癌癥調節抗體的制作方法

專利名稱：癌癥調節抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及癌癥的診斷和治療，特別涉及腫瘤細胞的細胞毒性介導。本發明尤其涉及癌癥調節抗體(CDMAB)的應用，任選的與一種或多種化學治療劑聯合使用，作為啟動細胞毒素反應的方法。本發明進一步涉及利用本發明的CDMAB的結合測定(bindingassays)。
背景技術：
抗人類白血球的單克隆抗體的培養導致了CD44抗原的發現；單鏈透明脂酸(HA)結合糖蛋白表達于多種正常組織和所有類型的造血細胞上。CD44最初與淋巴細胞活化和尋靶過程有關，目前，其推定的生理作用還包括激活炎癥反應基因，調節細胞循環，誘導細胞繁殖，誘導分化和發育，誘導細胞支架重組、細胞遷移和細胞存活/抵抗細胞凋亡。
人體中，CD44的單基因拷貝位于11號染色體短臂上，11p13。該基因包含19個外顯子；前5個是恒定的，接下來的9個是可變的，隨后3個是恒定的，最后2個是可變的。差別剪接能夠導致1000種不同的亞型。然而，目前只鑒定出幾十個自然發生的變型。
CD44標準糖蛋白的組成為一個N末端細胞外(包括一個20個氨基酸的前導序列和一個膜近側區(85個氨基酸))域(270個氨基酸)、一個跨膜區(21個氨基酸)和胞質尾區(72個氨基酸)。細胞外區域還包括一個位于N末端的連接模塊。該區域長度為92個氨基酸并表現出與其他HA結合連接蛋白的同源性。鼠和人的CD44具有高度同源性。該蛋白的變型被插入外顯子5的碳末端，并且在表達時被細胞外定位。CD44的漿液可溶形式也是自然形成的，可以起源于終止密碼子(在可變區內)或蛋白水解活性。各種刺激物(包括TNF-α)下的細胞活化導致了CD44受體的脫落。受體脫落也可以在腫瘤細胞中發現，并能夠導致人體血清中CD44濃度升高至10倍。高濃度的CD44血清表明了惡性腫瘤(卵巢癌除外)。
以標準形式出現的CD44的分子量大約為37kD。翻譯后的修飾使其分子量增至80-90kD。這些修飾包括細胞外域氨基末端在天冬酰胺殘基上的N聯糖基化、細胞外域碳末端在絲氨酸/蘇氨酸殘基上的氧糖基化和氨基葡聚糖加成。剪接變型的大小為80-250kD。
HA，一種位于哺乳動物體內細胞外基質(ECM)上的多糖，被認為是主要的CD44配基。但是，也已經發現CD44與膠原、纖維結合素和層粘連蛋白等這類蛋白結合。HA結合與糖基化之間表現出某種相互關系。失活的CD44(不結合HA)具有最高的糖基化水平，活性CD44(結合了HA)的糖基化水平最低，而可誘導的CD44(不結合或弱結合HA，除非被細胞因子、單克隆抗體、生長因子等激活)的糖基化水平介于活性形式和非活性形式之間。
CD44能夠通過依賴于細胞、刺激物和環境之間相互作用的信號傳導途徑來調節其某些功能。這些途徑包括NFKB信號級聯(涉及炎癥反應)、Ras-MAPK信號傳導途徑(涉及激活細胞循環和增殖)、Rho蛋白族(涉及細胞骨架重組和細胞遷移)和PI3-K相關信號傳導途徑(涉及細胞存活)。所有上述功能與疾病發生和發展密切關聯。CD44還涉及通過各種其他機制在癌癥中起作用。這些機制包括生長因子、化學增活素和細胞因子被CD44細胞表面上的細胞表面蛋白聚糖展示給惡性腫瘤中涉及的受體。同時，CD44-HA復合物內陷入細胞后由溶酶體酶引起的HA細胞內降解有可能提高腫瘤侵襲力和ECM誘導的血管生成。另外，已經表明存活信號或凋亡信號的傳導是通過標準或可變的CD44受體而發生。CD44還涉及細胞分化和遷移。這些機制中很多(如果不是全部)是環境和細胞依賴性的，有幾種機制產生了可變的結果。因此，在得出結論前需要更多的研究。為了驗證CD44在癌癥中的潛在功能作用，研究了CD44的表達，來確定受體的差異表達是否與疾病進展相關聯。但是，在多數腫瘤類型中出現了不一致的結果，這可能歸因于研究者之間在試劑組合、技術、病理狀況和細胞類型方面的差異。腎細胞癌和非何杰金淋巴瘤是例外，因為CD44高表達的腫瘤患者的存活時間始終比那些CD44低表達或不表達的患有同樣腫瘤的患者要短。
由于與癌癥相關，CD44已經成為抗癌治療研發的目標。依然存在爭議的是腫瘤發展中需要的是標準形式的CD44還是變異形式的CD44。兩種觀點都有體內動物實驗數據的支持，這可能還是取決于腫瘤類型、甚至細胞類型。不同的治療方法包括了可溶性CD44蛋白注射液、透明質烷合成酶cDNA、透明脂酸酶、CD44反義和CD44特異性抗體的應用。每種方法已經達到了某種程度的成功，從而為抗CD44癌癥治療提供了支持。
變異的和標準的CD44特異性單克隆抗體都已經通過實驗生成，但是對大部分而言都沒有內在的生物學活性，盡管它們特異性的與所識別的CD44類型結合。然而，有一些單克隆抗體具有體內活性或體外活性，但一般不是同時具有體內和體外活性。幾種抗CD44抗體已經表現出介導細胞性活動。例如，已經表明靶向抵抗人類紅細胞Lutheran抗原CD44標準形式的鼠抗體A3D8能提高CD2(9-1抗體)和CD3(OKT3抗體)介導的T細胞活化作用；另外一個抗CD44抗體具有類似效果。A3D8還誘導了IL-1從單核細胞的釋放和IL-2從T淋巴細胞的釋放。有趣的是，A3D8與諸如柔紅霉素(daunorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、依托泊甙(etoposide)等藥物聯合使用，通過阻斷第二信使神經酰胺的生成而抑制了HL60和NB4AML細胞中細胞凋亡的誘導。J173抗體沒有內在活性并定向抵抗類似的CD44表位，它沒有抑制藥物誘導的細胞凋亡。HIH44-1抗體，定向抵抗85-110kD和200kD形式的CD44，增強了T細胞的繁殖，筆者推測其途徑是CD44的交聯或聚集。總之，沒有證據表明這類抗體適合于癌癥治療的使用，因為它們不是定向抵抗癌癥(如激活淋巴細胞)、誘導細胞繁殖，在與細胞毒劑聯合使用時也沒有抑制藥物誘導的腫瘤細胞死亡。
幾種抗CD44抗體已經被報道具有體內抗腫瘤作用。抗體1.1ASML，一種導向CD44的v6變型的鼠IgG1，已經顯示出減少淋巴結和鼠胰腺癌的肺轉移。受治動物的存活率隨之提高。該抗體只有在淋巴結聚集前給入才是有效的，其假設原理是干擾淋巴結中的細胞繁殖。在體內，抗體對腫瘤細胞沒有直接的細胞毒性，也沒有提高補體介導的細胞毒作用或免疫效應細胞的功能。該抗體抵抗人類細胞的效用沒有被描述。
Breyer等人描述了一種可商業獲得的抗體用于CD44s，以破壞常位移植的鼠惡性膠質瘤的發展。鼠惡性膠質瘤細胞系C6被移植入鼠的額葉中，一周后，通過腦內注射用抗體對這些鼠進行3次治療。經治療的鼠表現出降低的腫瘤生長，并且體重比采用緩沖液或同種型對照治療的鼠更高。該抗體能夠在體外抑制細胞對涂有細胞外基質成分的蓋玻片的粘附，但是對細胞沒有任何直接的細胞毒作用。該抗體沒有被測試抵抗人類細胞。
一項研究比較了抗體對CD44s(IM-7.8.1)的效力和抗體對CD44v10(K926)的效力。同時表達上述兩種CD44亞型的高度轉移的鼠黑素瘤細胞系B16F10被靜脈注入小鼠。2天后，每3天給入一次抗體并持續整個研究過程。兩種抗體都使肺轉移數目顯著下降50％以上；兩種抗體的效力沒有顯著差異。抗體沒有影響體內增殖，筆者Zawadzki等人推測其腫瘤生長的抑制作用歸因于抗體阻斷了CD44與其配基的相互作用。在使用IM-7.8.1的另外一項研究中，Zahalka證明了抗體極其F(ab′)2片斷能夠阻斷通過鼠T細胞淋巴瘤LB的淋巴結侵潤。這給小鼠帶來了顯著的存活受益。Wallach-Dayan表明了CD44v4-v10對LB-TRs鼠淋巴瘤的轉染(不同時生成腫瘤)賦予了生成腫瘤的能力。與同種型對照抗體相比，IM-7.8.1的注入降低了植入感染細胞的腫瘤大小。這些研究中沒有一個證明了這種抗體的人類效用。
GK W.A3，一種鼠IgG2a，對人類CD44有特異性并防止了人類黑素瘤移植物在SCID小鼠中的生成和轉移。該抗體與轉移的人類細胞系SMMU-2混合后靜脈注入小鼠。治療持續接下來的3周。4周后，10只小鼠中只有一只在注射部位生成了腫瘤，而未經過治療的小鼠全部生成腫瘤。抗體的F(ab′)2片斷表現出同樣的腫瘤生成的一支作用，表明該作用機制不依賴于補體或抗體依賴性的細胞毒作用。如果腫瘤細胞在首次注射抗體前1周注入，80％的動物在原發部位生成了腫瘤。但是，存活時間還是有顯著提高。盡管抗體的延遲注入對原發性腫瘤的生成沒有作用，但是其完全預防了病灶向肺、腎、腎上腺、肝和腹膜的轉移，這些轉移出現在未治療的動物中。這種抗體對體外細胞系沒有任何直接的細胞毒性或者它干擾了SMMU-2細胞的繁殖，并通過影響轉移或生長而顯示出對腫瘤生成的主要作用。這種抗體的一個顯著特征是其識別了所有的CD44亞型，這表明其在治療應用上有限的可能性。
