變應原的檢測方法

專利名稱：變應原的檢測方法
技術領域：
本發明涉及以食品等試樣中所含的未變性和變性的乳變應原、未變性和變性的卵清蛋白變應原(卵白アレルゲン)、未變性和變性的小麥變應原、未變性和變性的蕎麥變應原、或者未變性和變性的花生變應原為指標的乳變應原的檢測方法，以及其中所使用的乳變應原檢測試劑盒。
本發明涉及可定性且定量、高靈敏度地對食品等試樣中所含的未變性或變性的乳變應原進行分析，并以酪蛋白的主要蛋白質——αs1酪蛋白、或者乳清的主要蛋白質——β乳球蛋白為指標的變應原的檢測方法，以及其中所使用的變應原的檢測試劑盒。
本發明還涉及可定性且定量、高靈敏度對食品等試樣中所含的未變性或變性的卵白蛋白或卵類粘蛋白的卵清蛋白變應原進行分析的、并以卵白蛋白(オボアルブミン)和/或卵類粘蛋白為指標的卵清蛋白變應原的檢測方法，以及其中所使用的卵清蛋白變應原的檢測試劑盒。
本發明還涉及可定性且定量、高靈敏度對食品等試樣中所含的未變性或變性的小麥變應原進行分析的、以小麥的主要蛋白質——麥醇溶蛋白為指標的小麥變應原的檢測方法，以及其中所使用的小麥變應原的檢測試劑盒。
本發明還涉及可定性且定量、高靈敏度對食品等試樣中所含的未變性或變性的蕎麥變應原進行分析的、以蕎麥的主要蛋白質——分子量24kDa和76kDa蛋白質為指標的蕎麥變應原的檢測方法，以及其中所使用的蕎麥變應原的檢測試劑盒。
本發明還涉及可定性且定量、高靈敏度對食品等試樣中所含的未變性或變性的花生變應原進行分析的、以花生的主要蛋白質——Arah1為指標的花生變應原的檢測方法，以及其中所使用的花生變應原的檢測試劑盒。
背景技術：
由于自然環境的惡化、車輛或工廠等的排氣、住宅的開發等、或者食物的變化等各種因素，目前每3人中即有1人患有各種變態反應疾病。特別是食物變態反應是由于攝取了食品中所含的變態反應誘發物質(以下稱為食物變應原)而引起的有害免疫反應，引發皮膚炎、哮喘、消化道障礙、過敏性休克等，上述食物變態反應的患者逐漸增加，因此在醫學上和食品工業上產生了深刻的問題。這些危害甚至威脅到生命，必需采取措施防患于未然。因此，通過標識向消費者提供信息的必要性提高，FAO/WHO食品規格起草聯合委員會同意在含有已知為變態反應物質的8種原材料的食品上進行上述內容的標識，成員國分別研討了適合各國制度的標識方法(1999年6月)。日本研討了以往的健康危害等的程度、頻率，對于有引起嚴重的變態反應癥狀的實例的24種食品規定了其標識方法(自2002年4月起實行)。已知引起變態反應的食品有卵類、牛乳類、肉類、魚類、貝殼類和軟體動物類、谷類、豆類和干果類、果實類、蔬菜類、啤酒酵母或明膠等，還特別已知乳變應原的主要成分是αs1酪蛋白、乳清變應原的主要成分是β乳球蛋白、卵清蛋白變應原成分是卵白蛋白和卵類粘蛋白、小麥變應原的主要成分是麥醇溶蛋白、蕎麥的主要蛋白質是分子量24kDa和76kDa的蛋白質、花生的主要蛋白質是Ara h1。
以往，變應原的檢測方法例如有對與變應原特異性反應的免疫球蛋白進行定量的方法(參照日本特開平05-249111號公報)、或者對含有抗原抗體復合物的檢樣中的該抗原抗體復合物進行酸處理等，使其解離，根據需要用堿進行中和處理，然后測定該檢樣中的變應原特異性IgE抗體的方法(參照日本特開平07-140144號公報)等。
現在檢測乳、卵、小麥、蕎麥、花生的特定原材料的公定方法是使用由加熱·非加熱復合抗原得到的多克隆抗體進行的免疫學檢測方法(參照日本特開2003-155297號公報；以下稱為“市售公定法A”)，或者使用由純化抗原得到的多克隆抗體進行的免疫學檢測方法(以下稱為“市售公定法B”)。它們都是特異性檢測變應原的有效的方法，但是也存在很多問題。例如，在市售公定法A中，由于使用復合抗原，是針對何種物質的抗體不明確，交叉性高，例如無法通過免疫印跡法等進行抗原的鑒定，另外有非特異性反應增加的可能性。而市售公定法B中，抗原得到純化，因此抗體的特異性是明確的，但是由于使用了用未變性的抗原制備的抗體，而變性/未變性導致的抗體結合程度有很大差別，因此即使相同的添加量，在加熱前、加熱后，其定量值也不同。特別是小麥在其它特定原材料(卵、乳、蕎麥、花生)中常被實施嚴酷的加熱處理(例如面包、油炸等)，小麥變應原由未變性至加熱變性，以廣范的狀態存在。因此為了檢測小麥變應原，必須制備明確了與何種狀態的變應原結合的單克隆抗體，根據其特性加以利用。
關于卵的鑒定、定量，已知有以卵類粘蛋白為指標，使用多克隆抗體的方法(例如參照Int.Archs.Allergy appl.Immun.，75，8-15，1984)或者使用單克隆抗體的方法(例如參照Nutr.Sci.Vitaminol.45，491-500，1999)。還有報告提出了作為識別卵類粘蛋白的單克隆抗體，使用與未變性卵類粘蛋白反應但不與熱變性卵類粘蛋白反應的單克隆抗體、與熱變性卵類粘蛋白反應但不與未變性卵類粘蛋白反應的單克隆抗體、以及與未變性卵類粘蛋白和熱變性卵類粘蛋白反應的單克隆抗體，也識別加熱變性狀態，并對卵類粘蛋白進行定量，由此可以對卵變應原進行鑒定和正確的定量的免疫學定量方法(例如參照日本特開2002-253230號公報)。

發明內容
本發明的目的在于提供在含有乳變應原、卵清蛋白變應原、小麥變應原、蕎麥變應原或花生變應原的食品中，在變性/未變性的任何狀態都可以檢測乳變應原、卵清蛋白變應原、小麥變應原、蕎麥變應原或花生變應原的高靈敏度的免疫學檢測方法和其中所使用的檢測試劑盒等。
本發明人對于檢測特定原材料乳、卵清蛋白、小麥、蕎麥或花生的各變應原的方法進行了深入研究，發現使用識別未變性和變性的乳變應原、未變性和變性的卵清蛋白變應原、未變性和變性的小麥變應原、未變性和變性的蕎麥變應原、或未變性和變性的花生變應原的各兩種或以上單克隆抗體，則可以檢測這些特定原材料的各變應原。
在對特定原材料之一的乳的檢測方法進行研究時，以酪蛋白的主要蛋白質αs1酪蛋白為指標，制備了抗該蛋白的單克隆抗體(以下可稱為MAb)，從其中選擇多個可識別未變性αs1酪蛋白、尿素處理αs1酪蛋白、未變性酪蛋白鈉、和變性酪蛋白鈉的MAb，通過夾層ELISA，發現了可在100-1000ppb的濃度范圍內對未變性αs1酪蛋白、尿素處理αs1酪蛋白、未變性酪蛋白鈉、和變性酪蛋白鈉進行定性且定量分析的MAb的組合。還確認使用這些MAb，無論食品中的乳變應原經受任何加工步驟，利用本發明檢測方法或檢測試劑盒的人都可以更簡便地從檢查對象制品中檢測出乳變應原。
在對特定原材料之一的乳的檢測方法進行研究時，以乳清的主要蛋白質β乳球蛋白為指標，制備抗該蛋白的單克隆抗體，從其中選擇多個可識別未變性β乳球蛋白、尿素處理β乳球蛋白、還原羧甲基化β乳球蛋白等的MAb，通過夾層ELISA，發現了可在30-1000ppb的濃度范圍內對未變性β乳球蛋白、尿素處理β乳球蛋白、還原羧甲基化β乳球蛋白進行定性且定量分析的MAb的組合。并確認使用這些MAb，則不管食品中的乳變應原經過任何加工步驟，利用本發明的檢測方法或檢測試劑盒的人都可以更簡便的從檢查對象制品中檢測出乳變應原。
在對特定原材料之一的卵清蛋白的檢測方法進行研究時，制備抗純化卵白蛋白或卵類粘蛋白的單克隆抗體，從其中分別選擇多個可與未變性抗原結合的MAb和可與變性抗原結合的MAb，發現通過未變性抗原結合MAb群和變性抗原結合的MAb群的組合，不管作為抗原的卵白蛋白或卵類粘蛋白處于變性/未變性的任何狀態，都可高靈敏度檢測，特別是將未變性抗原結合MAb群和變性抗原結合MAb群組合使用時，即使只存在未變性卵白蛋白或卵類粘蛋白、或者只存在變性卵白蛋白或卵類粘蛋白，也可以以比單獨使用未變性抗原結合Mab(群)或單獨使用變性抗原結合Mab(群)更優異的檢測靈敏度進行檢測。通過將卵清蛋白變應原——卵白蛋白和卵類粘蛋白的MAb組合使用，無論食品中的卵清蛋白經過任何加工步驟，利用本發明的檢測方法或檢測試劑盒的人都可以更簡便地從檢查對象制品中檢測出卵清蛋白變應原。
在對特定原材料之一的小麥的檢測方法進行研究中，制備抗純化麥醇溶蛋白的單克隆抗體，從其中選擇多個可識別未變性小麥麥醇溶蛋白、還原羧甲基化小麥麥醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麥麥醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麥麥醇溶蛋白、以及變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的MAb，通過夾層ELISA，發現了可在10-100ppb的濃度范圍內對未變性小麥麥醇溶蛋白、還原羧甲基化小麥麥醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麥麥醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麥麥醇溶蛋白、和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白進行定性且定量的分析的MAb的組合。使用這些MAb，食品中的小麥變應原無論經過任何加工步驟，利用本發明的檢測方法或檢測試劑盒的人都可以更簡便的從檢查對象制品中檢測出小麥變應原。
在對特定原材料之一的蕎麥的檢測方法進行研究時，制備抗純化的24kDa蛋白質或純化的76kDa蛋白質的單克隆抗體，從其中選擇多個可識別24kDa蛋白質或76kDa蛋白質的MAb，通過夾層ELISA，發現了即使是未加熱(未變性)、加熱(變性)的任何狀態的蕎麥蛋白質，都可以進行高靈敏度分析的、可與未變性蕎麥蛋白質結合的MAb和可與變性蕎麥蛋白質結合的MAb的組合。使用這些MAb，無論食品中的蕎麥變應原經過任何加工步驟，利用本發明的檢測方法或檢測試劑盒的人都可以更簡便的從檢查對象制品中檢測出蕎麥變應原。
在對特定原材料之一的花生的檢測方法進行研究時，制備抗純化的未變性Ara h1(以下可稱為“NAh1”)或用尿素和2-巰基乙醇對純化的Ara h1進行變性的Ara h1(以下可稱為“DAh1””)的單克隆抗體，從其中選擇多個可識別NAh1、DAh1、未變性的花生粗蛋白(以下可稱為“NP-e”)、和/或尿素處理的花生粗蛋白(以下可稱為“DP-e”)的MAb，通過夾層ELISA，發現了對未加熱(未變性)、加熱(變性)的任何狀態的花生蛋白質都可以高靈敏度分析的MAb的組合。使用這些MAb，無論食品中的花生變應原經過任何加工步驟，利用本發明的檢測方法或檢測試劑盒的人都可以更簡便的從檢查對象制品中檢測出花生變應原。
附圖簡述

