotI剪切的上述制作的載體空pGLDLIIP39-RcT中，由此制作空pGLDLIIP39-RcT中插入了N-末端具有組氨酸標簽的GFP的載體，即pGLDLIIP39-RcT-GFP(圖4)。
2、利用基因重組酵母表達融合了生物識別用蛋白的HBsAgL粒子在合成培養基High-Pi和8S5N-P400中培養具有上述酵母表達載體pGLDLIIP39-RcT-GFP的基因重組酵母(釀酒酵母AH22R-株)，表達與生物識別用蛋白質融合的HBsAg L蛋白粒子。(圖2a，b)使用酵母蛋白提取試劑(Pierce Chemical Co.制)由處于穩定期(約72小時后)的基因重組酵母制備全細胞提取液，所得提取液用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離，通過銀染色和使用組氨酸標簽抗體的免疫印跡法鑒定試樣中與HBsAg L蛋白融合的生物識別用蛋白。按照發明人等報告的日本專利公開2001-316298中所述的方法將pGLDLIIP39-RcT-GFP轉化至酵母AH22R株中。根據上述表明，融合了生物識別用蛋白(GFP的融合)的HBsAg L蛋白的分子量為72kDa。
3、從基因重組酵母中純化HBsAg粒子(1)將在1L合成培養基8S5N-P400中培養的基因重組酵母(濕重量10g)懸濁于100ml緩沖液A(0.1M磷酸鈉、pH7.2、15mM EDTA、2mM PMSF、0.1％Tween 80)中，在珠磨式組織研磨器(BEAD-BEATER)中使用平均直徑為0.5mm的玻璃微珠破碎酵母。破碎后通過離心回收上清液(圖2c，d)。
(2)然后，使用Amersham社的HisTrap柱(1ml)，利用該社的蛋白質純化裝置(ACTA prime)，通過組氨酸和鎳(Ni2+)之間的親和力純化上清液。純化通過下述方式進行，在含有60mM咪唑的PBS(-)(第一制藥)緩沖液中使組氨酸標簽與鎳柱結合，用20ml該緩沖液清洗后，用含有500mM咪唑的PBS(-)緩沖液萃取與鎳結合的粒子。通過銀染色和使用組氨酸標簽抗體的免疫印跡法確認萃取出的蛋白質的純度。
(3)然后，上述蛋白質通過截留分子量為100kDa的超濾膜(Ultra FilterQ2000(Advantech社制))脫鹽、濃縮，于4℃下冷藏保存至使用時。
(4)通過熒光顯微鏡(Olympus社，BX51)可確認，在510nm的波長處GFP融合的HbsAg純化粒子發出較強的綠色熒光。
(5)通過上述一系列的純化操作，最終從來自1L培養基的濕重量為10g的菌體中獲得約2mg的純化粒子。
4、通過GFP融合粒子傳感檢測抗組氨酸標簽抗體將多種濃度的被傳感檢測的目標物質抗組氨酸標簽抗體(Nacalai Tesque，anti-His6 monoclonal)于96孔板(96-well plate)中在4℃下反應(結合)16小時后，在室溫下用0.5％的牛血清白蛋白阻斷1小時。然后，加入200ml按照上述實施例1的方法從酵母中純化的GFP融合粒子(濃度50mg/ml)，反應在室溫下進行，未反應的粒子用PBS清洗3次后，用熒光平板讀數儀(Molecular device社，Spectra Max Gemini EM)，測定延長波長為484nm、發射波長為510nm時與抗組氨酸標簽抗體結合的GFP的熒光。作為對照，在相同條件下只測定從大腸桿菌中純化的具有組氨酸標簽的GFP蛋白。結果確認，與只使用GFP的對照組相比，GFP融合粒子能夠以非常高的靈敏度與抗組氨酸標簽抗體結合，以相對于對照為100倍以上的高靈敏度進行傳感檢測。(表1)[表1]
采用SPR法傳感檢測組氨酸標簽SPR分析芯片與上述實施例2的濃度為50mg/ml的抗組氨酸標簽抗體結合，將其安裝在日本激光電子社的納米傳感器上后，在其上同時流過按照上述實施例1的方法從酵母中純化得到的GFP融合粒子和對照中具有組氨酸標簽的GFP蛋白，測定鎳基板上的組氨酸標簽的傳感靈敏度。結果表明，如圖5所示，與對照組相比，相同量的抗組氨酸標簽抗體的利用SPR的組氨酸標簽的傳感靈敏度能夠大幅度地提高。需要說明的是，也可以使用通過氨基偶聯法結合在SPR傳感器上的鎳絡合物代替抗組氨酸標簽抗體，得到了同樣的結果。
使用SPR傳感檢測抗組氨酸標簽抗體上述實施例2中具有組氨酸標簽的GFP融合粒子以1mg/ml的濃度與日本激光電子社的納米傳感器用SPR分析芯片結合，利用GFP融合粒子形成平面膜狀生物識別分子陣列體。用PBS清洗未反應的GFP融合粒子后，在分析芯片上加入濃度為2mg/ml的BSA，反應10分鐘，用PBS清洗，檢測BSA與平面膜狀生物識別分子陣列體的非特異結合。之后，在分析芯片上加入濃度為200μg/ml的抗組氨酸標簽抗體，反應10分鐘。作為不形成平面膜狀生物識別分子陣列體的對照組，從大腸桿菌中純化的具有組氨酸標簽的GFP蛋白以1mg/ml的濃度與SPR分析芯片結合，進行相同的實驗。其結果如圖6所示。
當從大腸桿菌中純化的具有組氨酸標簽的GFP蛋白與SPR分析芯片結合時，可觀察到BSA的非特異結合，與其相對，在使GFP融合粒子與SPR分析芯片結合的平面膜狀生物識別分子陣列體上，未見BSA的非特異結合。之后，在平面膜狀生物識別分子陣列體上加入抗組氨酸標簽抗體時，通過抗原-抗體反應的特異結合，能夠觀察到穩定的信號。因此，本發明的使用中空納米粒子的平面膜狀生物識別分子陣列體能夠抑制非特異結合，并且生物識別分子進行排列，適用于高靈敏度的傳感。
本說明書中引用的所有出版物、專利及專利申請，直接作為參考引入本說明書中。
產業上的可利用性本發明提供一種利用呈遞了生物識別分子的中空納米粒子、用于有效地傳感檢測生物體或環境中的極微量成分的通用傳感工具及傳感方法，該傳感工具及傳感方法可以應用于要求傳感檢測極微量成分的多種領域，如蛋白質芯片、醫療領域中診斷標記的傳感·評價、環境物質測定、生物化學的物質測定·分析等。
序列表的自由文本序列號1-人工序列說明利用QuikChange(注冊商標)定點突變試劑盒定點突變pGLDLIIP39-RcT時使用的引物序列號2-人工序列說明利用QuikChange(注冊商標)定點突變試劑盒定點突變pGLDLIIP39-RcT時使用的引物序列號3-人工序列說明利用PCR擴增GFP基因時使用的含有6個連續組氨酸密碼子序列的引物序列號4-人工序列說明通過PCR擴增GFP基因時使用的引物序列表<110>東麗株式會社<120>傳感工具<130>PH-2429-PCT<140>
