專利名稱：肽的穩定的制作方法
技術領域：
本發明通常涉及在生物學樣品中，例如來自哺乳動物的血漿或血清樣品中，穩定溫度敏感型分析物，尤其是蛋白質和肽，包括激素和酶，免于降解的領域。
背景技術：
分析生物學樣品，尤其是血清和血漿樣品中的分析物時遭遇的一個問題涉及有些蛋白質和肽的穩定性差。小肽尤其對酶降解敏感。穩定性差要求馬上測試樣品，或者保存在低溫環境中，諸如冰箱中。然而，即使在低溫貯存下，穩定性常常還不夠。如果需將這樣的樣品保存許多天，必須將它們包裝在干冰中。這當然相當不方便。
胃泌素-17是由胃竇G細胞在受到刺激后分泌的肽激素。所述刺激是蛋白質豐富膳食后蛋白質分解的結果。胃的拉伸同樣導致胃泌素，尤其是胃泌素-17的分泌。
胃泌素肽形成自一個胃泌素原分子。多數肽激素是通過使激素原進行蛋白水解切割和酶促修飾而合成的。胃泌素加工可分成三類胃泌素原、甘氨酸延伸的衍生物，和羧基酰胺化的胃泌素。可從人胃分離得到幾種不同的生物學活性胃泌素形式，其中最重要的是胃泌素-34和胃泌素-17。另外，已經從血漿分離得到胃泌素-71，它是最大的有生物活性的胃泌素，以及胃泌素-52和胃泌素-14。胃泌素-17是最強的鹽酸刺激物。胃泌素-17以兩種形式存在，非磺化形式(胃泌素I)，和其中酪氨酸發生磺化的磺化形式(胃泌素II)。這兩種形式同樣有效。胃泌素-17的活性形式是酰胺化的胃泌素-17，其中肽的最后一個氨基酸苯丙氨酸含有額外的酰胺基團。非活性形式是所謂的甘氨酸延伸的胃泌素-17。
已知用于測定個體中胃粘膜狀況的多種方法和試劑盒。基于這樣的測量，有可能不需要個體在場就可以測定個體發生胃癌的風險。此種方法的實例在例如下列專利和專利申請中加以描述EP 804 737、EP 990 992、EP02716100、和本申請人的PCT/FI03/000653。
在這些方法中，通常從樣品中，諸如來自個體的血清或血漿樣品，測定至少下列分析物或標志物胃蛋白酶原I、胃泌素-17和幽門螺旋桿菌感染標志物，以及通常還有胃蛋白酶原II。
與所述測定方法和樣品處理相關的，由于胃泌素-17在樣品中迅速分解，胃泌素-17的穩定性差成為問題。三小時之后，血清樣品中胃泌素-17的濃度開始明顯下降，而且在冷藏條件下一天后，它完全降解。這與胃蛋白酶原I和II及幽門螺旋桿菌抗體相反，胃蛋白酶原I和II的活性在室溫能保持許多天，幽門螺旋桿菌抗體在冰箱條件下至少保持三天。
胃泌素-17先前作為所謂的冷樣品加以采集，即血清樣品的凝固在冰浴上進行。樣品的運送或分派(持續很多天)以冷凍的形式進行。
由于不僅是胃泌素型肽，同樣還有許多其它蛋白質和肽，包括激素和酶，其穩定性不令人滿意所帶來的問題，人們已經在努力尋找穩定這些敏感分析物的手段。對于令人滿意的穩定性以用于可令人接受的實驗室操作，最低要求是在室溫或環境溫度，和冰箱溫度下，即約+4℃至25℃的溫度范圍內，至少穩定三天。
發明概述依照本發明，現在已經發現二甲基亞砜(DMSO)是哺乳動物生物學樣品中，尤其是血清或血漿樣品中，蛋白質和肽，尤其是胃泌素和胃泌素相關肽的非常有效的穩定劑，為所述蛋白質和肽提供穩定效果，該穩定效果在環境溫度和冰箱溫度下都持續至少三天。
因此，本發明一方面涉及DMSO用于在哺乳動物生物學樣品，諸如血清或血漿樣品中穩定胃泌素和胃泌素相關肽免于降解或失活的用途。另一方面，本發明還涉及在哺乳動物生物學樣品，諸如血清或血漿樣品中穩定此類肽免于降解或失活的方法，依照此方法向含有所述待穩定肽的樣品中加入穩定量的DMSO。
發明詳述依照本發明使用的穩定劑是有機溶劑二甲基亞砜，DMSO；其已知用于多種工業、醫學和實驗室用途。DMSO的分子量是78.1，它與水互溶，熔點18.5℃，沸點189℃。它是造紙工業的副產品，其中它衍生自樹木中的粘合物質木質素。
在細胞培養中，在冷凍細胞時常規使用DMSO的10％溶液。在這種應用中，DMSO作為降低滲透損傷的保護劑，因為細胞對細胞內冰形成非常敏感。DMSO迅速穿透細胞膜并取代其中的水。因此，DMSO同樣迅速穿透皮膚，并能夠容易地將其中溶解的成分，諸如低分子成分，轉運過皮膚。為此，DMSO用作佐劑，以促進藥物分子吸收和轉運。還有報道說DMSO具有廣泛的藥理學應用，包括減輕疼痛和腫脹、松弛肌肉、抗炎和抑菌特性等。