圖1是表示使用本發明(乳變應原)的兩種抗αs1酪蛋白MAb對各種狀態的αs1酪蛋白的反應的夾層ELISA結果圖。
圖2是表示本發明(乳變應原)的Pas1CN1和Pas1CN2所識別的小麥αs1酪蛋白的構成蛋白質的差異的圖。
圖3是通過夾層ELISA，表示本發明(乳變應原)的PLG2和PLG1對各種β乳球蛋白的反應性的圖。
圖4是通過夾層ELISA，表示本發明(乳變應原)的PLG2和PLG3對各種β乳球蛋白的反應性的圖。
圖5是通過夾層ELISA，表示本發明(乳變應原)的MAb混合系對未變性乳球蛋白的反應性的圖。
圖6是通過夾層ELISA，表示本發明(乳變應原)的MAb混合系對尿素變性的乳球蛋白的反應性的圖。
圖7是抗卵白蛋白MAb對本發明(卵清蛋白變應原)試驗1中各稀釋梯度的反應性的圖。
圖8是表示抗卵白蛋白MAb對本發明(卵清蛋白變應原)試驗2中各稀釋梯度的反應性的圖。
圖9是表示抗卵白蛋白MAb對本發明(卵清蛋白變應原)的試驗3中各稀釋梯度的反應性的圖。
圖10是通過夾層ELISA，表示本發明(卵清蛋白變應原)的PNOM1和PNOM2對變性/未變性卵類粘蛋白的反應性的圖。
圖11是通過夾層ELISA，表示本發明(卵清蛋白變應原)的PDOM1和PDOM2對變性/未變性卵類粘蛋白的反應性的圖。
圖12是表示本發明(卵清蛋白變應原)的PNOM2和PDOM2以及PNOM1和PDOM1對變性/未變性卵類粘蛋白的反應性的圖。
圖13是使用本發明(小麥變應原)的兩種抗麥醇溶蛋白MAb對各種狀態的麥醇溶蛋白的反應的夾層ELISA結果圖。
圖14是表示本發明(小麥變應原)的PGL1和PGL2所識別的小麥麥醇溶蛋白的構成蛋白質的差異的圖。
圖15是通過夾層ELISA，表示本發明(蕎麥變應原)的PBW2和PBW3對各種蕎麥粗蛋白的反應性的圖。
圖16是通過夾層ELISA，表示本發明(蕎麥變應原)的PBW1和PBW2對各種蕎麥粗蛋白的反應性的圖。
圖17是通過夾層ELISA，表示本發明(蕎麥變應原)的PBW1、PBW2和PBW3的MAb混合系對未變性蕎麥粗蛋白的反應性的圖。
圖18是通過夾層ELISA，表示本發明(蕎麥變應原)的PBW1、PBW2和PBW3的MAb混合系對變性蕎麥粗蛋白的反應性的圖。
圖19是通過夾層ELISA，表示本發明(花生變應原)的PAh1-1、PAh1-2對各種花生粗蛋白的反應性的圖。
圖20是通過夾層ELISA，表示本發明(花生變應原)的PAh1-2和PAh1-3對各種花生粗蛋白的反應性的圖。
圖21是通過夾層ELISA，表示本發明(花生變應原)的PAh1-1、PAh1-2和PAh1-3的MAb混合系對未變性花生粗蛋白的反應性的圖。
圖22是過夾層ELISA，表示本發明(花生變應原)的PAh1-1、PAh1-2和PAh1-3的MAb混合系對變性花生粗蛋白的反應性的圖。
實施發明的最佳方式本發明的食品中的變應原的檢測方法是使用識別未變性和變性的乳變應原、未變性和變性的卵清蛋白變應原、未變性和變性的小麥變應原、未變性和變性的蕎麥變應原、或者未變性和變性的花生變應原的各兩種或以上單克隆抗體進行的變應原的檢測方法，只要是以αs1酪蛋白的主要蛋白質αs1酪蛋白、乳清的主要蛋白質β乳球蛋白、卵清蛋白的主要蛋白質卵白蛋白和卵類粘蛋白、小麥的主要蛋白質麥醇溶蛋白、蕎麥的主要蛋白質——分子量24kDa和76kDa的蛋白質、或花生的主要蛋白質Ara h1為指標的、食品等中所含的變應原的檢測方法即可，沒有特別限定。
本發明的乳變應原的檢測方法只要是將識別未變性乳變應原的單克隆抗體和識別變性乳變應原的單克隆抗體結合使用的乳變應原的免疫學檢測方法即可，沒有特別限定，另外本發明的乳變應原檢測試劑盒只要是具備識別未變性乳變應原的單克隆抗體、識別變性乳變應原的單克隆抗體，在將識別未變性乳變應原的單克隆抗體和識別變性乳變應原的單克隆抗體結合使用的條件下使用的免疫學變應原檢測試劑盒即可，沒有特別限定，但優選具備分別識別不同表位的2種或以上的單克隆抗體作為識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體。所述識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體，可具體例如抗αs1酪蛋白單克隆抗體或抗β乳球蛋白單克隆抗體。這里，“乳變應原”是指含有乳酪蛋白的主要蛋白質αs1酪蛋白和/或乳清的主要蛋白質β乳球蛋白的物質。
上述抗αs1酪蛋白單克隆抗體可以是識別未變性αs1酪蛋白、尿素處理αs1酪蛋白、未變性酪蛋白鈉和變性酪蛋白鈉的抗αs1酪蛋白單克隆抗體，優選例如識別SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白的氨基酸序列中從第132號-第193號的區域的單克隆抗體，具體來說，優選例如雜交瘤(FERM ABP-10263)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN1、雜交瘤(FERM ABP-10264)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN2等。將Pas1CN1和Pas1CN2組合，可特別有利于進行夾層ELISA或免疫色譜。例如，使用這些抗體，通過夾層ELISA，可以在10-1000ppb的濃度范圍內對食品中的未變性αs1酪蛋白和尿素處理αs1酪蛋白進行定性且定量的分析。
上述抗β乳球蛋白單克隆抗體可以是識別未變性β乳球蛋白、尿素處理β乳球蛋白、還原羧甲基化β乳球蛋白的抗β乳球蛋白單克隆抗體，具體可優選例如雜交瘤(FERM ABP-10281)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PLG1、雜交瘤(FERM ABP-10282)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PLG2、雜交瘤(FERM ABP-10283)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PLG3等。另外，通過將PLG2和PLG1、PLG2和PLG3、PLG2和PLG1和PLG3組合，可特別有利于進行夾層ELISA或免疫色譜。例如使用這些抗體，通過夾層ELISA，可以在30-1000ppb的濃度范圍內對食品中的未變性β乳球蛋白和尿素處理β乳球蛋白進行定性且定量的分析。
本發明的乳變應原的檢測方法中，優選使用尿素和2-巰基乙醇從檢樣中萃取酪蛋白和/或乳清蛋白，還優選使用識別未變性酪蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性酪蛋白的1種或多種單克隆抗體，以及識別未變性β乳球蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性β乳球蛋白的1種或多種單克隆抗體。本發明的乳變應原檢測試劑盒中，優選含有用于萃取酪蛋白和/或乳清蛋白的尿素和2-巰基乙醇，還優選具備識別未變性酪蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性酪蛋白的1種或多種單克隆抗體，以及識別未變性β乳球蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性β乳球蛋白的1種或多種單克隆抗體。
作為本發明的卵清蛋白變應原的檢測方法，只要是將識別未變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體和識別變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體結合使用的卵清蛋白變應原的免疫學檢測方法即可，沒有特別限制，另外本發明的卵清蛋白變應原檢測試劑盒只要是具備識別未變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體和識別變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體，在將識別未變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體和識別變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體結合使用的條件下使用的免疫學變應原檢測試劑盒即可，沒有特別限定，優選具備識別分別不同的表位的2種或以上的單克隆抗體，作為識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體。所述識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體可具體例如抗卵白蛋白單克隆抗體或抗卵類粘蛋白單克隆抗體。這里“卵清蛋白變應原”是指含有卵清蛋白的主要蛋白質卵白蛋白和/或卵類粘蛋白的物質。
上述抗卵白蛋白單克隆抗體優選為識別未變性卵白蛋白和/或還原羧甲基化卵白蛋白的抗卵白蛋白單克隆抗體，具體例子有雜交瘤(FERM ABP-10265)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA1、雜交瘤(FERM ABP-10266)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA2、雜交瘤(FERM ABP-10275)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA1、雜交瘤(FERM ABP-10276)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA2等。通過PNOA1和PNOA2等抗未變性卵白蛋白單克隆抗體、或者PDOA1和PDOA2等抗變性卵白蛋白單克隆抗體的組合，特別是將PNOA1和PNOA2等抗未變性卵白蛋白單克隆抗體與PDOA1和PDOA2等抗變性卵白蛋白單克隆抗體組合，可特別有利于進行夾層ELISA或免疫色譜。例如，使用這些抗體，通過夾層ELISA，可以在1.0-10.0ppb的濃度范圍內對食品中的未變性卵白蛋白和/或變性卵白蛋白進行定性且定量的分析。
上述抗卵類粘蛋白單克隆抗體可例如識別未變性卵類粘蛋白和/或尿素變性卵類粘蛋白的抗卵類粘蛋白單克隆抗體，具體例子有雜交瘤(FERM ABP-10279)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM1、雜交瘤(FERM ABP-10280)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM2、雜交瘤(FERM ABP-10277)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM1、雜交瘤(FERM ABP-10278)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM2等。通過PNOM1和PNOM2等抗未變性卵類粘蛋白單克隆抗體、或者PDOM1和PDOM2等抗變性卵類粘蛋白單克隆抗體的組合，特別是通過將PNOM1和PNOM2等抗未變性卵類粘蛋白單克隆抗體與PDOM1和PDOM2等抗變性卵類粘蛋白單克隆抗體組合，可特別有利于進行夾層ELISA或免疫色譜。例如，使用這些抗體，通過夾層ELISA，可以在10-100ppb的濃度范圍內對食品中的未變性卵類粘蛋白和/或變性卵類粘蛋白進行定性且定量的分析。
本發明的卵清蛋白蛋白變應原的檢測方法中，優選使用尿素和2-巰基乙醇對卵白蛋白和/或卵類粘蛋白進行萃取，還優選使用識別未變性卵白蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性卵白蛋白的1種或多種單克隆抗體，以及識別未變性卵類粘蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性卵類粘蛋白的1種或多種單克隆抗體。本發明的卵清蛋白蛋白變應原檢測試劑盒中，優選含有用于萃取卵白蛋白和/或卵類粘蛋白的尿素和2-巰基乙醇，還優選具備識別未變性卵白蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性卵白蛋白的1種或多種單克隆抗體，以及識別未變性卵類粘蛋白的1種或多種單克隆抗體和識別變性卵類粘蛋白的1種或多種單克隆抗體。
本發明的小麥變應原的檢測方法只要是使用識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體進行的小麥變應原的免疫學檢測方法，或者是識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白、且將識別不同表位的兩種抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體結合使用的小麥變應原的免疫學檢測方法即可，沒有特別限制，本發明的小麥變應原檢測試劑盒只要是具備識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體的免疫學變應原檢測試劑盒，或者是具備識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白、且識別不同表位的兩種抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體的免疫學變應原檢測試劑盒即可，沒有特別限制，上述抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體優選為識別未變性小麥麥醇溶蛋白、還原羧甲基化小麥麥醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麥麥醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麥麥醇溶蛋白、以及變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體，具體例子有雜交瘤(FERM ABP-10267)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL1、雜交瘤(FERM ABP-10268)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL2等。將這些抗體組合，特別有利于進行夾層ELISA或免疫色譜。例如通過夾層ELISA，可以在10-100ppb的濃度范圍內對食品中的未變性小麥麥醇溶蛋白、還原羧甲基化小麥麥醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶的小麥麥醇溶蛋白、70％乙醇增溶的小麥麥醇溶蛋白、和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白進行定性且定量的分析。
本發明的蕎麥變應原的檢測方法只要是使用識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體進行的蕎麥變應原的免疫學檢測方法，或者是將識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白、且識別不同表位的兩種抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體結合使用的蕎麥變應原的免疫學檢測方法即可，沒有特別限制，本發明的蕎麥變應原檢測試劑盒只要是具備識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體的免疫學變應原檢測試劑盒，或者是具備識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白、且識別不同表位的2種抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體的免疫學變應原檢測試劑盒即可，沒有特別限制，抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體優選識別24kDa蛋白質和加熱變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體、或者識別76kDa蛋白質和未變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體，具體例子有雜交瘤(FERM ABP-10272)生成的抗24kDa蛋白質單克隆抗體PBW1、雜交瘤(FERM ABP-10273)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW2、雜交瘤(FERM ABP-10274)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW3等。通過PBW1等識別24kDa蛋白質和加熱變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體和PBW2等識別76kDa蛋白質和未變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體的組合，或者PBW2和PBW3等均識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體的組合，其中，以這些單克隆抗體的混合系的形式的組合，特別有利于進行夾層ELISA或免疫色譜。例如通過夾層ELISA，可在10-1000ppb的濃度范圍內對未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白進行定性且定量的分析。
本發明的蕎麥變應原的檢測方法中，優選使用尿素和2-巰基乙醇從檢樣中萃取加熱變性蕎麥粗蛋白，本發明的蕎麥變應原檢測試劑盒優選具備尿素和2-巰基乙醇，以作為從檢樣中萃取蕎麥粗蛋白的萃取劑。