Strobel等人描述了在一個鼠異種移植模型中，使用一種抗CD44抗體(克隆515)來抑制人類卵巢癌細胞的腹膜移植。在存在有抗CD44抗體或對照抗體的情況下，將人類卵巢細胞系36M2被腹膜植入小鼠中，然后在接下來的20多天進行治療。5周后，抗體治療組腹腔內的根瘤明顯較少。抗CD44和對照組的根瘤大小相同，表明一旦細胞被植入，抗體對腫瘤的生長沒有作用。當細胞經皮下注射時，對腫瘤細胞還是沒有作用，表明抗體本身沒有抗增殖活性或細胞毒作用。另外，該抗體在體外對細胞生長沒有作用。VFF-18，也被命名為BIWA 1，是一種對CD44的v6變型具有高度親和力的抗體，對多肽的360-370區域有特異性。這種抗體已經以99mTechnetium標記的結合物形式用于12例患者的臨床實驗。檢測了該抗體在頭頸部鱗狀細胞癌患者中的安全性和靶向能力。注射后40小時，14％的注入劑量被腫瘤攝取，在其他組織(包括腎、脾和骨髓)中有最小的聚集。盡管該抗體的高度選擇性的腫瘤結合顯示了其在放射免疫治療中的作用，但是其極高的親和力阻礙了該抗體更深層侵入腫瘤。BIWA 1應用的其他限制是鼠抗體的免疫原性(12例患者中有11例出現了人體抗鼠抗體(HAMA))、遍及腫瘤的異源性聚集和抗體可溶性CD44復合物的生成。WO 02/094879公開了一種人源化的VFF-18，目的是克服HAMA反應，被命名為BIWA4。發現BIWA4的抗原結合力顯著低于其親代VFF 18抗體。令人驚奇的是，低親和力的BIWA 4抗體比高親和力的BIWA 8人源化VFF-18抗體具有更好的腫瘤攝取特性。
在有33例患者的I期臨床實驗中評價了99raTechnetium標記和186Rhenium標記的BIWA 4抗體，來測定關于186Re標記的BIWA 4的安全性、耐受性、腫瘤聚集和最大耐受劑量。其中顯示了99mTc標記的BIWA 4的腫瘤相關攝取。所有劑量的186Re標記的BIWA 4都沒有觀察到腫瘤反應，雖然有一例病情穩定；劑量限制型細胞毒性發生于60mCi/m2。副反應率為50-65％，33例患者中有12例被認為具有嚴重的副反應(血小板減少、白細胞減少和發熱)，其中6例(都是使用186Re標記的BIWA 4進行治療)由于病情惡化而在治療中或治療后死亡。兩例患者出現了人抗人抗體(HAHA)。在20例患者中進行了186Re標記的BIWA 4的I期劑量倍增實驗。觀察到口腔粘膜炎和劑量限制型血小板減少癥和白細胞減少癥；一例患者出現了HAHA反應。以最高劑量60mCi/m2治療的5例患者病情穩定。盡管安全性和耐受性相對于所獲得的效力而言被認為是可以接受的，但是這些研究比其他臨床研究中非放射性同位素生物治療具有更高的副反應率。美國專利申請US 2003/0103985公開了一種結合了美登醇的人源化VFF-18，被命名為BIWI 1，用于腫瘤治療。在人類陰戶表皮樣癌、磷狀細胞癌或乳腺癌的鼠模型中發現，人源化抗體(BIWA 4)與毒素結合時，即BIWA 1，具有顯著的抗腫瘤作用。未結合形式(BIWA 4)沒有抗腫瘤作用，而結合形式(BIWI 1)沒有人體安全性或有效性的證據。
Mab U36是鼠單克隆IgG1抗體，產生于UM-SCC-22B人咽喉癌細胞免疫和腫瘤及組織特異性選擇。通過cDNA克隆和序列分析的抗原鑒定，將角質化細胞特異性CD44剪接變型epican的v6結構域確定為Mab U36的靶點。免疫組織化學研究表明抗原表位嚴格限制于細胞表面。另外，Mab U36強烈標記了94％的頭頸部磷狀細胞癌(HNSCC)，在這些腫瘤中的細胞染色均一。10例患者的99mTc標記Mab U36研究表明抗體選擇性富集于HNSCC腫瘤(20.4+/-12.4％注射劑量/kg，2天)；沒有副反應報告，但是兩例患者出現了HAMA。在放射性碘化的鼠Mab U36研究中，18例患者中有3例HAMA和HNSCC中的選擇性同源攝取。為降低Mab U36的抗原性和HAMA發生率而構建了一種雜合抗體。不論是雜合的還是原始的鼠Mab U36都沒有ADCC活性。沒有關于Mab U36天然功能活性的證據。186Re標記的雜合Mab U36被用于檢測Mab U36作為治療劑的效力。在這個I期劑量倍增實驗中，13例患者接受了試驗劑量的99mTc標記的雜合Mab U36，隨后是186Re標記的雜合Mab U36。沒有報告強烈的副反應，除了后續治療中觀察到劑量限制型骨髓毒性(1.5GBq/m2)存在于3例患者中的2例，以及一例患者在接受最大耐受劑量(1.0GBq/m2)治療時的血小板減少。盡管對腫瘤大小有一些作用，但這些作用沒有達到治療目的的反應標準。另一項186Re標記的雜合Mab U36的研究采用了一種策略，使用粒細胞集落刺激因子刺激的全血再輸入來使最大耐受活性倍增至2.8Gy。在這項研究中，9例患有不同的頭頸部腫瘤患者中有3例由于藥物相關性貧血而需要輸血。其他細胞毒包括3級骨髓中毒和2級粘膜炎。沒有報道目標腫瘤反應，盡管5例患者獲得了3-5個月的病情穩定。因此，可以發現，盡管Mab U36是高度特異性抗體，但是需要放射性免疫復合物來獲得抗癌效果，這個缺點限制了其效用，因為在獲得臨床效果的相關治療伴隨著細胞毒。
總結，在注入了轉移性胰腺癌的鼠或注入了惡性黑素瘤的小鼠中，CD44v6(1.1ASML)和CD44vlO(K926)單克隆抗體降低了轉移活性。另一個抗CD44v6抗體(VFF-18及其衍生物)，只有與美登醇或放射性同位素結合時才具有抗腫瘤作用。抗標準CD44單克隆抗體還抑制鼠惡性膠質瘤的腦內病變(抗CD44s)、鼠T細胞淋巴瘤的淋巴結侵入(IM-7.8.1)，以及抑制人卵巢癌細胞系在裸鼠中的移植(clone515)、鼠黑素瘤細胞系的肺轉移(IM-7.8.1)和人黑素瘤細胞系在SCID小鼠中的轉移(GKW.A3)。放射性同位素結合的Mab U36抗CD44v6抗體及其衍生物在臨床實驗中具有抗腫瘤活性，并伴隨著顯著的毒性。盡管這些結果鼓勵和支持了抗CD44單克隆抗體作為潛在的腫瘤治療劑的發展，但也說明了其對人類腫瘤有效性、安全性或應用性的限制。
因此，如果分離到一種介導癌細胞細胞毒的抗體組合物，由于其吸引CD44在所述細胞表面表達的功能，將實現一種有價值的診斷和治療過程。
現有專利美國專利5750102公開了一種方法，其中用MHC基因轉染患者腫瘤細胞，MHC基因可以從患者的組織或細胞中克隆。然后將這些經轉染的細胞用于接種患者。
美國專利4861581公開了一種方法，該方法包括如下步驟獲得單克隆抗體，該抗體對哺乳動物的腫瘤細胞及正常細胞的內部細胞成分有特異性而對外部成分沒有特異性；標記單克隆抗體；將標記抗體與已經接受過腫瘤細胞殺滅治療的哺乳動物組織接觸；以及通過測定標記抗體與退化腫瘤細胞內部細胞成分的結合來確定治療的效果。在制備導向人類細胞內抗原的抗體的過程中，專利權人認識到癌細胞是這類抗原的一個方便來源。
美國專利5171665提供了一種新型抗體和該抗體的生產方法。具體的，該專利說明了單克隆抗體的制備，所述單克隆抗體具有與人類腫瘤相關蛋白抗原(如結腸和肺的)牢固結合的性質，而與正常細胞的結合程度要小得多。
美國專利5484596提供了一種癌癥的治療方法，該方法包括手術去除癌癥患者的腫瘤組織；處理腫瘤組織以獲得腫瘤細胞；照射腫瘤細胞，使其存活但沒有致瘤性質；以及用這些細胞為患者制備疫苗，該疫苗能夠抑制原發性腫瘤的復發并同時抑制病灶轉移。該專利公開了與腫瘤細胞表面抗原具有反應性的單克隆抗體的研制。如第4欄第45行等處說明，專利權人在對人類腫瘤具有活性特異的免疫治療的單克隆抗體研發過程中，利用了自體腫瘤細胞。
美國專利5693763說明了人類癌細胞的糖蛋白抗原特性不依賴于原發的上皮組織。
美國專利5783186說明了誘導Her2表達細胞凋亡的抗Her2抗體，產生抗體的雜交瘤細胞系，使用抗體和含有所述抗體的藥物組合物治療癌癥的方法。
美國專利5849876描述了用于生產單克隆抗體的新型雜交瘤細胞系，所述抗體針對從腫瘤和非腫瘤組織來源中提純的粘蛋白抗原。
美國專利5869268公開了生成人體淋巴細胞的方法，該淋巴細胞產生對目標抗原具有特異性的抗體，同時公開了一種生產單克隆抗體的方法及由該方法生產的單克隆抗體。該專利特別公開了用于診斷和治療癌癥的抗HD人類單克隆抗體的生產。
美國專利5869045涉及和人體癌細胞反應的抗體、抗體片段、抗體偶聯物和單鏈免疫毒素。這些抗體的功能機理是雙重的，因為這些抗體一方面與展示在人體癌細胞表面的膜抗原具有反應性，另外這些抗體還能夠陷入癌細胞，隨后結合，使它們特別用于形成抗體-藥物和抗體-毒素結合物。以未修飾形式出現的抗體在特定濃度下也表現出細胞毒性質。