<141>
<150>JP2004-104702<151>2004-03-31<160>4<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>發明人谷澤克行發明人黑田俊一發明人鄭基晚發明人秋山英雄發明人信正均<220>
<223>人工序列說明利用QuikChange(注冊商標)定點突變試劑盒定點突變pGLDLIIP39-RcT時使用的引物<400>1cgacaaggca tgggaggcgg ccgcagccct caggctcag39<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明利用QuikChange(注冊商標)定點突變試劑盒定點突變pGLDLIIP39-RcT時使用的引物<400>2ctgagcctga gggctgcggc cgcctcccat gccttgtcg39<210>3<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明利用PCR擴增GFP基因時使用的含有6個連續組氨酸密碼子序列的引物<400>3agcggccgct caggttctca tcatcatcat catcatagtt ctggttcagt gagcaagggc 60gagga 65<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明通過PCR擴增GFP基因時使用的引物<400>4gcggccgctc ttgtacagct cgtccatg 28
權利要求
1.一種傳感工具，所述傳感工具由生物識別分子與具有引入脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質結合形成。
2.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述結合為共價結合。
3.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述納米大小的粒子為中空納米粒子。
4.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述蛋白質為病毒表面抗原蛋白質。
5.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述蛋白質為B型肝炎病毒的表面抗原蛋白質。
6.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述蛋白質為具有引入來自真核細胞的脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質。
7.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述蛋白質為具有引入來自酵母的脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質。
8.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述蛋白質為具有引入來自動物或昆蟲細胞的脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質。
9.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述生物識別分子為細胞功能調節分子。
10.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述生物識別分子為抗原、抗體、抗體的一部分、或抗體類似物。
11.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述生物識別分子為與配體物質結合的細胞表面或細胞內的受體蛋白質、該受體蛋白質的變體、該受體蛋白質的一部分、或與該受體蛋白質結合的物質。
12.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述生物識別分子為酶、該酶的變體、該酶的一部分、或與該酶結合的物質。
13.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述傳感工具由選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子與生物識別分子結合形成。
14.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述傳感工具由選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子與具有形成粒子的能力的蛋白質結合形成。
15.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述傳感工具由選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子與脂質雙層膜結合形成。
16.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述傳感工具是使選自熒光分子、發光分子、吸光分子及具有放射性同位素的分子中的一種以上分子包埋于中空納米粒子中而形成的。
17.如權利要求1所述的傳感工具，其中，所述傳感工具使用納米大小的粒子在基板上排列形成的平面膜狀生物識別分子陣列體。
18.一種使用權利要求1所述的傳感工具的生物傳感方法。
全文摘要
本發明涉及一種使用中空納米粒子的生物傳感工具及傳感方法，其中所述中空納米粒子的特征為，將特定的生物識別分子導入具有引入脂質雙層膜形成納米大小的粒子的能力的蛋白質中。
文檔編號G01N33/576GK1954215SQ20058001557
公開日2007年4月25日 申請日期2005年3月29日 優先權日2004年3月31日
發明者谷澤克行, 黑田俊一, 鄭基晚, 秋山英雄, 信正均 申請人:東麗株式會社