本發明的花生變應原的檢測方法只要是使用識別未變性花生Arah1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質的抗Ara h1蛋白質單克隆抗體進行的花生變應原的免疫學檢測方法，或者是將識別未變性花生Arah1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質、且識別不同表位的2種抗Ara h1蛋白質單克隆抗體結合使用的花生變應原的免疫學檢測方法即可，沒有特別限定，本發明的花生變應原檢測試劑盒只要是具備識別未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質的抗花生Arah1蛋白質單克隆抗體的免疫學變應原檢測試劑盒，或者是具備識別未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質、且識別不同表位的2種抗花生Ara h1蛋白質單克隆抗體的免疫學變應原檢測試劑盒即可，沒有特別限定，抗Ara h1蛋白質單克隆抗體優選識別未變性Arah1蛋白質和未變性花生粗蛋白、和/或尿素處理的Ara h1蛋白質和尿素處理的花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白質單克隆抗體，具體例子有雜交瘤(FERM ABP-10269)生成的抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-1、雜交瘤(FERM ABP-10270)生成的抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-2、雜交瘤(FERM ABP-10271)生成的抗加熱變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-3等。通過PAh1-1等識別未變性Ara h1蛋白質和未變性花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白質單克隆抗體、和PAh1-2等識別未變性/變性Ara h1蛋白質和未變性/變性花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白質單克隆抗體的組合，或者PAh1-2和PAh1-3等識別未變性/變性Ara h1蛋白質和未變性/變性花生粗蛋白的抗Ara h1蛋白質單克隆抗體之間的組合，其中通過以這些單克隆抗體的混合系的形式的組合，特別有利于進行夾層ELISA或免疫色譜。例如通過夾層ELISA，可以在10-1000ppb的濃度范圍內對未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質進行定性且定量的分析。
本發明的花生變應原的檢測方法中，優選使用尿素和2-巰基乙醇從檢樣中萃取加熱變性花生粗蛋白，本發明的花生變應原檢測試劑盒優選具備尿素和2-巰基乙醇，以作為從檢樣中萃取加熱變性花生粗蛋白的萃取劑。
以上本發明的免疫學變應原檢測方法包含以下階段將含有未變性/變性的乳變應原、未變性和變性的卵清蛋白蛋白變應原、未變性和變性的小麥變應原、未變性和變性的蕎麥變應原、或未變性和變性的花生變應原(以下可稱為“食物變應原”)的試樣與標記的抗食物變應原MAb接觸，或者在標記抗體存在下與食物變應原MAb接觸，通過抗原抗體反應，標記免疫復合物的形式捕捉的免疫反應階段；使用存在于該分子中的標記物質對生成的該免疫復合物進行分離·測定的檢測階段，所述免疫反應階段中的抗原抗體反應方法沒有特別限定，例如有以下方法。
將試樣中的食物變應原捕捉到與不溶性載體結合的本發明的抗食物變應原Mab上，然后與標記抗IgG抗體反應的夾層法；使用標記抗食物變應原MAb(第二抗體)的夾層雙抗法，其中所述第二抗體識別與抗食物變應原MAb不同的表位，所述抗食物變應原Mab與不溶性載體結合；在標記抗原存在下，使與不溶性載體結合的抗食物變應原Mab與試樣中的食物變應原反應的競爭法；使含有食物變應原的試樣和與其特異性反應的磁珠結合標記抗食物變應原MAb作用，然后通過磁力進行分離的檢測免疫復合物中的標記物質的磁珠法；使含有食物變應原的試樣和與其特異性反應的標記抗食物變應原MAb作用，凝集沉淀，然后通過離心進行分離的檢測免疫復合物中的標記物質的凝集沉淀法；用膠體金等標記的抗食物變應原MAb與作為食物變應原的蛋白質結合，所得抗原抗體復合物通毛細管現象等在測試條上移動，在這個過程中，預先將與食物變應原結合的抗食物變應原MAb固定，通過捕捉抗原抗體復合物而出現染色條帶，通過該染色條帶的有無進行定性分析的免疫色譜法；除此之外還可利用雙重免疫擴散法、放射免疫擴散法等公知的免疫測定法，優選使用分別識別不同的表位的2種或以上單克隆抗體作為抗食物變應原MAb的方法，例如從可在100-1000ppb的濃度范圍內對食品中的未變性變應原和/或變性變應原進行定性且定量分析的高靈敏度方面考慮，優選夾層雙抗法，從定性簡便性考慮，優選免疫色譜法。另外，從肉食制品等食品試樣中萃取變應原時，優選使用尿素和2-巰基乙醇。
上述抗原抗體反應中使用的不溶性載體例如有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯葡聚糖、多糖等高分子化合物，其它有玻璃、金屬、磁性顆粒及它們的組合等，不溶性載體的形狀例如可使用托盤狀、球狀、纖維狀、棒狀、盤狀、容器狀、胞狀、微孔板狀、試管、膠乳珠狀等各種形狀。抗原或抗體向這些不溶性載體上固體的方法沒有特別限定，可以使用物理吸附法、共價鍵法、離子鍵法等。
本發明的食物變應原檢測方法或食物變應原檢測試劑盒中所使用的抗食物變應原MAb的免疫球蛋白的類和型沒有特別限定，抗食物變應原MAb優選使用IgG類κ型的抗體。單克隆抗體的形式可以采用完整抗體或F(ab’)2、Fab等片段。抗體的來源沒有特別限定，可以是小鼠、大鼠、人、兔、雞等。從制備的簡便性考慮，優選使用來自小鼠的單克隆抗體。抗食物變應原MAb可如下制備用未變性或變性的αs1酪蛋白免疫動物，將從中采集的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，將制備的雜交瘤在培養基上培養，或者施用于動物腹腔內，在腹水內增殖，然后從該培養物或腹水中采集。
生成抗食物變應原Mab的雜交瘤可如下制備例如使用未變性和/或變性的食物變應原免疫BALB/c小鼠，將免疫小鼠的抗體生成細胞與小鼠雜交瘤細胞按照常規方法進行細胞融合，通過免疫熒光染色圖譜進行篩選，制備生成抗食物變應原Mab的雜交瘤。上述抗體生成細胞可以是例如施用未變性和/或變性的食物變應原或含有該變應原的組合物，從免疫動物得到的脾臟細胞、淋巴結細胞、B-淋巴細胞等。免疫動物有小鼠、大鼠、兔、馬等。免疫可如下進行例如將未變性和/或變性的食物變應原直接或與適當的佐劑一起施用于動物的皮下、肌肉或腹腔內，以1-2次/月、1-6個月的頻率和期間施用。抗體生成細胞的分離可通過從最終免疫2-4天后的免疫動物中采集。骨髓瘤細胞可使用來自小鼠、大鼠的骨髓瘤細胞等。優選抗體生成細胞和骨髓瘤細胞來自同種動物。
細胞融合可如下進行例如在Dulbecco’s改良eagle培養基(DMEM)等培養基中、在聚乙二醇等融合促進劑存在下，將抗體生成細胞和骨髓瘤細胞混合。細胞融合結束后，用DMEM等適當稀釋、離心，將沉淀懸浮于HAT培養基等選擇性培養基中進行培養，選擇雜交瘤，接著使用培養上清，通過酶抗體法選擇生成抗體的雜交瘤，通過有限稀釋法等進行克隆，可得到生成抗食物變應原MAb的雜交瘤。另外也可以從只使用αs1酪蛋白等未變性的食物變應原進行免疫的抗免疫動物中有效地得到抗變性食物變應原MAb。此時，可以篩選抗變性αs1酪蛋白MAb等生成抗變性食物變應原Mab的雜交瘤，或者通過固相狀態的ELISA，選擇生成抗未變性的αs1酪蛋白等未變性食物變應原的單克隆抗體的雜交瘤，從該生成抗體的雜交瘤所生成的單克隆抗體中，可以得到只在液相狀態下與未變性的食物變應原特異性反應的抗食物變應原MAb。如上所述，可以將生成抗體的雜交瘤在培養基中或生物體內培養，從培養物中采集單克隆抗體，不過從培養物或腹水中分離·純化單克隆抗體的方法只要是蛋白質純化常用的方法即可，可以是任何方法，例如可以通過IgG純化中通常使用的硫酸銨分離法、陰離子交換物或蛋白A、G等的柱層析法進行。
另外，標記抗體制備中所使用的標記物只要是通過單獨或與其它物質反應產生可檢測的信號的標記物即可，可以使用酶、熒光物質、化學發光物質、放射性物質、膠體金等，酶有過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖過氧化物酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、青霉素酶、過氧化氫酶、脫輔基葡糖氧化酶(アポグルコ-スオキシダ-ゼ)、脲酶、螢光素酶或乙酰膽堿酯酶等，熒光物質有熒光素異硫氰酸酯、藻膽蛋白、稀土金屬螯合物、丹磺酰氯或四甲基羅丹明異硫氰酸酯等，發光物質有魯米諾類、ジオキセタン、吖啶鹽類等，放射性物質有3H、14C、125I或131I等。標記物質為酶時，為測定其活性，可以使用底物、根據需要使用顯色劑、熒光劑、發光劑等。
本發明的食物變應原檢測試劑盒含有作為有效成分的抗食物變應原MAb，優選分別識別不同的表位的2種或以上的抗食物變應原MAb，從保存穩定性角度考慮，與溶液狀態相比，優選以凍干物的形式保存，檢測試劑盒除含有所述抗食物變應原MAb溶解所需的緩沖液或培養液之外，還可以含有用于制備試樣的緩沖液等。更優選的本發明抗食物變應原檢測試劑盒方案是上述免疫色譜法中的測試條。這種情況下，優選將識別不同表位的兩種單克隆抗體的至少一種制成免疫色譜中使用的膠體金標記的單克隆抗體。
本發明的單克隆抗體有雜交瘤(FERM ABP-10263)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN1、雜交瘤(FERM ABP-10264)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN2、雜交瘤(FERM ABP-10281)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PLG1、雜交瘤(FERM ABP-10282)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PLG2、雜交瘤(FERM ABP-10283)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PLG3、雜交瘤(FERM ABP-10265)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA1、雜交瘤(FERM ABP-10266)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA2、雜交瘤(FERM ABP-10275)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA1、雜交瘤(FERM ABP-10276)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA2、雜交瘤(FERM ABP-10279)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM1、雜交瘤(FERM ABP-10280)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM2、雜交瘤(FERM ABP-10277)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM1、雜交瘤(FERM ABP-10278)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM2、雜交瘤(FERM ABP-10267)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL1、雜交瘤(FERM ABP-10268)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL2、雜交瘤(FERM ABP-10272)生成的抗24kDa蛋白質單克隆抗體PBW1、雜交瘤(FERM ABP-10273)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW2、雜交瘤(FERM ABP-10274)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW3、雜交瘤(FERM ABP-10269)生成的抗未變性Arah1蛋白質單克隆抗體PAh1-1、雜交瘤(FERM ABP-10270)生成的抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-2、雜交瘤(FERM ABP-10271)生成的抗加熱變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh 1-3，這些雜交瘤于2005年2月14日(領受日)被獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心( 305-5466日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第六)領受。上述Pas1CN1(FERM P-20206)、Pas1CN2(FERM P-20207)、PNOA1(FERM P-20208)、PNOA2(FERM P-20209)、PGL1(FERM P-20210)、PGL2(FERM P-20211)于2004年9月7日(受托日)保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄托中心。
以下通過實施例更具體的說明本發明，本發明的技術范圍并不受這些舉例的限定。
實施例11.抗αs1酪蛋白單克隆抗體的確立1-1材料和方法1)αs1酪蛋白(以下稱為“αCN”)的制備按照Zittle(1959)的方法，從新鮮的牛乳中得到αCN的粗組分。再使用TSK凝膠DEAE 650S(TOSOH)，通過含有50mM咪唑-HCl緩沖液(pH 6.4)、4M尿素的NaCl線性梯度(0-0.3M)，對該粗組分進行純化。將純化的αCN組分用蒸餾水進行透析，然后冷凍干燥。用生理鹽水制成該凍干物的0.1％溶液，分別以500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，在免疫之前在-20℃冷凍保存，作為抗原溶液。
2)免疫使用5只6周齡的BALB/c小鼠(日本クレア株式會社)作為供試動物。初次免疫時，將完全弗氏佐劑(Difco制造)等量加入到裝有500μl0.1％的αCN的Eppendorf管中，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。另外以3周的間隔進行兩次追加免疫。免疫時，將不完全弗氏佐劑(Difco)等量加入到裝有500μl 0.1％的αCN的Eppendorf管中，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。
3)血液中抗體效價的測定在初次或追加免疫中，在注射αCN一周后，從各BALB/c小鼠的尾部靜脈采血。采集的血液在室溫下放置兩小時，然后離心，得到血清。制備這些血清的10倍稀釋梯度，通過非競爭法ELISA，檢測小鼠血液中的抗αCN抗體效價。二次抗體采用堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。
4)雜交瘤的制備雜交瘤的制備按照Khler和Milstein的方法(1975)進行。即，對抗體效價充分提高的小鼠由尾部靜脈注射100μl 0.1％αCN溶液。靜脈注射4天后，從小鼠體內無菌摘除脾臟。將脾臟切細后，用RPMI1640清洗，過滅菌尼龍網(細胞篩網，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾細胞懸浮液。通過1000rpm×10分鐘的離心，收集脾細胞，再次懸浮于RPMI1640，進行細胞計數。將該脾細胞懸浮液和骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653)懸浮液按照細胞數10∶1混合，再次進行1000rpm×10分鐘的離心，得到顆粒。向該顆粒中滴加平均分子量為3,350的45％聚乙二醇，進行細胞融合。向細胞溶液中加入RPMI1640，稀釋后通過離心得到顆粒。向該顆粒中加入HAT選擇性培養基，分注到24孔細胞培養板(Becton Dickinson)中，使細胞數為5×106個細胞/孔，在5％CO2下、在37℃培養。其中所述HAT選擇性培養基是雜交瘤用培養基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素等RPMI1640培養基)中加入100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培養基。
5)有限稀釋法克隆將細胞培養板各孔的培養上清作為ELISA的一次抗體用于試驗，測定生成抗αCN抗體的雜交瘤的存在。將ELISA測定中對αCN顯示陽性的孔的雜交瘤轉移到96孔細胞培養板(Becton Dickinson)，使細胞數為0.9個細胞/孔，進行有限稀釋法克隆。將4周齡BALB/c小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，以5×106個細胞/孔加入到96孔細胞培養板的各孔中。克隆的雜交瘤的培養使用含有10％胎牛血清、40mM2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基。
6)抗體的篩選單克隆抗體的篩選通過檢測對未變性αCN(以下稱為“N-αCN)”、尿素處理αCN(以下稱為“D-αCN”)、市售的酪蛋白鈉的未變性物(以下稱為“N-CN”)或市售的酪蛋白鈉的尿素處理物(以下稱為“D-CN”)四種蛋白質的反應性的不同來得到特異性不同的克隆。D-αCN如下獲得稱量1mg純化αCN，加入100μl 5％EDTA、6.0g尿素、0.2ml 2-巰基乙醇、1ml 50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.6)、1.5ml蒸餾水，用鋁箔覆蓋，在100℃油浴中加熱1小時，進行變性處理。培養上清對N-αCN、D-αCN、N-CN或D-CN的反應性通過非競爭法ELISA檢測。
7)腹水的采集和MAb的純化按照Jones等人(1990)的方法，首先對BALB/c小鼠腹腔內注射0.2ml不完全弗氏佐劑。一周后，對每只小鼠接種5×106個細胞的克隆的雜交瘤。腹水潴留后，用針筒采集腹水。通過蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)對采集的腹水進行純化。
8)MAb的類、亞類和型通過Monoclonal mouse immunoαC N obulin isotyping kit(Pharmingen)，MAb的類和亞類確定為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。
9)MAb的生物素化將純化的Mab用于夾層ELISA，分別進行生物素化處理。用50mM的碳酸緩沖液(pH 8.5)制成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，攪拌，然后一邊冰冷卻一邊靜置2小時。然后用PBS置換為20mg/ml。
1-2結果1)MAb的選擇得到了6種特異性識別乳的主要變應原αs1酪蛋白(αCN)的MAb。通過直接ELISA檢測這6種MAb對于分別制成固相的各抗原N-αCN、D-αCN、N-CN、或D-CN的特異性。還對這些MAb的類、亞類進行了檢測。結果如表1所示。表1中，+表示對各固相抗原為陽性，-表示陰性。如表1所示，選擇出與所有狀態的抗原結合的MAb——Pas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3。