美國專利5780033公開了自體抗體用于腫瘤治療和預防。不過，該抗體是從成年哺乳動物中得到的抗細胞核自體抗體。這里，自體抗體是指在免疫系統中發現的一種天然抗體。因為自體抗體來源于“成年哺乳動物”，因此就不要求自體抗體真正來源于受治患者。此外，該專利公開了來自成年哺乳動物的天然的單克隆抗細胞核自體抗體以及生成單克隆抗細胞核自體抗體的雜交瘤細胞系。
美國專利5916561公開了一種特異性抗體，VFF-18及其CD44定向抵抗CD44基因的變異外顯子v6的變型。這種抗體是對比較抗體(comparator antibody)的改進，因為它識別的是人CD44v6變型，而不是鼠CD44v6變型。另外，該抗體公開了CD44v6表達的診斷實驗。沒有公開該抗體的體外或體內功能。
美國專利5616468公開了一種單克隆抗體Var3.1，抵抗一種含有人類CD44基因的外顯子6A編碼序列的合成肽。特別是這種抗體不與人CD44的90kD型結合，并區別于Hermes-3抗體。提供了一種檢測CD44的v6變型的方法，以及篩查和檢測基于該抗原的惡性轉化的方法。同時還提供了一種基于檢測血漿中抗原的炎性疾病篩查方法。
美國專利5879898公開了一種結合于人CD44變型6的129bp外顯子的特異性抗體，所述變型生成含有43個氨基酸的肽。該單克隆抗體由許多雜交瘤細胞系生成MAK<CD44>M-1.1.12，MAK<CD44>M-2.42.3，MAK<CD44>M-4.3.16。該抗體產生于一種融合蛋白，該融合蛋白至少含有一種新型CD44v6氨基酸序列的六肽。另外，還公開了一種檢測能夠用于癌癥診斷的變型6外顯子的免疫測定法。重要的是，沒有公開該抗體在體外或體內的功能。
美國專利5942417公開了一種編碼CD44樣多肽的多聚核苷酸，以及使用該多聚核苷酸及其變型來生成重組蛋白的方法。這些多肽抗體被要求保護，但是沒有具體實施例，也沒有分泌這種抗體的保藏克隆。Northern雜交證明該多聚核苷酸出現于幾種組織中，但是沒有其他關于該多聚核苷酸翻譯和表達的附加證據。因此，沒有這樣的證據生成了針對該多聚核苷酸基因產品的抗體，這些抗體具有體外或體內功能，以及它們是否與人類腫瘤疾病相關。
美國專利5885575公開了一種與CD44變型表位反應的抗體，以及通過使用該抗體來識別變型的方法。編碼這種變型的分離的多聚核苷酸是從鼠細胞分離的，靶向抵抗這種變型的抗體(mAbl.IASML)識別分子量為120kD、150kD、180kD和200kD的蛋白質。單克隆抗體1.1ASML的給入延緩了鼠BSp73ASML在同源鼠中的生長和轉移。重要的是，1.1ASML缺乏對LCLC97人類大細胞肺癌的活性而證明它不識別人類腫瘤。一種人類同系物從LCLC97分離出來，但是沒有生成識別這種同系物的相應抗體。因此，盡管一種特異性結合鼠CD44變型的抗體被生成并表現出對鼠腫瘤生長和轉移的作用，但是沒有該抗體抵抗人類腫瘤的證據。尤其是發明人指出這種抗體不識別人類腫瘤。

發明內容
本發明的發明人之前已經被授予發明名稱為“個體化患者特異抗癌抗體”的美國專利6180357，關于一種用于治療癌癥的個體化篩選個性化抗癌抗體的方法。基于本文目的，術語“抗體”和“單克隆抗體”(mAb)可以互換使用，是指雜交瘤(如鼠或人)生成的完整的免疫球蛋白、免疫交聯物，以及從所述免疫球蛋白衍生的適當的免疫球蛋白片斷和重組蛋白，如雜合的和人源化的免疫球蛋白、F(ab′)和F(ab′)2片斷、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(Fv)s、融合蛋白等。現有技術公認有一些氨基酸序列在多肽中是可變的，并對蛋白質結構或功能沒有顯著影響。在抗體的分子重排中，骨架區的核苷酸或氨基酸序列變化通常是可以接受的，這些變化包括(但不限于)置換(優選為保守置換)、缺失或增加。另外，本發明還包括將本發明的CDMAB和標準的化學治療藥征(如放射性核素)結合起來，從而集中了所述化療的作用。CDMAB還能與毒素、細胞毒殘基、酶(生物素結合酶)或造血細胞結合，藉此形成抗體交聯物。
本發明實質上利用了美國專利6180357中說明的生產患者特異性抗癌抗體的方法，用以分離編碼癌癥調解單克隆抗體的雜交瘤細胞系。可以為一種腫瘤而專門制備這些抗體，從而使癌癥的個性化治療成為可能。在本發明公開的內容中，具有殺滅細胞(細胞毒素的)或抑制細胞生長(細胞生長抑制的)性能的抗癌抗體將在下文中被稱為細胞毒。這些抗體能夠用于幫助癌癥分期和診斷，也可用于治療腫瘤轉移和原發性腫瘤。
個性化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來變化。一種可能的臨床情境是在一種腫瘤出現時就取樣并入庫。通過該樣品，能夠通過已有的癌癥調節抗體庫對該腫瘤進行分類。患者將被常規分期，但可用的抗體可以對患者進一步分期。可以用已有的抗體立即對患者進行治療，和/或腫瘤特異性抗體庫可以使用本發明公開的方法或者使用噬菌體展示庫并結合本發明公開的篩選方法來生成。生成的所有抗體將被添加入抗癌抗體庫，因為其它的腫瘤細胞可能具有與被治療的腫瘤相同的抗原表位。根據本方法生成的抗體可以用于治療任何數量的、患有與這些抗體結合的癌癥的患者。
基本使用美國專利6180357的方法，用患者肺腫瘤活組織檢查的細胞來免疫小鼠后獲得鼠單克隆抗體H460-16-2。H460-16-2在不同組織源的廣泛的人類細胞系的細胞表面表達。乳腺癌細胞系MDA-MB-231(MB-231)和皮膚癌細胞系A2058對H460-16-2的體內細胞毒作用敏感。
當被植入小鼠體內后(如S.N.10/603,000所公開)，H460-16-2在培養液中對MB-231細胞的細胞毒作用被其抗癌活性進一步向癌細胞擴展。臨床前的異種移植腫瘤模型被認為是治療效力的有效預測器。
在人類乳腺癌預防性體內模型中，H460-16-2治療在抑制治療期間腫瘤生長方面比同種型對照抗體(與H460-16-2結構和大小相同，但不能與MB-231細胞結合)明顯更加有效(P＜0.0001)。在治療末期，給入H460-16-2的小鼠的腫瘤增長只有對照組的1.3％。在治療后的隨訪階段，H460-16-2的治療效果繼續維持，治療組的平均腫瘤體積繼續顯著小于對照組，直到檢測期末。使用存活率作為抗體效能的量度，在H460-16-2治療后70天，估計治療組的死亡風險約是抗體緩沖液對照組的71％(p＝0.028)。這些數據證明H460-16-2治療相對于對照治療組帶來了存活受益。H460-16-2治療表現安全，因為它沒有任何毒性征兆，包括體重下降和臨床不良應激。因此，H460-16-2治療是有效的，因為與對照治療組相比，它在人乳腺癌的成熟模型中延緩了腫瘤生長并提高了存活率。
另外，H460-16-2在構建的體內腫瘤模型中表現出對MB-231細胞的抗腫瘤活性(如S.N.10/603,000中所描述的)。將H460-16-2治療與標準的化學療劑順鉑(Cisplatin)進行比較，結果顯示順鉑和H460-16-2治療組的平均腫瘤體積明顯小于抗體稀釋緩沖液或同種型對照抗體治療組(p＜0.001)。H460-16-2治療介導的腫瘤抑制作用約是順鉑化療的2/3，但是沒有順鉑治療中發現的明顯(19.2％)體重下降(p＜0.003)和臨床不良應激，包括兩例治療相關死亡。H460-16-2的抗腫瘤活性及其最低限度的毒性使它成為一種具有吸引力的抗癌治療劑。在治療后的階段，H460-16-2表現出顯著的存活受益(p＜0.02)，因為在治療后70天以后，H460-16-2治療組的死亡風險約為同種型抗體對照組的一半。觀察到的存活受益持續了治療后120天，其中同種型對照和順鉑治療的小鼠全部死亡，而H460-16-2治療組的死亡率為67％。H460-16-2通過延緩腫瘤生長而維持了腫瘤抑制作用，比同種型對照延緩26％。治療后31天，H460-16-2通過減少腫瘤生長而限制了腫瘤大小，比同種型對照減少48％，在治療結束時觀察到相當于49％的減少。在已有的乳腺癌腫瘤模型中，這些結果表明H460-16-2維持腫瘤抑制的能力超出了治療階段，并證明了該抗體在哺乳動物中減少腫瘤負荷和提高存活率的能力。