依照本發明，DMSO設想用于穩定溫度敏感型肽，即胃泌素和胃泌素相關肽，其在生物學樣品中在幾天，諸如三天的一段時間里易受快速分解的影響，甚至當被保存于冷藏條件時。
本發明尤其可用于穩定胃泌素和胃泌素相關肽，諸如縮膽囊素和促胰液素，且尤其用于穩定胃泌素-17。本發明尤其適用于下述方法，如在用于篩選胃粘膜狀況的測試法中，其中胃泌素-17將與來自生物學樣品，諸如血清、血漿樣品的分析物胃蛋白酶原I和任選的胃蛋白酶原II，以及幽門螺旋桿菌的標志物一起測定。
在實驗過程中，證明了向此類樣品中加入DMSO對胃泌素發揮穩定效果，同時對待化驗的其它標志物沒有不良影響。
用于獲得穩定效果的DMSO的量可有所變化，但是通常是1-10％(體積/體積)的數量級，尤其是約4-6％(體積/體積)，根據待測樣品計算。
在本發明的內容中，與哺乳動物生物學樣品中的分析物肽相聯系的“溫度敏感的”，是指所述肽傾向于快速降解，尤其是在室溫或環境溫度下。依照本發明，將要被穩定的溫度敏感分析物，是指在室溫或環境溫度，通常是約+18至25℃的溫度范圍，保存時間少于三天(72小時)的分析物。
依照本發明，加入到待穩定的哺乳動物生物學樣品中的DMSO的量為分析物肽提供穩定性，所述穩定性為在上述溫度范圍至少三天(至少72小時)的穩定性。
實驗在研究過程中進行的實驗顯示，即使在室溫下，胃泌素-17在5％(體積/體積)DMSO/血清或血漿溶液中保持至少三天，所述研究是關于胃泌素-17在血漿和血清樣品中穩定性的研究。這可從下表中呈現的測試結果中看出來。
表1描述了通過向所述樣品中加入5％(體積/體積)DMSO，在長達三天的一段時間里，對三種EDTA-血漿樣品測試胃泌素-17穩定性的測試的結果。參照實施例未添加DMSO。結果顯示，與不含DMSO的樣品相比，含有DMSO的樣品中，三天后胃泌素-17的穩定性有所改善。
表2顯示了在室溫下向五種EDTA-血漿樣品中加入DMSO的穩定效果。測試了添加DMSO對胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II、幽門螺旋桿菌抗體和胃泌素-17的效果。顯示了第0天和第3天的結果。結果顯示，對胃蛋白酶原I和II以及幽門螺旋桿菌抗體的活性基本上沒有影響，而與獲自未添加DMSO的樣品的結果相比，觀察到胃泌素-17的穩定性有所改善。
表3是對應于表2中的測試的測試，只是其中所要測試的十種樣品是血清樣品，而不是血漿樣品。結果顯示添加5％(體積/體積)DMSO的樣品中胃泌素-17普遍保留活性。結果還顯示DMSO對胃蛋白酶原和幽門螺旋桿菌抗體的活性沒有有害作用。
表4顯示了樣品的穩定性測試結果，其中分析物是U-INTP(膠原I氨基末端端肽)。該表顯示了室溫下，即刻(“即刻”)、以及三天后，不添加和添加穩定劑的結果，也用百分比表示。每份樣品進行兩次平行測試。
表1
表2
表3
表權利要求
1.DMSO用于在哺乳動物生物學樣品中穩定胃泌素和胃泌素相關肽免于降解的用途。
2.依照權利要求1的用途，其中所述樣品是血清或血漿樣品。
3.依照權利要求1或2的用途，用于穩定胃泌素-17。
4.用于在哺乳動物生物學樣品中穩定胃泌素和胃泌素相關肽免于降解的方法，依照所述方法將穩定量的DMSO加入所述樣品。
5.依照權利要求4的方法，其中所述樣品是血清或血漿樣品。
6.依照權利要求4或5的方法，用于穩定胃泌素-17。
7.依照權利要求6的方法，其中在含有選自胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽門螺旋桿菌抗體的一種或多種分析物的血清或血漿樣品中測定胃泌素-17。
全文摘要
本發明涉及DMSO用于在哺乳動物生物學樣品，諸如血清或血漿樣品中穩定溫度敏感型肽，即胃泌素和胃泌素相關肽，免于降解的用途。
文檔編號G01N33/68GK1950398SQ200580014974
公開日2007年4月18日 申請日期2005年5月9日 優先權日2004年5月10日
發明者奧斯摩·索瓦尼米, 奧利·林納拉 申請人:拜奧希特公司