2)夾層ELISA中的組合條件使用通過直接ELISA選擇的Pas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3，對全部的MAb的組合進行夾層ELISA。將Pas1CN1、Pas1CN2、Pas1CN3分別制成固相或生物素化抗體，通過夾層ELISA選出了用于檢測αCN或CN的MAb的組合。結果選擇出Pas1CN1(FERM ABP-10263)和Pas1CN2(FERM ABP-10264)作為可以檢測N-αCN、D-αCN、N-CN、D-CN的組合。結果如圖1所示。
2.Pas1CN1、Pas1CN2所識別的表位將αs1酪蛋白溶液用賴氨酰內切蛋白酶分解，通過トリミン-SDS-PAGE(16.5％分離凝膠、5％濃縮凝膠)分離分解物。使用分離的凝膠，通過電印跡轉印PVDF膜。將Pas1CN1和Pas1CN2的培養上清(1/1000)與轉印的PVDF膜反應，然后顯色，確認所識別的表位。結果如圖2所示。結果，Pas1CN1和Pas1CN2均識別分子量約7000、SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白氨基酸序列第132號-193號的區域。
3.通過夾層ELISA檢測食品中變性或未變性酪蛋白通過上述1中選擇的Pas1CN1和Pas1CN2的組合，嘗試檢測實際食品中的酪蛋白。
3-1材料和方法
1)模型肉食制品的制備選擇肉食制品作為定量試驗的模型食品，按照表2所示的配比制備含有各濃度酪蛋白鈉的模型肉食制品。豬瘦肉是從豬上等肉中除去脂肪、筋，制成5mm絞肉使用。
模型肉食制品的配比表