除了在乳腺癌的體內腫瘤模型中的有益效果外，H460-16-2治療與化療藥物的聯合使用在前列腺癌體內模型中具有對PC-3細胞的抗腫瘤活性。使用配對T檢驗，H460-16-2加順鉑治療在治療后短期抑制腫瘤生長方面比緩沖液對照(p＜0.0001)、順鉑單獨治療(p＝0.004)或H460-16-2單獨治療(p＜0.0001)明顯的更加有效。在治療末期，給入H460-16-2加順鉑的小鼠的腫瘤增長只有緩沖液對照組的28.5。對于PC-3SCID異種移植模型來說，體重能夠作為疾病進展的替代指標。所有組的小鼠都經歷了嚴重的體重下降。在這項研究中，所有組的小鼠在治療結束時的體重下降約為23-35％。H460-16-2治療組表現出最低程度的體重下降(21.7％)。治療后48天，與緩沖液對照組p＝0.5042)相比，H460-16-2和順鉑治療組的體重下降沒有顯著增加。因此，H460-16-2加順鉑治療是有效的，因為與人類前列腺癌模型中同種型對照治療組相比，該治療延緩了腫瘤生長。
為了驗證H460-16-2抗原表位作為藥物靶點，首先檢測了H460-16-2抗原在正常人組織中的表達(S.N.10/603,000)。這項工作通過與抗CD44抗體；L178克隆(S.N.10/647,818)和BU75克隆(本文)的比較得到了擴展。通過H460-16-2的IHC染色，多數組織未能表達H460-16-2抗原，包括重要器官的細胞，如肝、腎(除了管狀上皮細胞的邊緣染色(marginal staining))、心和肺。組織染色結果表明H460-16-2與多種細胞類型的結合限制，但是與侵潤巨噬細胞、淋巴細胞和成纖維細胞具有結合力。BU75抗體顯示了類似的染色模式。但至少有一種公知的差別BU75與淋巴細胞的染色強度比H460-16-2更大。
在評價H460-16-2的治療應用和設計有效臨床實驗中，H460-16-2抗原的定位以及確定它在人群中(如在乳腺癌患者中)的傳播是非常重要的。為定位H460-16-2抗原在癌癥患者的乳腺腫瘤中的表達，首先在50例個體乳腺癌患者的腫瘤組織樣品中篩查了H460-16-2抗原的表達(S.N.10/603,000)，并與L178進行了比較(S.N.10/647,818)。本項工作比較了H460-16-2對BU75和抗Her2抗體c-erbB-2的染色。本項研究的結果與之前的結果類似，62％的組織樣品對H460-16-2抗原染色陽性，而73％的乳腺腫瘤組織對BU75抗原表位是陽性。患者樣品中的H460-16-2表達顯示出對腫瘤細胞的特異性，因為染色被限制于癌細胞。乳腺癌患者正常組織的10個樣品中有4個被H460-16-2染色，而有8個被BU75染色。乳腺腫瘤的H460-16-2和BU75抗原表達主要位于腫瘤細胞的細胞膜，這使CD44成為有吸引力的治療靶點。在乳腺腫瘤的荷爾蒙雌激素和黃體酮受體表達基礎上進一步評價了H460-16-2表達，所述受體在乳腺癌的發展、治療和預測方面發揮重要作用。H460-16-2抗原表達和雌激素受體或黃體酮受體表達之間沒有明顯的關聯。在腫瘤分期或進展程度的基礎上對腫瘤進行分析，也沒有發現H460-16-2抗原表達和雌激素受體或黃體酮受體表達之間的明顯關聯。BU75獲得了同樣的結果。與c-erbB-2比較，H460-16-2顯示了完全不同的染色結果，其中52％的乳腺腫瘤組織樣品對H460-16-2抗原是陽性而對Her2表達是陰性，這意味著依然不滿足乳腺癌患者的靶向治療需求。而對H460-16-2和Her2都呈陽性的乳腺腫瘤組織切片之間的染色強度也存在差別。c-erbB-2抗體也陽性染色一種正常乳腺組織切片。為了進一步擴展H460-16-2潛在的治療受益，事先檢測了抗原在多種人類腫瘤組織中的頻率和定位，并與克隆L178進行了比較(S.N.10/647,818)。這些腫瘤類型的多數也是對L178抗原呈陽性。對于人類乳腺腫瘤組織，H460-16-2和L178的定位發生在腫瘤細胞膜上。然而，L178比H460-16-2抗體具有顯著多的細胞膜定位。而且，對于同時被H460-16-2和L178染色的腫瘤類型，43％的組織顯示出對L178抗體更高強度的染色水平。
通過與文獻中IHC數據的比較，表明沒有正確匹配本文提供的IHC數據的CD44型。CD44標準型正常表達于人腦，而H460-16-2抗原不是。直接抵抗pan-CD44亞型的抗體對肝(包括Kupper細胞)不染色，對處于生殖周期所有階段的子宮內膜腺體染色結果為陽性。H460-16-2抗原清楚展示于Kupper細胞上，并只展示于生殖周期中的分泌性子宮內膜腺體上。H460-16-2抗原清楚展示于組織巨噬細胞上，并且只有V4/5和V8/9變型表現出偶然的巨噬細胞染色。與抗CD44L178和現在的BU75相比，H460-16-2具有相似而又特殊的結合模式，這表明H460-16-2抗原是獨特的CD44抗原表位。
正如以前所描述的(S.N.10/647,818)，附加的生化數據也表明H460-16-2識別的抗原是CD44的一種亞型。這一點得到了其他研究的支持，所述研究表明對CD44有反應活性的單克隆抗體(L178)識別那些通過免疫沉淀與H460-16-2結合的蛋白質。Western雜交研究也表明了H460-16-2識別的CD44表位抗原不展示在v6或v10上。H460-16-2抗原表位還在于它是碳水化合物以及構象依賴的，而許多抗CD44抗體是直接抵抗CD44肽部分的。這些IHC和生化結果證明了H460-16-2結合于CD44抗原變型。因此，優勢證據表明了H460-16-2通過展示于CD44變型上的獨特的碳水化合物依賴性構象表位的連接作用來介導抗癌作用。基于本發明的目的，所述表位被定義為“CD44抗原性殘基”，其特征是它與雜交瘤細胞系編碼的單克隆抗體及其抗原結合片斷或抗體交聯物的結合能力。
為進一步說明H460-16-2的抗癌作用機制，進行了透明質酸(HA)結合實驗。經測定，要產生MDA-MB-231細胞對HA的50％的粘附力，需要H460-16-2的平均濃度為1.87(+/-1.01)μg/mL。這些結果表明H460-16-2與CD44上負責結合HA的區域相互作用(至少部分作用)，因此可以說明其抗癌作用，通過ECM途徑的血管生成或腫瘤侵襲力的下調。除了HA結合實驗之外，進行了細胞周期實驗來確定H460-16-2在體內或體外抗癌作用是否歸因于細胞循環的調節。20μg/mL的H460-16-2，24小時，MDA-MB-231凋亡細胞的數量比同種型對照增加了。這一作用也表現出劑量依賴性。因此，H460-16-2的效力也全部或部分歸因于其凋亡誘導能力。
總體上，本文證明了H460-16-2抗原是癌癥相關抗原，表達于人類，并且是病理學相關的癌癥靶點。而且，本文也證明了H460-16-2抗體對人類腫瘤組織的結合，并能適當用于診斷實驗、預防性治療或預測。另外，該抗原的細胞膜定位指示了細胞的癌癥狀態，因為該抗原在多數非癌細胞中缺少表達，而且這一發現使該抗原、其基因或衍生物、其蛋白質或其變型能夠用于診斷實驗、預防性治療或預測。
其他涉及抗CD44抗體應用的研究存在治療潛力的限制，而H460-16-2沒有表現出這些限制。H460-16-2在體內和體外都顯示了抗腫瘤活性。以前提到過的抗體，如MAK<CD44>M-1.1.12、MAK<CD44>M-2.42.3和MAK<CD44>M-4.3.16在體外或體內沒有歸因于自身的細胞毒性，而VFF-18和Mab U36沒有表現出內在的細胞毒性。另外，其他表現出體內腫瘤作用的抗CD44抗體也存在一定的限制，沒有證據表明這些限制存在于H460-16-2。例如，ASML1.1、K926、抗CD44s和IM-78.1分別顯示了抑制異種移植模型中的鼠(rat)腫瘤、鼠(murine)腫瘤、rat和murine腫瘤的抗腫瘤活性。H460-16-2證明了在人類癌癥模型中的抗腫瘤活性。H460-16-2還是靶向人類CD44，而ASML1.1等抗體只識別鼠CD44。克隆515抗CD44抗體確實抑制了人類卵巢細胞系的腹膜腫瘤植入，但是沒有預防或抑制腫瘤生長。在SCID鼠模型中，H460-16-2有能力抑制人乳腺癌的生長。GKW.A3是抗人CD44單克隆抗體，能夠在一個預防性(但不是已建立的)模型中抑制人轉移黑素瘤在鼠中的腫瘤生長。H460-16-2在預防性和已建立的人乳腺癌的鼠異種移植模型，都已經表現出了抗腫瘤活性。因此，很明顯，H460-16-2具有比之前的抗CD44抗體更出眾的抗腫瘤活性。它在體內和體外都表現出了對SCID鼠中的人乳腺癌的抗腫瘤活性，并靶向人CD44。H460-16-2在預防性和已建立的(更加臨床相關)人乳腺癌模型中也表現了活性，它在已建立的人前列腺癌模型中表現了與順鉑的活性。