按照各配比稱量添加物，用食品加工機混合，進行氯乙烯管的填充，在75℃加熱30分鐘。
2)通過夾層ELISA進行定量分析將各模型肉食制品用食物處理機均勻磨碎，作為分析用樣品。稱量2g樣品，加入38g含有1M尿素和0.1％2-巰基乙醇的PBST，在100℃進行1小時加熱處理。冷卻后，進行3,000rpm×20分鐘的離心，向0.5ml上清中加入9.5ml PBST，作為ELISA用樣品。校正曲線使用同樣進行了尿素、2-巰基乙醇處理的酪蛋白鈉的梯度稀釋品。與用PBST從分析樣品中進行萃取、使用溶解于PBST(向PBS中加入0.5％聚氧乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯)的酪蛋白鈉作為校正曲線、但不使用尿素和2-巰基乙醇的情況進行比較。
3-2結果關于通過夾層ELISA對模型肉食制品中的酪蛋白鈉進行的分析，使用尿素和2-巰基乙醇的結果如表3所示，只用PBST萃取的結果如表4所示。


*1(分析值/添加量)×100*2未檢出[表4]

*1(分析值/添加量)×100*2未檢出由以上結果可知將尿素和2-巰基乙醇加入到萃取液中時，可以以高回收率檢測模型肉食制品中的酪蛋白鈉，而用PBST萃取則回收率非常低。由此可知使用尿素和2-巰基乙醇對從食品中萃取酪蛋白鈉非常有效，這種情況下可利用的MAb的特性必須是可以與尿素增溶的酪蛋白結合。
4.通過免疫色譜檢測變性和未變性酪蛋白鈉4-1材料和方法1)膠體金標記和結合墊的制備用2mM硼酸緩沖液(pH 9.0)制備成1mg/ml Pas1CN1的MAb溶液。向5ml預先用0.2M碳酸鉀溶液制備成pH 9.0的膠體金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室溫下反應30分鐘，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反應15分鐘。進行離心，用1％BSA溶制成OD525＝1.0。在玻璃纖維制的結合墊上涂布成68μl/cm2，進行干燥。
2)抗體固定化膜的制備用PBS制成4mg/ml的Pas1CN2的MAb溶液，呈直線狀涂布于硝基纖維素膜上，干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐溫20的PBS、在37℃封閉2小時，然后用PBS清洗，干燥。
3)免疫色譜條的組裝和評價分別貼裝上述制備的樣品墊、結合墊、抗體固定化膜、吸收墊，制成免疫色譜條。將上述制備的模型肉食制品進行適當稀釋，作為被檢液使用。
4-2結果通過Pas1CN2和膠體金標記Pas1CN1的組合，無論酪蛋白鈉加熱或非加熱，都可以以最低50ppb(食品中2ppm)檢測。該結果表明，不管是以制造工藝中混入的未變性酪蛋白鈉為對象，還是以加熱后的制品為對象，可以設計出在任何情況下都可以應對的免疫色譜條。
作為對照，在市售的變應原檢測用免疫色譜條中滴加只含有0.01M尿素的PBS，此時產生非特異性條帶，為假陽性。這表明如果不使用蛋白質變性劑，那么可作為變應原檢測的對象可能被限制在極狹窄的范圍內。其中所述蛋白質變性劑用于有效從因加熱等而變性的食品蛋白質中萃取變應原。
5.抗β乳球蛋白單克隆抗體的確立5-1材料和方法1)β乳球蛋白(以下可稱為“βLG”)的制備按照Zittle(1959)的方法，從新鮮的牛乳中得到乳清的粗組分。再使用TSK凝膠DEAE 650S(TOSOH)，通過50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 6.5)、NaCl的線性梯度(0-0.4M)對該粗組分進行純化。通過蒸餾水對該純化的βLG組分進行透析，然后冷凍干燥，制成未變性βLG(以下可稱為“N-βLG”)。稱量10mg該N-βLG，加入1ml 1.4M的Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、100μl 5％EDTA、1.2g尿素、33μl 2-巰基乙醇，定容為2.5ml，然后進行氮氣置換，在37℃進行1小時的還原處理，再加入89mg溶解于300μl 1M NaOH的一碘乙酸，用氮氣置換，然后在室溫下進行1小時的羧甲基化，制成還原羧甲基化βLG(以下可稱為“R-βLG”)。用生理鹽水將這些凍干物制成0.1％的溶液，分別以500μl分注于1ml容量的Eppendorf管中，在進行免疫之前在-20℃冷凍保存，作為抗原溶液。
2)免疫使用5只5周齡的BALB/c小鼠作為供試動物。初次免疫時，向裝有500μl 0.1％N-βLG或R-βLG的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。追加免疫以2周的間隔進行3次。免疫是將不完弗氏佐劑(Difco)等量加入裝有500μl 0.1％N-βLG或R-βLG的Eppendorf管中，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。
3)血液中抗體效價的測定在初次或追加免疫中，在注射N-βLG或R-βLG一周后，分別從各BALB/c小鼠的尾部靜脈采血。采集的血液在室溫下放置2小時，然后進行離心，得到血清。制備這些血清的10倍稀釋梯度，通過非競爭法ELISA，測定小鼠血液中抗N-βLG抗體效價和抗R-βLG抗體效價。二次抗體采用堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(JacksonImmunoReserch Laboratories Inc.)。
4)雜交瘤的制備雜交瘤的制備按照Khler和Milstein的方法(1975)進行。即，對抗體效價充分提高的小鼠由尾部靜脈注射100μl 0.1％N-βLG溶液或R-βLG溶液。靜脈注射4天后，從小鼠體中無菌摘除脾臟。將脾臟切細，然后用RPMI1640清洗，過無菌尼龍網(細胞篩網，70mm，BectonDickinson)，得到脾細胞懸浮液。通過1,000rpm×10分鐘的離心，收集脾細胞，再懸浮于RPMI1640，計數細胞數。將該脾細胞懸浮液和小鼠骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653)懸浮液按照細胞數10∶1混合，再次進行1,000rpm×10分鐘的離心，得到顆粒。向該顆粒中滴加平均分子量為3,350的45％聚乙二醇，進行細胞融合。向細胞溶液中加入RPMI1640，稀釋，通過離心制成顆粒。向該顆粒中加入HAT選擇培養基，以5×106個細胞/孔分注到24孔細胞培養板上(Becton Dickinson)，在5％CO2下、在37℃培養。其中所述HAT選擇培養基是雜交瘤用培養基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基)中加入100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培養基。
5)有限稀釋法克隆將細胞培養板各孔的培養上清作為ELISA的一次抗體用于試驗，檢測生成抗N-βLG或抗R-βLG抗體的雜交瘤的存在。將通過ELISA對N-βLG或R-βLG顯示陽性的孔的雜交瘤轉移到96孔細胞培養板(Becton Dickinson)，形成0.9個細胞/孔，進行有限稀釋法克隆。另外將4周齡BALB/c小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，以5×106個細胞/孔加入到96孔細胞培養板的各孔中。克隆的雜交瘤的培養使用含有10％胎牛血清、40mM2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基進行。
6)抗體的篩選單克隆抗體的篩選通過檢測對N-βLG、R-βLG和尿素處理βLG(以下稱為“D-βLG”)三種蛋白質的反應性的不同來獲得特異性不同的克隆。D-βLG如下制備稱量1mg N-βLG，加入6.0g尿素、0.2ml 2-巰基乙醇，1ml 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、1.5ml蒸餾水，用鋁箔覆蓋，然后在100℃的油浴中加熱1小時，進行變性處理。通過非競爭法ELISA，檢測培養上清對N-βLG、R-βLG或D-βLG的反應性。
7)腹水的采集和MAb的純化按照Jones等的方法(1990)，首先向BALB/c小鼠腹腔內注射0.2ml不完全弗氏佐劑。一周后，對每只小鼠接種5×106個細胞的克隆雜交瘤。腹水潴留后，通過針筒采集腹水。通過蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)對采集的腹水進行純化。
8)MAb的類、亞類和型為了確定抗N-βLG MAb或抗R-βLG MAb的特性，采用固相法。固相法是將N-βLG、R-βLG或D-βLG預先固定于細胞培養板的孔內，使抗N-βLG MAb或抗R-βLG MAb作用于該固定化抗原的方法。通過Monoclonal mouse immunoαC N obulin isotyping kit(Pharmingen)，MAb的類和亞類確定為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。
9)MAb的生物素化為了用于夾層ELISA，分別將純化的MAb進行了生物素化處理。用50mM的碳酸緩沖液(pH 8.5)制備成20mg/ml，加入10μl以3mg/100ml溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，攪拌，然后一邊冰冷卻一邊靜置2小時。然后用PBS置換成20mg/ml。
5-2結果1)抗N-βLG MAb和抗R-βLG MAb的特性和類、亞類得到了13種對N-βLG具有特異性的MAb。表5表示它們分別對固相抗原的特異性。


2)夾層ELISA中的組合條件將對固相抗原顯示陽性的各MAb分別制成固相或生物素化抗體，從夾層ELISA的檢測靈敏度考慮，選擇出用于檢測N-βLG和D-βLG的MAb的組合。結果，選擇出平板固定化抗體PLG2(FERM ABP-10282)、生物素化抗體PLG1(FERM ABP-10281)或PLG3(FERMABP-10283)作為可檢測N-βLG和D-βLG的組合。PLG2和PLG1對N-βLG和D-βLG的反應性的夾層ELISA結果如圖3所示。PLG2和PLG3對N-βLG和D-βLG的反應性的夾層ELISA結果如圖4所示。
3)通過MAb混合系檢測N-βLG、D-βLG使用通過夾層ELISA選擇的組合(固相化PLG2、生物素化PLG1和PLG3)確認N-βLG和D-βLG的檢測靈敏度，如圖5和圖6所示，MAb混合系中，MAb混合系對N-βLG、D-βLG的吸光值高，表明可以提高檢測靈敏度。
6.通過夾層ELISA檢測食品中的乳清蛋白通過上述1中選擇的PLG2和PLG1、以及PLG2和PLG3的組合，嘗試是否可以檢測實際食品中的乳清蛋白。
6-1材料和方法1)模型肉食制品的制備選擇肉食制品作為定量試驗的模型食品，按照表6所示的配比制備含有各濃度的乳清蛋白的模型肉食制品。豬瘦肉是從豬上等肉中去除脂肪、筋，制成5mm的絞肉使用。按照各配比稱量添加物，用食品加工機混合，然后進行氯乙烯管的充填，在75℃加熱30分鐘。


2)通過夾層ELISA進行定量分析將各模型肉食制品用食品加工機均勻磨碎，作為分析樣品。稱量1g樣品，加入19g含10M尿素和0.1％2-巰基乙醇的PBST(向PBS中加入0.5％聚氧乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯所得)，用勻漿器攪拌30秒，然后在100℃進行1小時加熱處理。冷卻后，進行3,000rpm×20分鐘的離心，向0.5ml上清中加入9.5ml PBST，用作ELISA樣品。校正曲線同樣使用經10M尿素和0.1％2-巰基乙醇處理的乳清蛋白的梯度稀釋品。還與用PBST從分析樣品中萃取、以溶解于PBST的乳清蛋白作為檢量線、不使用尿素和2-巰基乙醇的情況進行了比較。
6-2結果對于通過夾層ELISA對模型肉食制品中的乳清蛋白的分析，使用尿素和2-巰基乙醇萃取的模型肉食制品中的乳清蛋白分析結果如表7所示，僅用PBST萃取的模型肉食制品中的乳清蛋白分析結果如表8所示。


*1(分析值/添加量)×100*2未檢出[表8]

*1(分析值/添加量)×100*2未檢出以上結果可知將尿素和2-巰基乙醇加入到萃取液中時，可以以高回收率檢測模型肉食制品中的乳清蛋白，用PBST萃取則不能檢測。由此表明使用尿素和2-巰基乙醇對于從食品中萃取乳清蛋白是有效的，此時要利用的MAb的特性必須是可與尿素變性的βLG結合。
7.通過免疫色譜檢測變性和未變性酪蛋白鈉7-1材料和方法1)膠體金標記和結合墊的制備用2mM硼酸緩沖液(pH 9.0)制備成1mg/ml的PLG1和PLG3的MAb溶液。在5ml預先用0.2M碳酸鉀溶液制備成pH 9.0的膠體金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室溫下反應30分鐘，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反應15分鐘。進行離心，用1％BSA溶液制備成OD525＝2.0，以1∶1的比例混合。以68μl/cm2涂布于玻璃纖維制的結合墊上，進行干燥。
2)抗體固定化膜的制備用PBS制備成4mg/ml的PLG2的MAb溶液，呈直線狀涂布于硝基纖維素膜上，干燥。然后用含有1％BSA的10mM磷酸緩沖液(pH 7.5)在37℃封閉1小時，用10mM磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗，干燥。
3)免疫色譜條的組裝和評價分別貼裝上述制備的樣品墊、結合墊、抗體固定化膜、吸收墊，制成免疫色譜條。將上述2中制備的模型肉食制品適當稀釋，作為被檢液使用。
7-2結果通過涂布于膜上的MAb-PLG2和膠體金標記MAb——PLG1+PLG3的組合，不管乳清蛋白加熱或非加熱，都可以以最低50ppb(食品中的2ppm)檢測。該結果可知無論是以制造工藝中混入的乳清蛋白為對象，還是以加熱后的制品為對象，可以設計出在任何情況下都可以對應的免疫色譜條。
在市售的變應原檢測用免疫色譜條中，作為對照滴加含有0.1M尿素、0.2％2-ME的PBS時，會產生非特異性條帶，結果為假陽性。這表明如果不使用蛋白質變性劑，則可作為變應原檢測的對象被限制在極狹窄的范圍內，該蛋白質變性劑有效地從因加熱等而變性的食品蛋白質中萃取變應原。
實施例21.可與變性/未變性卵白蛋白結合的MAb的確立1-1材料和方法1)雞卵白蛋白(以下可稱為“OA”)的制備從新鮮的雞蛋中只取蛋白，勻漿至不發泡，然后加入等量的飽和硫酸銨，用濾紙No.1(アドバンテツク東洋)過濾。然后向得到的濾液中添加0.5M的硫酸，調節至pH 4.6，然后放置過夜。通過8,000rpm×20分鐘的離心得到沉淀，將沉淀溶解于蒸餾水，用相同方法重結晶，得到粗OA組分。粗OA再通過使用TSK凝膠DEAE 650S(Tosoh)的離子交換色譜進行純化。使用50mM咪唑-鹽酸緩沖液(pH 6.4)作為移動相，通過NaCl的0-0.3M的線性梯度分離OA，通過透析進行脫鹽，然后進行冷凍干燥。使用該冷凍干燥OA，用生理鹽水制備0.1％的OA溶液，分別將500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，作為抗原溶液，在免疫前在-20℃冷凍保存。
2)免疫使用4只6周齡的BALB/c小鼠(日本クレア株式會社)作為供試動物。初次免疫時，向加入有500μl 0.1％的OA的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。對每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液，另外追加免疫以每3周的間隔進行2次。免疫時，向加入有500μl 0.1％OA的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。向每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。要獲得抗變性OAMAb，則只在最終免疫時使用后述的還原羧甲基化OA。
3)血液中抗體效價的測定在初次或追加免疫中，在注射OA一周后，從各BALB/c小鼠的尾部靜脈采血。采集的血液在室溫下放置2小時，進行離心，得到血清。制備這些血清的10倍稀釋梯度，通過非競爭法ELISA檢測小鼠血液中的抗OA抗體效價。二次抗體采用堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。
4)雜交瘤的制備雜交瘤的制備按照Khler和Milstein的方法(1975)進行。即，對抗體效價充分提高的小鼠由尾部靜脈注射100μl 0.1％OA溶液。靜脈注射4天后，從小鼠體內無菌摘除脾臟。將脾臟切細后，用RPMI1640清洗，過滅菌尼龍網(細胞篩網，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾細胞懸浮液。通過1,000rpm×10分鐘的離心，收集脾細胞，再次懸浮于RPMI1640，計數細胞數。將該脾細胞懸浮液和小鼠骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653)懸浮液按照細胞數10∶1混合，再次以1,000rpm×10分鐘進行離心，得到顆粒。向該顆粒中滴加平均分子量為3,350的45％聚乙二醇，進行細胞融合。向細胞液中加入RPMI1640進行稀釋，然后離心得到顆粒。向該顆粒中加入HAT選擇培養基，以5×106個細胞/孔分注到24孔細胞培養板(Becton Dickinson)中，在5％CO2下、在37℃培養。其中所述HAT選擇培養基是在雜交瘤用培養基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基)中加入100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶所得培養基。
5)有限稀釋法克隆將細胞培養板各孔的培養上清作為ELISA的一次抗體用于試驗，檢測生成抗OA抗體的雜交瘤的存在。將通過ELISA對OA顯示陽性的孔的雜交瘤轉移至96孔細胞培養板(Becton Dickinson)，進行有限稀釋法克隆，形成0.9個細胞/孔。向96孔細胞培養板的各孔中加入4周齡BALB/c小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，形成5×106個細胞/孔。克隆的雜交瘤的培養采用含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的RPMI1640培養基。
6)抗體的篩選單克隆抗體的篩選通過檢測對未變性OA(以下可稱為“NOA”)或還原羧甲基化OA(以下可稱為“RCMOA”)的反應性的不同來獲得特異性不同的克隆。RCMOA如下獲得稱量10mg純化OA(上述凍干物)，加入1ml 1.4M Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.6)、100μl 5％EDTA、1.2g尿素、33μl 2-巰基乙醇，定容為2.5ml，然后進行氮氣置換，在37℃進行1小時的還原處理。再加入89mg溶解于300μl 1M NaOH的一碘乙酸，進行氮氣置換，然后在室溫下進行1小時的羧甲基化，制成RCMOA。通過非競爭法ELISA檢測培養上清對NOA或RCMOA的反應性。
7)腹水的采集和MAb的純化按照Jones等人(1990)的方法，首先向BALB/c小鼠腹腔內注射0.2ml不完全弗氏佐劑。一周后，對每只小鼠接種5×106個細胞的克隆的雜交瘤。腹水潴留后，通過針筒采集腹水。通過蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)對采集的腹水進行純化。
8)MAb的的特性和MAb的類、亞類和型為了確定抗OAMAb的特性，使用固相法和液相法。固相法是將NOA或RCMOA預先固定于細胞培養板的孔內，將抗未變性/變性OAMAb與該固定化抗原(NOA或RCMOA)作用的方法，液相法是將兔抗OA多克隆抗體預先固定在細胞培養板的孔內，在NOA或RCMOA與該多克隆抗體結合的狀態下使抗未變性/變性OAMAb與其作用的方法。通過單克隆小鼠免疫球蛋白同種型試劑盒(Pharmingen)確定了MAb的類和亞類為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。
9)MAb的生物素化為了用于夾層ELISA試驗，對純化的MAb分別進行了生物素化處理。使用50mM的碳酸緩沖液(pH 8.5)制備成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，攪拌，然后一邊冰冷卻一邊靜置2小時。然后用PBS置換為20mg/ml。
1-2結果1)抗OAMAb的特性和類、亞類得到了9種與NOA具有特異性的MAb，10種與RCMOA具有特異性的MAb。它們分別對液相或固相抗原的特異性表示在表9中。



2)組合條件考慮到夾層ELISA的檢測靈敏度，選擇出用于檢測NOA的MAb或用于檢測RCMOA的MAb的組合。結果NOA中，選擇了301B5和316G1或304E4(PNOA1；FERM ABP-10265)和306B2(PNOA2；FERMABP-10266)的高組合，在RCMOA中選擇了117F9和119D11或948G11(PDOA1；FERM ABP-10275)和962B8(PDOA2；FERM ABP-10276)的高組合。
以下實施例中，可以將301B5和316G1/117F9和119D11改寫成304E4和306B2/948G11和962B8。
2.通過夾層ELISA檢測變性和未變性抗原2-1材料和方法NOA溶液是用PBS將純化OA制備成100ppb溶液，制備3倍的稀釋梯度(稀釋梯度A)。另一方面在玻璃試管中稱量1mg純化OA，加入6g尿素、0.2ml 2-巰基乙醇，1ml 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、1.5ml蒸餾水，用鋁箔覆蓋，在100℃的油浴中加熱1小時，進行變性處理。冷卻后，轉移至100ml容量的容量瓶中，用PBS定容為100ml。再用PBS將其稀釋100倍，制成100ppb尿素變性OA(以下稱為“UDOA”)。再將尿素濃度保持0.01M，制備3倍的稀釋梯度(稀釋梯度B)。將100ppb NOA溶液和100ppb UDOA溶液等量混合(形成NOA和UDOA各為50ppb的溶液)，將尿素濃度保持0.005M，制備3倍的稀釋梯度(稀釋梯度C)。用作夾層ELISA的條件如表10所示。包被MAb的濃度單獨情況下為25μg/ml，混合時各為12.5μg/ml，合計為25μg/ml。