總之，本發明說明了H460-16-2抗原作為靶點用于治療劑，給藥后能降低哺乳動物中表達該抗原的癌癥的腫瘤負擔(因此延緩了疾病進展)，并且能夠延長受治哺乳動物的存活。本發明也說明了CDMAB(H460-16-2)及其衍生物的應用，用于靶向其抗原，以降低哺乳動物中表達該抗原的癌癥的腫瘤負擔，并延長患有表達該抗原的癌癥的哺乳動物的存活。另外，本發明說明，H460-16-2與其抗原結合后，能夠干擾癌細胞與透明脂酸酶相互作用的能力，也能夠導致癌細胞發生細胞凋亡。而且，本發明還說明了在腫瘤細胞中檢測H460-16-2的應用，能夠用于患有表達該抗原的腫瘤的哺乳動物的診斷、治療預測和預后。
如果患者的初期治療沒有效果或發生了轉移，則可以重復腫瘤特異抗體生成過程來進行治療。而且，抗癌抗體可以和患者的紅細胞結合并再次注入來治療病灶轉移。目前對轉移癌癥的有效治療很少，轉移通常預示著糟糕的出院率而導致死亡。不過，轉移的腫瘤通常有較好的血管生成，通過紅細胞進行的抗癌抗體的輸送具有將抗體聚集在腫瘤位置的作用。甚至在轉移前，大多數癌細胞依靠宿主血液供應來存活，而與紅細胞結合的抗癌抗體同樣能有效抵抗原位腫瘤。可選擇的，抗體可以和其它造血細胞結合，如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、自然殺傷細胞，等等。
目前有五類抗體，每類抗體具有一種其重鏈所賦予的功能。通常認為通過裸露抗體的癌細胞殺傷作用由抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)或補體依賴性細胞毒作用(CDC)來介導。例如，鼠IgM和IgG2a抗體能夠通過與補體系統中的C-1組分結合來激活人類補體，從而激活補體激活的經典途徑，這能導致腫瘤細胞溶解。對于人類抗體，最有效的補體激活抗體通常是IgM和IgG1。鼠同種型抗體IgG2a和IgG3在俘獲具有Fc受體的細胞毒性細胞過程中起作用，導致由單核細胞、巨噬細胞、粒細胞和某些淋巴細胞的細胞殺傷作用。人類同種型抗體IgG1和IgG3都介導ADCC。
抗體介導的癌細胞殺傷作用的另一種可能的機制是可以通過利用抗體催化功能，來水解細胞膜與其結合的糖蛋白或糖脂之間的化學鍵，即所謂的催化抗體。
還有兩種被普遍接受的抗體調節癌細胞殺傷的機理。第一種是利用抗體作為疫苗來誘導機體對腫瘤細胞表面的特定癌抗原產生免疫反應。第二種是利用抗體來靶向生長受體并干擾其功能或下調該受體以使其功能喪失。
因此，本發明的目的是利用一種方法在來源于特定個體的細胞中生產對癌細胞有細胞毒性而同時對非癌細胞相對無毒的癌癥調節抗體(CDMAB)，目的是分離雜交瘤細胞系和該雜交瘤細胞系編碼的相應的單克隆抗體及其抗原結合片段。
本發明另外一個目的是提供一種方法，該方法利用由保藏于ATCC、保藏編號為PTA-4621的細胞系編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷來檢測表達CD44抗原殘基的細胞，所述抗原殘基與上述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合。
本發明的更外一個目的是提供用于提高癌癥患者存活率的方法，通過使用由保藏于ATCC、保藏編號為PTA-4621的細胞系編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗體與CD44抗原殘基特異性結合。
本發明的另一個目的是說明CDMAB及其抗原結合片段。
本發明另一個目的是生成CDMAB，其細胞毒通過抗體依賴性細胞毒來介導。
本發明另一個目的是生成CDMAB，其細胞毒通過補體依賴性細胞毒來介導。
本發明另一個目的是生成CDMAB，其細胞毒是其因為其能夠催化細胞化學鍵的水解。
本發明另一個目的是生成CDMAB，該CDMAB在癌癥的診斷、預測和監測的結合試驗中是有用的。
本發明其它的目的和優點通過本發明下述的說明、舉例和實施例將變得顯而易見。


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圖1典型的顯微照片，顯示了H460-16-2(A)和抗CD44(BU75)抗體(B)與來源于正常人組織陣列的扁桃體組織切片的結合模式。BU75對淋巴細胞的染色比H460-16-2對淋巴細胞的染色更濃更廣。原發中心(綠色箭頭)對于兩種抗體來說都是較弱的染色。放大倍數為200倍。
圖2H460-16-2與乳腺癌腫瘤(侵潤性導管癌)結合的典型顯微照片。黃色和橙色箭頭分別指向基質細胞和惡性腫瘤細胞。放大100倍。
圖3典型的顯微照片，顯示了H460-16-2(A)和抗CD44(BU75)抗體(B)與來源于人乳腺癌組織陣列的佩吉特(paget′s)疾病乳腺組織切片的結合模式。惡性腫瘤細胞的BU75膜染色與H460-16-2負染色。放大倍數為400倍。
圖4典型的顯微照片，顯示了H460-16-2(A)和抗Her2(c-erbB-2)抗體(B)與來源于人乳腺癌組織陣列的乳腺組織切片的髓樣瘤的結合模式。H460-16-2對惡性腫瘤細胞強烈的膜染色和抗Her2的負染色。放大倍數為200倍。
圖5H460-16-2、順鉑、H460-16-2+順鉑或緩沖液對照在已建立的PC-3前列腺癌模型中對腫瘤生長的影響。陰影線代表給入抗體的時間。數據點代表平均+/-SEM。
圖6H460-16-2、順鉑、H460-16-2+順鉑或緩沖液對照在已建立的PC-3前列腺癌模型中對體重的影響。
圖7H460-16-2、BU75(陽性對照)或同種型對照對結合于透明脂酸酶(HA)的MDA-MB-231乳腺癌的影響。
圖8H460-16-2或同種型在治療后24小時對MDA-MB-231細胞在細胞周期分布的影響。
具體實施例方式
實例1根據布達佩斯條約，雜交瘤細胞系H460-16-2于2002年9月4日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，地址是10801UniversityBlvd.，Manassas，VA 20110-2209。根據37CFR 1.808的規定，保藏者保證在專利授權時永久取消對公眾獲取該保藏材料的所有限制。
抗體生產通過在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培養雜交瘤H460-16-2來生成單克隆抗體，每星期進行兩次收集和再接種。然后用瓊脂糖凝膠Protein G Sepharose 4Fast Flow(AmershamBiosciences，Baie d’Urfé，QC)進行標準的抗體純化過程。本發明的范圍包括利用人的、人源化的、嵌合的(chimerized，即部分人源化以消除免疫原性)或鼠單克隆抗體。
實例2正常人組織染色之前進行了IHC研究，來表現H460-16-2在人類中的分布特征(S.N.10/603,000)并與L178進行了比較(S.N.10/647,818)。本研究比較了H460-16-2和另外一個靶向CD44的抗體(BU75)，由于H460-16-2抗原可能是之前用生化方法檢測到的CD44的癌癥變型。使用人正常器官組織陣列進行抗體與59種正常人組織的結合(Imgenex，SanDiego，CA)。所有主要抗體(H460-16-2、BU75抗CD44(BIOCANScientific Inc.，Mississauga，ON)和鼠IgGi陰性對照(Dako，Toronto，ON))的濃度在抗體稀釋緩沖液(Dako，Toronto，ON)中被稀釋成5μg/ml(在之前優化步驟中被發現是最佳濃度)。陰性對照抗體對生產商提供的所有哺乳動物組織都表現為陰性。IHC的程序如下。
組織切片在580℃干燥箱中進行干燥去石蠟化1小時，并置于染缸中的二甲苯中侵潤5次(每次4分鐘)進行脫蠟。通過一系列等級的乙醇(100％-75％)洗滌處理后，切片于水中再次水合。載玻片侵泡于pH6的10mM檸檬酸緩沖液(Dako，Toronto，Ontario)中，然后分別在高、中、低功率的微波下微波(每次5分鐘)，最后浸于冷PBS中。載玻片于3％過氧化氫溶液中浸泡6分鐘，PBS洗滌3次(每次5分鐘)，干燥，于通用封閉溶液(Dako，Toronto，Ontario)中室溫5分鐘。H460-16-2、BU75或同種型對照抗體(靶向黑曲霉葡萄糖氧化酶，一種在哺乳動物組織中不存在也不可誘導的酶)在抗體稀釋緩沖液中被稀釋成工作濃度(每種抗體都是5μg/mL)，室溫培養1小時。PBS洗滌載玻片3次，每次5分鐘。使用所提供的HRP交聯的二級抗體(Dako Envision System，Toronto，Ontario)來檢測/顯現主要抗體的免疫活性，室溫下30分鐘。接著，載玻片用PBS洗滌3次(每次5分鐘)，加入DAB(3，3′-二氨基聯苯tetrahydrachloride；Dako，Toronto，Ontario)色原體基質溶液生成顏色反應，室溫下進行免疫過氧化物酶染色10分鐘。自來水洗滌載玻片來終止顯色反應。接著使用Meyer′s蘇木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)進行復染，用分級乙醇(75-100％)脫水，二甲苯清洗。使用封固劑(Dako Faramount，Toronto，Ontario)封蓋載玻片。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)顯微觀察載玻片，使用Northern Eclipse成像軟件(Mississauga，ON)獲得并儲存數字圖像。病理學家對結果進行分析、評分并解釋。
表1匯總了一系列正常人組織的H460-16-2和BU75抗CD44染色結果。使用H460-16-2的組織染色與之前(S.N.10/603,000)描述的類似。需要再次注意該抗原通常不出現在主要器官(包括肝、腎、心和肺)中的細胞上。H460-16-2抗體確實與巨噬細胞和淋巴細胞結合，在這些切片中的一些器官中觀察到了它們的存在。但是，BU75抗CD44抗體的淋巴細胞染色較濃(Figure 1)。
對H460-16-2呈陽性的組織通常也對BU75抗CD44抗體呈陽性(有時會更濃)。對H460-16-2呈陰性的組織通常也對BU75抗CD44抗體呈陰性，但有幾個例外，如食管和淋巴結組織樣品。這些結果說明H460-16-2與BU75抗CD44抗體所識別的組織小亞基結合，而組織內的染色強度有時也小一些。這些結果表明H460-16-2的抗原不是廣泛表達于正常組織上，這些抗原與人體中有限數目的組織特異性結合。這些結果也支持了H460-16-2靶向CD44抗原表位的生化數據，所述抗原表位不同于IHC研究中使用的那些由BU75識別的抗原表位。
表1人正常組織上的BU75抗CD44和H460-16-2比較



縮寫SMF平滑肌纖維，NR切片不是代表性的實例3人乳腺癌組織染色先前進行了IHC研究，來確定H460-16-2抗原和人乳腺癌的關聯，以及H460-16-2是否可能識別人類腫瘤(S.N.10/603,000)，并通過與L178的抗CD44染色比較來確定它如何識別人類腫瘤(S.N.10/647,818)。目前，比較了BU75抗CD44染色、c-erbB-2抗Her2和-種靶向黑曲霉素葡萄糖氧化酶(-種哺乳動物組織中不存在也不可誘導的酶)的抗體(陰性對照)。使用了來源于50個乳腺癌患者的乳腺癌組織陣列和來源于乳腺癌患者體內非新生乳腺組織的10個樣品(Imgenex Corporation，San Diego，CA)。為每例患者給出如下信息年齡、性別、美國癌癥聯合會(AJCC)的腫瘤分期、淋巴結、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)的狀態。IHC的程序在實施例5說明。所有的抗體的使用都是工作濃度為5μg/mL，除了抗Her2在1.5μg/mL的濃度下使用。
表2和表3分別提供了H460-16-2和BU75抗CD44抗體對乳腺癌組織陣列染色的匯總。每個陣列包括來源于50例個體患者的腫瘤樣品。總之，50例受試患者中有62％對H460-16-2抗原呈陽性，而73％對BU75抗CD44呈陽性。在H460-16-2和BU75抗CD44對相同組織進行染色的情況下，有45％的樣品的BU75抗CD44染色強度比H460-16-2高。對于H460-16-2和BU75抗原來說，來源于乳腺癌患者的10個正常乳腺組織樣品中分別有4和8個呈陽性。沒有證明雌激素和孕激素受體狀態之間明顯的相關性。也沒有呈現這樣的趨勢H460-16-2和處于更高腫瘤分期的CD44抗原有更高的陽性表達。
表2人乳腺癌IHC匯總(H460-16-2)

表3人乳腺癌IHC匯總(抗CD44(BU75))

如圖2顯示的，與正常細胞相比，H460-16-2染色對腫瘤細胞具有特異性，其中基質細胞明顯呈陰性，而癌細胞呈高度陽性。使用H460-16-2抗原觀察到的細胞定位模式為多數情況下集中于細胞膜。BU75CD44抗體染色了更多的乳腺癌樣品，與H460-16-2比較，顯示出細胞膜比細胞質更高程度的定位(表4)。BU75抗CD44還對佩吉特疾病的癌細胞進行了染色，而H460-16-2則沒有(圖3)。對H460-16-2染色呈陽性的乳腺癌患者正常組織樣品也對BU75抗CD44染色呈陽性。
在與c-erbB-2的比較中，H460-16-2呈現出完全不同的染色結果，31個乳腺癌組織樣品中對H460-16-2抗原呈陽性的16個樣品對Her2表達呈陰性，這表明依然未滿足乳腺癌患者對靶向治療的需求(表5、圖4)。對H460-16-2和Her2都呈陽性的乳腺癌組織切片之間還存在染色強度的差別；一些乳腺癌組織切片對H460-16-2呈高度陽性而對Her2只呈中度陽性，而另外一些正好相反(即對Her2呈高度陽性而對H460-16-2呈中度陽性)，這說明H460-16-2將治療性的靶向不同的乳腺癌患者隊列。c-erbB-2抗體也對-種正常乳腺組織切片的染色呈陽性。
這些結果表明針對H460-16-2的抗原可以被近三分之二的乳腺癌患者所表達。另外，多數適合于H460-16-2治療的人將不適合于抗Her2的治療。患者樣品中的染色模式表明抗體對腫瘤細胞的高度特異性，并且H460-16-2抗原被定位于細胞膜而使其成為具有吸引力的藥用靶點。H460-16-2染色與BU75抗CD44相似但更具限制性，這再次表明H460-16-2抗原表位有可能是更加受限制的CD44變型。
表4BU75抗CD44和H460-16-2對人類腫瘤和正常乳腺組織的IHC比較




表5c-erbB-2抗Her2和H460-16-2對人類腫瘤和正常乳腺組織的IHC比較



實施例4已建立的體內PC-3化療結合腫瘤實驗參考圖5和6，6-8周的雄性SCID小鼠于頸背部皮下注射100微升含1百萬PC-3人前列腺癌細胞的生理鹽水。通過測徑器每周測量腫瘤生長。在植入后21天，當隊列中大部分的腫瘤體積達到80mm3(范圍50-130mm3)時，8只小鼠被隨機分入4個治療組中。腹腔注入H460-16-2抗體、化學療劑順鉑、H460-16-2抗體加順鉑、或對照緩沖液，其中抗體和順鉑的給藥量分別為15和6mg/kg，給藥體積為300微升，是由貯存標準品經稀釋液(含有2.7mM KCl，1mMKH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4)稀釋而成。第一周，H460-16-2或對照緩沖液每周注射4次；接下來以同樣方式每周3次共11個劑量，直至植入后41天。順鉑于抗體治療期的第0、5、10和15天注射。測徑器每7天測量一次腫瘤生長，直至植入后48天或直至個體動物達到CCAC(加拿大動物護理委員會)規定的終點。在研究的持續過程中記錄動物的體重。在研究結束時，所有的動物都根據CCAC指南進行安樂死。
使用配對T檢驗，發現順鉑治療或H460-16-2加順鉑的聯合治療降低了植入后的腫瘤負擔(圖5)。在植入后的第48天(治療后7天)，順鉑和H460-16-2聯合治療比在治療后短期內抑制腫瘤生長方面比緩沖液對照(p＜0.0001)、順鉑單獨治療(p＝0.004)或H460-16-2單獨治療(p＜0.0001)明顯更加有效。
PC-3是前列腺癌的一種惡病質模型，其中在PC-3前列腺癌異種移植模型中腫瘤負擔的增加和疾病進展伴隨著體重的減少。如圖6顯示的平均體重，所有組的小鼠都經歷了嚴重的體重下降。在本研究中，所有組的小鼠在治療結束時體重下降了約23-35％。H460-16-2治療組表現出最小程度的體重下降(21.7％)。在治療后短期內，H460-16-2加順鉑聯合治療與緩沖液對照相比沒有額外明顯的體重下降(p＝0.5042)。因此，在公認的人乳腺癌疾病模型中，與緩沖液對照相比，H460-16-2加順鉑降低了腫瘤負擔。這些結果表明了該抗體在哺乳動物(包括人)癌癥治療中的藥理和藥劑受益。