2-2結果如圖7所示，以未變性OA為對象的試驗(試驗1)中，301B5單獨、301B5和119D11的混合的曲線幾乎重疊，但在10ppb或以下更稀薄的狀態下，301B5與119D11的混合的曲線與301B5單獨的曲線相比，混合的吸光值高，可認為可提高檢測靈敏度。在以變性OA為對象的試驗2的UDOA中，301B5單獨未見吸光值，可認為301B5和316G1未參與UDOA，但119D11單獨以及301B5和119D11的混合曲線中，混合的吸光值明顯高，可認為通過將MAb混合，可提高檢測靈敏度(圖8)。這在以未變性/變性OA為對象的的(試驗3)中也可以得到確認，301B5與119D11的混合與301B5單獨相比，吸光值明顯高(圖9)。在試驗1-3的任何情況下，單獨包被的抗體濃度為25mg/ml，如果是混合則分別為一半的濃度12.5mg/ml，因此通過使用使MAb種類的混合系，抗體濃度即使相同或減少，也可以進一步提高抗原的檢測靈敏度。
3.通過免疫色譜檢測變性和未變性的OA3-1材料和方法1)膠體金標記和結合墊的制備用2mM硼酸緩沖液(pH 9.0)制成1mg/ml的119D11和316G1的MAb單獨或混合溶液。向5ml預先用0.2M碳酸鉀溶液制備成pH 9.0的膠體金溶液(シグマ)中加入500μl MAb溶液，在室溫下反應30分鐘，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反應15分鐘。進行離心，用1％BSA溶液制備成OD525＝1.0。以68μl/cm2涂布于玻璃纖維制結合墊上，進行干燥。
2)抗體固定化膜的制備用PBS以4mg/ml制備117F9和301B5的MAb單獨或混合溶液，呈直線狀涂布于硝基纖維素膜上，進行干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐溫20的PBS在37℃封閉兩小時，然后用PBS清洗并干燥。
3)免疫色譜條的組裝和評價除上述制備的結合墊、抗體固定化膜之外，另外準備被檢液點樣用的玻璃纖維制樣品墊、被檢液吸收用的玻璃纖維制吸收墊，分別貼裝樣品墊、結合墊、抗體固定化膜、吸收墊，制成免疫色譜條。將上述2中制備的NOA和UDOA適當稀釋，用作被檢液。
3-2結果通過301B5和膠體金標記316G1的組合，可以以最低10ppb的濃度檢測NOA，但對于UDOA，即使是1ppm也無法檢測。而通過117F9和膠體金標記119D11的組合，可以以最低10ppb檢測UDOA，但對于NOA，即使是1ppm也不能檢測。與其相對，制作使用301B5和117F9的固定化抗體混合物、以及316G1和119D11的膠體金抗體混合物的免疫色譜條，則可以以最低10ppb檢測變性OA或未變性OA。這樣，通過將可與變性OA結合的MAb和可以與未變性OA結合的MAb組合，無論是以制備工藝中混入的未變性卵清蛋白為對象，或以加熱后的制品為對象，可設計出在任何場合都可對應的免疫色譜條。
在市售的卵變應原檢測用免疫色譜條中，作為對照滴加只含有0.01M尿素的PBS，結果產生非特異性條帶，成假陽性。這可以認為，如果在卵清蛋白變應原檢查中不使用作為蛋白質變性劑的尿素，則可作為變應原檢測的對象就被限定在極狹窄的范圍內，該蛋白質變性劑用于萃取因熱等而變得不溶的卵清蛋白變應原。
4.可與變性/未變性卵類粘蛋白結合的MAb的確立4-1材料和方法1)雞卵類粘蛋白(以下稱為“OM”)的制備從新鮮的雞蛋中只采集蛋白，勻漿至不發泡，然后與等量的0.1M乙酸緩沖液(pH 3.8)混合。再用0.1M乙酸緩沖液進行透析，然后進行8,000rpm×20的離心，回收上清。再通過使用TSK凝膠DEAE 650S(Tosoh)的離子交換色譜進行純化。移動相使用50mM咪唑-HCl緩沖液(pH 6.4)，通過NaCl的0-0.3M線性梯度，分離OM組分，通過透析進行脫鹽，然后冷凍干燥，將其作為未變性OM(以下可稱為“NOM”)。稱量1mg該純化OM，加入6g尿素、0.2ml 2-巰基乙醇、1ml 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、1.5ml蒸餾水，用鋁箔覆蓋，然后在100℃油浴中加熱1小時，過行變性處理，制成尿素變性OM(以下可稱為“DOM”)。用生理鹽水將這些凍干物制成0.1％的溶液，分別將500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，作為抗原溶液，在免疫之前于-20℃進行冷凍保存。
2)免疫分別使用4只6周齡的BALB/c小鼠(日本クレア株式會社)作為供試動物。初次免疫中，向裝有500μl 0.1％NOM或DOM的Eppendorf管中分別等量加入完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。另外，追加免疫以每3周的間隔進行兩次。免疫時，向加入有500μl 0.1％NOM或DOM Eppendorf管中分別等量加入不完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。
3)血液中抗體效價的測定初次或追加免疫時，在注射DOM或NOM一周后，從各BALB/c小鼠的尾部靜脈采血。采集的血液在室溫中放置2小時，然后進行離心，得到血清。制備這些血清的10倍稀釋梯度，通過非競爭法ELISA檢測小鼠血液中的抗OM抗體效價。二次抗體使用堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。
4)雜交瘤的制備雜交瘤的制備按照Khler和Milstein的方法(1975)進行。對抗體效價充分提高的小鼠由尾部靜脈注射100μl 0.1％NOM溶液或DOM溶液。靜脈注射4天后，從小鼠體中無菌摘除脾臟。將脾臟切細后，用RPMI1640清洗，過滅菌尼龍網(細胞篩網，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾細胞懸浮液。通過1,000rpm×10分鐘的離心，收集脾細胞，再懸浮于RPMI1640，計數細胞數。將該脾細胞懸浮液和小鼠骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653)懸浮液按照細胞數10∶1混合，再次以1,000rpm×10分鐘進行離心，得到顆粒。向該顆粒中滴加平均分子量為3,350的45％聚乙二醇，進行細胞融合。向細胞溶液中加入RPMI1640，然后通過離心制成顆粒。向該顆粒中加入HAT選擇培養基，分注到24孔細胞培養板上，在5％CO2下、在37℃培養，形成5×106個細胞/孔。其中所述HAT選擇培養基是在雜交瘤用培養基(含有10％胎牛血清、40mM2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基)中加入100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培養基。
5)有限稀釋法克隆將細胞培養板的各孔的培養上清作為ELISA的一次抗體，用于試驗，檢測生成抗NOM抗體或DOM抗體的雜交瘤的存在。將通過ELISA對NOM或DOM顯示陽性的孔的雜交瘤轉移至96孔細胞培養板(Becton Dickinson)，進行有限稀釋法克隆，形成0.9個細胞/孔。向96孔細胞培養板的各孔中加入4周齡BALB/c小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，形成5×106個細胞/孔。克隆的雜交瘤的培養使用含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的RPMI1640培養基。
6)腹水的采集和MAb的純化按照Jones等人(1990)的方法，首先對BALB/c小鼠腹腔內注射0.2ml不完全弗氏佐劑。一周后，對每只小鼠接種5×106個細胞的克隆的雜交瘤。腹水潴留后，通過針筒采集腹水。通過蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)對采集的腹水進行純化。
7)MAb的特性和MAb的類、亞類和型采用固相法和液相法確定抗NOMMAb和抗DOMMab的特性。固相法采用將NOM或DOM預先固定在細胞培養板的孔內，使MAb與該固定化NOM或DOM作用的方法，液相法采用預先將兔抗卵類粘蛋白多克隆抗體固定在細胞培養板的孔內，在NOM或DOM與該多克隆抗體結合的狀態下，使MAb與其作用的方法。另外通過單克隆小鼠免疫球蛋白同種型試劑盒，對MAb的類和亞類確定為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgG(γ)。
8)MAb的生物素化為了進行夾層ELISA試驗，對純化的MAb分別進行生物素化處理。使用50mM的碳酸緩沖液(pH 8.5)制備成20mg/ml，加入10ml以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，攪拌后，一邊冰冷卻一邊靜置2小時。然后用PBS置換成20mg/ml。
4-2結果1)抗NOMMAb和抗DOMMab的特性和類、亞類得到7種與NOM具有特異性的MAb、10種與DOM具有特異性的MAb。它們對液相或固相抗原的特異性分別如表11所示。