實例5透明脂酸酶(HA)結合實驗MDA-MB-231細胞(之前通過FAC分析表現為表達H460-16-2抗原(CD44))經過如下步驟被離解從組織培養皿中吸走廢棄培養液，PBS洗滌培養皿，于每個平皿加入5mL裂解緩沖液，平皿置37℃培養，直至細胞離解。然后，細胞經計數后被收集入50mL試管。細胞于1200rpm下旋轉離心5分鐘，細胞懸浮于培養液中形成1-5百萬細胞/mL。每一個深度為2mL的板孔中加入上述細胞溶液1mL。1200rpm旋轉孔板5分鐘來沉淀細胞，翻轉孔板于紙巾上來去除上清液。輕輕渦旋振蕩深孔板來離散細胞沉淀。每個孔中加入1mLH460-16-2、BU75(陽性對照，BIOCAN Scientific Inc.，Mississauga，ON)或同種型陰性對照(107.3，BD Biosciences，Oakville，ON)抗體，然后溫和渦旋振蕩混合。然后孔板于37℃培養2小時。同時，通過將300μl/孔的HA儲備液(4mg/mL)于37℃下培養1-2小時，48孔的孔板被HA包被。培養后，吸除多余的HA，孔板于層流通風廚中完全風干。抗體孔培養結束后，細胞再次經過1200rpm離心沉淀5分鐘。倒置深孔于紙巾上來去除上清液。深孔再次經渦旋振蕩以離散細胞沉淀，隨后于每個孔中加入1.2mL的2μM鈣黃綠素PBS溶液(含有MgCl2和CaCl2)。懸浮細胞，轉移懸浮液(250μl/孔)至HA包被的孔板。然后將HA包被孔板于37℃下培養2小時，使發生粘附。培養后，通過抽吸去除未附著的細胞。用含有MgCl2和CaCl2的PBS溶液洗滌每個孔2-3次，以去除任何未附著的細胞或細胞團。孔板于Perkin-Elmer HTS7000熒光讀板機中讀板，在Microsoft Excel中分析數據，結果列于表6或圖7。6次單獨實驗的平均結果表明要使MDA-MB-231細胞與HA的結合減少50％，需要平均1.87(+/-1.01)μg/mL的H460-16-2(表6)。H460-16-2對MDA-MB-231細胞和HA的結合的影響是劑量依賴性的；20μg/mL的H460-16-2使細胞與HA的結合減少了60％(圖7)。這些結果表明H460-16-2與CD44上負責結合HA的區域相互作用(至少是部分的相互作用)，從而可以解釋其通過ECM下調血管發生或腫瘤侵襲力的抗癌作用。
表6H460-16-2對MDA-MB-231細胞與HA結合的影響總結

實施例6細胞周期實驗通過FACS分析來評價H460-16-2對MDA-MB-231乳腺癌細胞的細胞周期的影響。將H460-16-2抗體(0、0.2、2.0和20μg/mL)或同種型對照(克隆107.3，BD Biosciences，Oakville，ON)與MDA-MB-231乳腺癌細胞一起培養24、48和72小時。用碘化丙啶對處理過和未處理過的細胞進行染色，然后用流式細胞計數儀分析單細胞，來評價相對DNA含量。使用BD CellQuest對需要的數據組進行分析，通過門控單細胞數量和顯示亞二倍體染色的細胞。經過分析，用H460-16-2處理了24小時的細胞顯示出分裂細胞百分比的整體下降以及劑量依賴型的Gi期細胞群增加。出現于Gi期細胞群的細胞是那些由于細胞膜喪失完整性而失去了DNA的細胞，它可以代表細胞凋亡細胞群(圖8)。這一數據說明了H460-16-2對MDA-MB-231細胞分裂周期具有影響，而這種影響導致了一種劑量依賴型的凋亡細胞數目的增加。
優勢證據表明H460-16-2通過CD44變型表面展示的依賴碳水化合物的構象表位的連接作用介導了抗癌作用，并且該表位至少部分參與CD44與HA的結合。
還有證據表明H460-16-2與該表位的結合能夠導致相應細胞的凋亡。S.N.10/713,451中已經表明，H460-16-2抗體能夠用于免疫沉淀來自MDA-MB-231等表達細胞的同源性抗原。而且，這還表明H460-16-2抗體能夠用于檢測那些表達CD44抗原性殘基(與H460-16-2抗體特異性結合)的細胞和/或組織，通過利用(但不限于)FACS、細胞ELISA或IHC說明的技術。
因此，可以表明，利用FACS、細胞ELISA或IHC實驗，免疫沉淀的H460-16-2抗原能夠抑制H460-16-2與這類細胞或組織的結合。而且，如同H460-16-2抗體一樣，其他抗CD44抗體也能夠用于免疫沉淀及分離其他類型的CD44抗原，利用相同類型的實驗，這些抗原也能夠用于抑制那些抗體與表達這些抗原的細胞或組織的結合。還可以表明，如果一種識別所有類型CD44的抗CD44抗體(即一種全CD44抗體)被用于分離其同源抗原，那么所分離的抗原也能夠抑制H460-16-2抗原與表達該抗原的細胞或組織的結合，因此也證明了H460-16-2與表達該抗原的細胞和組織上的CD44表位的結合。可選的，H460-16-2和全CD44在一些實驗(如競爭性實驗ELISA、細胞ELISA、FACS或類似實驗)中同時出現，兩者的比較也能證明H460-16-2與表達該抗原的細胞或組織上的CD44抗原表位的結合。
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需要理解盡管本發明以某一方式被說明，這不是要將本發明限制在本文所描述或顯示的特定形式或部分安排。對現有技術人員來說顯而易見的是在不偏離本發明范圍的情況下可以做出不同的變化，不能認為本發明局限于本說明書所顯示和描述的內容。一個現有技術人員將容易理解適當調整本發明來實現目的并獲得所提到的及其固有的結果和優點。本文描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物學相關化合物、方法、程序和技術都是目前代表性的優選實施方式，目的是可效仿實現而不是對范圍的限制。對現有技術人員來說一些變化和其他使用，這些變化和使用都包含在本發明的構思之內并被權利要求書的范圍所限定。盡管本發明以特定的優選實施方式被描述，但是應該理解所要求保護的發明不應當被不適當的限制在這些特定實施方式中。實際上，為實施本發明所描述的方式的各種對現有技術人員來說是顯而易見的修改都要在權利要求的保護范圍之內。
權利要求
1.一種治療腫瘤疾病患者的方法，包括為所述患者注入一種抗癌抗體或其片斷，所述抗體或其片斷的生成是按照一種生產腫瘤疾病治療中有用的抗癌抗體的生產方法，所述抗體或其片斷的特征是對腫瘤組織細胞具有細胞毒性，而對非腫瘤細胞本質上是無害的；其中所述抗體或其片斷與一種藥學可接受的輔劑制成混合物，并以有效量給藥來介導所述腫瘤疾病的治療；所述抗體是一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗體或其抗原結合片斷與所述腫瘤組織表達的抗原性殘基相結合，所述抗原性殘基的特征為它被一種抗體結合，所述抗體具有單克隆抗體的識別特性并由ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆編碼。
2.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷是人源化或雜合的。
3.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，包括將所述抗體或其抗原結合片斷與毒素、酶、放射性化合物和造血細胞中的一種相結合，從而形成抗體交聯物；和為所述患者注入所述抗體交聯物或其交聯的片斷；其中所述抗體交聯物或交聯的片斷與一種藥學可接受的輔劑制成混合物，并以有效量給藥，來介導所述腫瘤疾病的治療。
4.權利要求3的方法，其中所述抗體或其片斷是人源化或雜合的。
5.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過抗體依賴性細胞毒介導的。
6.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過補體依賴性細胞毒介導的。
7.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過催化水解細胞化學鍵介導的。
8.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過針對腫瘤細胞表面推定癌抗原的免疫反應介導的。
9.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒的介導是通過靶向細胞膜蛋白來干擾其功能。
10.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒的介導是通過細胞蛋白產生構象改變而生成一種信號來啟動細胞殺傷作用。
11.根據權利要求1所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述生產方法利用了從特定個體中獲得的、含有腫瘤和非腫瘤細胞的組織樣品。
12.一種治療腫瘤疾病患者的方法，包括為所述患者注入一種抗癌抗體或其片斷，所述抗體或其片斷的生成是按照一種生產腫瘤疾病治療中有用的抗癌抗體的生產方法，所述抗體或其片斷的特征是對腫瘤組織細胞具有細胞毒性，而對非腫瘤細胞本質上是無害的；其中所述抗體是由ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，該抗體與一種藥學可接受的輔劑制成混合物，并以有效量給藥來介導所述腫瘤疾病的治療。
13.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷是人源化或雜合的。
14.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，包括將所述抗體或其抗原結合片斷與毒素、酶、放射性化合物和造血細胞中的一種相結合，從而形成抗體交聯物；和為所述患者注入所述抗體交聯物或其交聯的片斷；其中所述抗體交聯物或交聯的片斷與一種藥學可接受的輔劑制成混合物，并以有效量給藥，來介導所述腫瘤疾病的治療。
15.權利要求14的方法，其中所述抗體或其片斷是人源化或雜合的。
16.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過抗體依賴性細胞毒介導的。
17.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過補體依賴性細胞毒介導的。
18.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過催化水解細胞化學鍵介導的。
19.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒是通過針對腫瘤細胞表面推定癌抗原的免疫反應介導的。
20.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒的介導是通過靶向細胞膜蛋白來干擾其功能。
21.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述抗體或其片斷的細胞毒的介導是通過細胞蛋白產生構象改變而生成一種信號來啟動細胞殺傷作用。
22.根據權利要求12所述的治療腫瘤疾病患者的方法，其中所述生產方法利用了從特定個體中獲得的、含有腫瘤和非腫瘤細胞的組織樣品。
23.一種介導在細胞表面表達CD44抗原性殘基的人類腫瘤細胞的細胞毒的方法，包括將所述腫瘤細胞與一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷相接觸，所述抗體或其抗原結合片斷是一種與所述的被表達的CD44抗原性殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗原性殘基的特征是它被一種具有單克隆抗體識別特性并由ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆編碼的抗體所結合，從而細胞毒的發生是該結合的結果。
24.權利要求23所述的方法，其中所述分離的抗體或其抗原結合片斷是人源化或雜合的。
25.權利要求23所述的方法，其中所述分離的抗體或其抗原結合片斷與毒素、酶、放射性化合物和造血細胞中的一種相結合，從而形成抗體交聯物。
26.權利要求23的方法，其中所述分離的抗體或其抗原結合片斷是人源化或雜合的。
27.權利要求23的方法，其中所述分離的抗體或其抗原結合片斷是鼠的。
28.權利要求23的方法，其中所述人類腫瘤組織樣品是從一種腫瘤原發組織中獲得的，所述腫瘤原發組織是結腸、卵巢、肺、前列腺或乳腺組織。
29.一種檢測CD44抗原性殘基表達細胞的結合檢測方法，所述CD44抗原性殘基與一種分離的單克隆體或其抗原結合片斷結合，所述抗體由ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆所編碼，包括提供一種細胞樣品；提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗體或其抗原結合片斷是一種與所述表達的抗原性殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗原性殘基的特征為它被一種抗體結合，該抗體具有單克隆抗體的識別特性并由ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆所編碼；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與所述細胞樣品相接觸；和檢測所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與所述細胞樣品的結合；從而，與所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合的CD44抗原性殘基的表達細胞得到了檢測。
30.根據權利要求29所述的結合檢測方法，其中所述細胞樣品是從一種腫瘤原發組織中獲得的，所述腫瘤原發組織是結腸、卵巢、肺、前列腺或乳腺組織。
31.一種從樣品中分離或篩選與一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合的CD44抗原性殘基的表達細胞的方法，所述抗原性殘基的特征為它被一種具有單克隆抗體識別特性并由ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆編碼的抗體所結合，包括提供一種細胞樣品；提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗體或其抗原結合片斷是一種與所述表達的抗原性殘基相結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷，所述抗原性殘基的特征為它被一種抗體結合，該抗體具有單克隆抗體的識別特性并由ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆所編碼；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與所述細胞樣品相接觸；和檢測所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷與所述細胞樣品的結合；從而，與所述分離的單克隆抗體或其抗原結合片斷或其抗原結合片斷特異性結合的CD44抗原性殘基的表達細胞通過所述結合而被分離，并證實了這些細胞存在于所述細胞樣品中。
32.權利要求31所述的方法，其中所述細胞樣品是從一種腫瘤原發組織中獲得的，所述腫瘤原發組織是結腸、卵巢、肺、前列腺或乳腺組織。
33.一種通過治療哺乳動物中的人類腫瘤來延長存活和/或延緩疾病進展的方法，其中所述腫瘤表達一種與單克隆抗體或其抗原結合片斷特異性結合的抗原，所述抗體具有ATCC保藏編號為PTA-4621的克隆所編碼的單克隆抗體的識別特性，包括為所述哺乳動物注入有效量的所述單克隆抗體，來減少所述哺乳動物的腫瘤負擔，從而延緩疾病進展和/或延長存活。
34.權利要求33所述的方法，其中所述抗體與一種細胞毒殘基結合。
35.權利要求33所述的方法，其中所述細胞毒殘基是一種放射性同位素。
36.權利要求33所述的方法，其中所述抗體激活補體。
37.權利要求33所述的方法，其中所述抗體介導抗體依賴性細胞毒作用。
38.權利要求33所述的方法，其中所述抗體是鼠抗體。
39.權利要求33所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
40.權利要求33所述的方法，其中所述抗體是雜合抗體。
全文摘要
本發明涉及癌癥調節抗體(CDMAB)H460－16－2在治療人類腫瘤中的應用，以及表達CD44抗原殘基的腫瘤細胞的分離和識別方法。與CD44抗原殘基結合的單克隆抗體H460－16－2(ATTC保藏編號PTA－4621)對腫瘤細胞具有細胞毒性，其中所述細胞毒性通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和完全依賴性細胞毒作用(CDC)來介導。所述單克隆抗體H460－16－2用于延緩人類腫瘤疾病的惡化。
文檔編號G01N33/567GK1960754SQ200580009692
公開日2007年5月9日 申請日期2005年3月23日 優先權日2004年3月26日
發明者大衛·S·F·楊, 蘇姍·E·哈恩, 海倫·P·芬德利 申請人:阿里烏斯研究公司