2)組合條件從夾層ELISA的檢測靈敏度考慮，選擇出用于檢測NOM的MAb的組合。結果選擇出47E5(PNOM1；FERM ABP-10279)和50A12(PNOM2；FERM ABP-10280)的高組合。還使用上述10個單克隆抗體進行夾層ELISA，選擇出靈敏度最高的628E1(PDOM1；FERMABP-10277)和648A9(PDOM2；FERM ABP-10278)作為高組合。
3)通過夾層ELISA測定各單克隆抗體與OM的反應性在PNOM1和PNOM2的夾層ELISA中，檢測出未變性卵類粘蛋白，但完全未檢測出變性卵類粘蛋白(圖10)。另外在PDOM1和PNOM2的夾層ELISA中，檢測出變性OM，但未變性OM在10-100ppb之間靈敏度低(圖11)。但是在使用PNOM2和PDOM2作為抗體、使用PNOM1和PDOM1作為生物素化抗體的各單克隆抗體組合的夾層ELISA中，特別可見未變性的OM在10-100ppb下檢測靈敏度提高(圖12)。
5.通過免疫色譜檢測以OM為指標的卵清蛋白5-1材料和方法1)膠體金和結合墊的制備用2mM硼酸緩沖液(pH 9.0)將PNOM1的MAb溶液制備成1mg/ml。向5ml預先用0.2M碳酸鉀溶液制成pH 9.0的膠體金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室溫下反應30分鐘，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反應15分鐘。進行離心，用1％BSA溶液制成OD525＝1.0。以68μl/cm2涂布于玻璃纖維制結合墊上，進行干燥。
2)抗體固定化膜的制備用PBS將PNOM2的MAb溶液制備成4mg/ml，呈直線狀涂布于硝基纖維素膜，并干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐溫20的PBS、在37℃封閉2小時，然后用PBS洗滌并干燥。
3)免疫色譜條的組裝和評價除上述制備的結合墊、抗體固定化膜之外，另外準備被檢液點樣用玻璃纖維制樣品墊、被檢液吸收用玻璃纖維制吸收墊，分別依次貼裝樣品墊、結合墊、抗體固定化膜、吸收墊，制成免疫色譜條。將冷凍干燥卵清蛋白粉末的0.1％溶液分別在室溫、50℃、75℃、100℃處理1小時，將其適當稀釋，用作被檢液。
5-2結果通過PNOM1和膠體金標記PNOM2的組合，在室溫和50℃處理1小時的卵清蛋白溶液可以以最低10ppb檢測出來。在75、100℃處理1小時的卵清蛋白可以以最低100ppb檢測出來。該結果表明，對于相當于在100℃處理1小時的加熱處理食品，即使不使用尿素等變性劑，通過使用該抗OMMAb的免疫色譜條，也可以通過簡便的萃取，檢測出最低100ppb的卵清蛋白。但是，進行超過100℃的熱處理，則OM的免疫色譜不能檢測，需要如上所述，進行尿素增溶處理。
6.抗OAMAb和OMMAb的聯合使用效果6-1方法根據上述結果，如上制備了采用PNOA1、PDOA1和PNOM1的固體化混合物，以及PNOA2、PDOA2和PNOM2的膠體金抗體混合物的免疫色譜條，嘗試進行卵清蛋白的檢測。
6-2結果分別如上所示，PNOA1和PNOA2、PDOA1和PDOA2以及PNOM1和PNOM2的組合可以以各不同靈敏度檢測出目標變性/未變性OA或OM。由此可開發出在加工食品的制造過程中，在未加熱狀態下，MAb與未變性OA和OM反應，在50-100℃時，MAb與未變性/變性OA和OM反應，在上述溫度以上時，通過尿素增溶處理，變性OA反應的卵清蛋白檢測方法。
實施例31.可與變性/未變性小麥麥醇溶蛋白結合的MAb的確立1-1材料和方法1)小麥麥醇溶蛋白(以下稱為“GL”)的制備向小麥粉中加入2倍量的正丁醇，進行脫脂，風干過夜。向所得脫脂小麥粉中加入2倍量0.1％NaCl溶液，進行10,000rpm×15分鐘的離心。向所得沉淀中加入20倍量的0.01N乙酸，攪拌，然后以10,000rpm×15分鐘離心。將所得上清用蒸餾水透析，進行冷凍干燥。向所得凍干物中加入乙醇至70％，以10,000rpm×15分鐘離心。將所得上清用蒸餾水透析，得到粗GL組分。粗GL組分再通過使用SephacrylS-200HR(Amersham Biosciences)的凝膠過濾進行純化。移動相使用0.1N乙酸，分離GL，用蒸餾水透析，然后冷凍干燥。用生理鹽水制成該凍干物制成0.1％溶液，分別以500μl分注入1ml容量的Eppendorf管中，免疫前在-20℃冷凍保存，作為抗原溶液。
2)免疫使用5只5周齡的BALB/c小鼠(日本クレア株式會社)作為供試動物。初次免疫時，向裝有500μl 0.1％GL的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。將每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。另外，追加免疫時，以3周的間隔進行兩次。免疫時，向裝有500μl 0.1％GL的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。
3)血液中抗體效價的測定初次或追加免疫時，在注射了GL一周后，從各BALB/c小鼠的尾部靜脈采血。采集的血液在室溫下放置2小時，然后進行離心，得到血清。制備這些血清的10倍稀釋梯度，通過非競爭法ELISA，檢測小鼠血液中的抗GL抗體效價。二次抗體采用堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。
4)雜交瘤的制備雜交瘤的制備按照Khler和Milstein的方法(1975)進行。即，對抗體效價充分提高的小鼠由尾部靜脈注射100μl 0.1％GL溶液。靜脈注射4天后，從小鼠體內無菌摘除脾臟。將脾臟切細后，用RPMI1640清洗，過滅菌尼龍網(細胞篩網，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾細胞懸浮液。通過1,000rpm×10分鐘的離心收集脾細胞，再次懸浮于RPMI1640，計數細胞數。將該脾細胞懸浮液和小鼠骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653)懸浮液以細胞數10∶1混合，再次進行1,000rpm×10分鐘的離心，得到顆粒。向該顆粒中滴加平均分子量3,350的45％聚乙二醇，進行細胞融合。向細胞溶液中加入RPMI1640，然后離心得到顆粒。向該顆粒中加入HAT選擇培養基，分注到24孔細胞培養板(BectonDickinson)中，在5％CO2下、在37℃培養，形成5×106個細胞/孔。其中所述HAT選擇培養基是在雜交瘤用培養基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基)中加入100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培養基。
5)有限稀釋法克隆將細胞培養板的各孔中的培養上清作為ELISA的一次抗體，用于試驗，檢測生成抗GL抗體的雜交瘤的存在。將通過ELISA對GL顯示陽性的孔的雜交瘤轉移到96孔細胞培養板(Becton Dickinson)，進行有限稀釋法克隆，形成0.9個細胞/孔。向96孔細胞培養板的各孔中加入4周齡BALB/c小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，形成5×106個細胞/孔。克隆的雜交瘤的培養采用含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基。
6)抗體的篩選單克隆抗體的篩選通過檢測對未變性GL(以下稱為“NGL”)或還原羧甲基化GL(以下稱為“RCMGL”)、0.1M乙酸增溶GL(以下稱為“AGL”)、70％乙醇增溶GL(以下稱為“EGL”)、變性劑增溶的GL(以下稱為“DGL”)的反應性的不同，得到特異性不同的克隆。RCMGL如下制備稱量10mg純化GL，加入1ml 1.4M Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、100μl 5％EDTA、1.2g尿素、33μl 2-巰基乙醇，定容至2.5ml，然后進行氮氣置換，在37℃進行1小時的還原處理。在加入89mg溶解于300μl 1M NaOH的一碘乙酸，進行氮氣置換，然后在室溫下進行1小時的羧甲基化，得到RCMGL。通過非競爭法ELISA檢測培養上清對NGL、RCMGL、AGL、EGL和DGL的反應性。
7)腹水的采集和MAb的純化按照Jones等人(1990)的方法，首先向BALB/c小鼠中腹腔內注射0.2mL不完全弗氏佐劑。一周后，對每只小鼠接種5×106個細胞的克隆的雜交瘤。腹水潴留后，通過針筒采集腹水。通過蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)對采集的腹水進行純化。
8)MAb的類、亞類和型通過單克隆小鼠免疫球蛋白同種型試劑盒，MAb的類和亞類確定為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。
9)MAb的生物素化為了進行夾層ELISA試驗，對純化的MAb分別進行生物素化處理。使用50mM碳酸緩沖液(pH 8.5)制備成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，攪拌，然后一邊冰冷卻一邊靜置2小時。然后用PBS置換為20mg/ml。
2-2結果1)MAb的選擇小麥的主要變應原麥醇溶蛋白(GL)是不溶于水但溶解于乙酸和乙醇的蛋白質。制備溶解于PBS的GL(NGL)、還原羧甲基化GL(RCMGL)、0.1M乙酸增溶GL(AGL)、70％乙醇增溶GL(EGL)、變性劑增溶GL(DGL)，驗證為與哪種狀態的GL特異性結合的MAb。抗GLMAb與各狀態的GL的直接ELISA結果如表12所示。如表1所示，選擇了與所有狀態的GL結合的MAb——PGL1(FERM ABP-10267)、PGL2(FERM ABP-10268)、PGL4、PGL7。


2)夾層ELISA中的組合條件使用通過直接ELISA選擇的PGL1、PGL2、PGL4、PGL7，對于全部的MAb的組合進行夾層ELISA。麥醇溶蛋白使用NGL、RCMGL、AGL、EGL、DGL。結果，對任何狀態的GL均可以以最高靈敏度檢測的是PGL1和PGL2的組合。使用PGL1和PGL2進行的夾層ELISA的結果如圖13所示。對其它組合進行夾層ELISA，都不能檢測全部的GL，或者檢測靈敏度極低。從以上結果選擇出了PGL1和PGL2作為檢測食品以各種狀態含有的GL的MAb。
2.PGL1和PGL2所識別的表位的區別通過免疫印跡法限定各抗體所識別的表位，因此在A-PAGE和電印跡之后在進行免疫印跡。首先按照Lafiandra，D.&Kasarda，D.D.的方案，通過A-PAGE(Cereal Chemistry，62，314-319，1985)進行小麥麥醇溶蛋白的分離。使用分離出的凝膠，通過電印跡轉印到PVDF膜上。使PGL1和PGL2的培養上清(1/1000)與轉印的PVDF膜反應，然后顯色，確認所識別的表位。結果如圖14所示，PGL1所識別的蛋白質分解條帶不能被PGL2識別。由此可知PGL1和PGL2識別不同的表位。
3.通過免疫色譜檢測變性和未變性GL3-1材料和方法1)膠體金標記和結合墊的制備用2mM硼酸緩沖液(pH 9.0)將PGL1(或PGL2)溶液制備成1mg/ml。向5ml預先用0.2M碳酸鉀溶液制成pH 9.0的膠體金溶液(シグマ制造)中加入500μl MAb溶液，在室溫下反應30分鐘，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反應15分鐘。進行離心，用1％BSA溶液制備成OD525＝1.0。以68μl/cm2涂布在玻璃纖維制結合墊(日本ミリポア)上并干燥。
2)抗體固定化膜的制備用PBS將PGL2(或PGL1)溶液制成4mg/ml，呈直線狀涂布于硝基纖維素膜上并干燥。然后用含有1％BSA、0.1％吐溫20的PBS、在37℃封閉2小時，然后用PBS清洗并干燥。
3)免疫色譜條的組裝和評價除上述制備的結合墊、抗體固定化膜之外，另外準備被檢液點樣用的玻璃纖維制樣品墊、被檢液吸收用的玻璃纖維制吸收墊，依次分別貼裝樣品墊、結合墊、抗體固定化膜、吸收墊，制成免疫色譜條。
向小麥粉中加入20倍量的PBST(PBS中加入0.5％聚氧乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯所得)，在4℃攪拌過夜，離心后進行脫脂處理，回收上清，透析后進行冷凍干燥，得到小麥粉萃取物。使用制備的小麥粉萃取物，未變性的用PBS稀釋，變性的用變性劑增溶，以此作為被檢液。
3-2結果可以通過夾層ELISA檢測各種狀態的GL，由此構建并評價了免疫色譜檢測系統，以此作為更簡易的檢測方法。評價時，對于使用與目前市場銷售的變應原檢測試劑盒相同的抗體的市售A和市售B進行了比較。結果如表13所示。表13中，“非特異反應”是僅供給緩沖液時也判定為陽性，此時為“有非特異反應”。結果，市售A中，可以檢測出未變性小麥粉萃取物，但是對于變性小麥粉萃取物則可見非特異反應，無法判斷。市售B中，未能檢測1ppm的未變性小麥粉萃取物，對于變性小麥粉萃取物可見非特異反應，因此無法判斷。而使用本發明的試劑盒的方法中，對于未變性小麥粉萃取物、變性小麥粉萃取物都可以檢測到最低50ppb左右。并且對于變性小麥粉萃取物未見非特異反應。
小麥粉萃取物(未改性)

小麥粉萃取物(改性)

接著考慮從實際的食品中檢測變應原，使用市場銷售的食用面包進行評價。評價時，與使用目前市售的變應原檢測試劑盒的市售A和市售B進行了比較。結果如表14所示。表14中，“非特異反應”是只供給緩沖液時卻判定為陽性，此時為“有非特異反應”。食用面包的蛋白質約為8％，因此以下的濃度是假定將8％作為全部萃取的數字。評價結果如下市售A中，對于未變性面包無法檢測出4ppm或以下的濃度，對于變性面包則可見非特異反應，無法判定。市售B中，可檢測出4ppm左右，但是除此以外的濃度無法檢測，對于變性面包可見非特異反應，無法判定。使用本發明的試劑盒的方法中，對于未變性面包、變性面包都以40ppb左右的低濃度檢測出，變性中沒有非特異反應，可以進行檢測。
未改性食用面包(濃度換算為蛋白質濃度)

改性食用面包(濃度換算為蛋白質濃度)

實施例41.抗24kDa蛋白質MAb和抗76kDa蛋白質MAb的確立1-1材料和方法1)蕎麥24kDa蛋白質MAb和抗76kDa蛋白質的制備向市售蕎麥粉中加入5倍量的純凈水，攪拌后以12000rpm離心，得到沉淀。向所得沉淀中加入5倍量1M NaCl，攪拌后以12000rpm離心，得到上清。通過透析使上清脫鹽，進行冷凍干燥，將所得組分作為蕎麥粗蛋白組分。再使用プレツプセル960(BioRad)對該蕎麥粗蛋白組分進行純化。24kDa蛋白質的純化如下進行將蕎麥粗蛋白組分溶解于含有2.0％SDS和5％2-巰基乙醇的樣品緩沖液中，然后在95℃加熱4分鐘，以此作為樣品用于試驗，通過采用12％丙烯酰胺分離凝膠的プレツプセル960進行分離，得到24kDa蛋白質。76kDa蛋白質的純化如下進行將蕎麥粗蛋白組分溶解于含有2.0％SDS但不含有2-巰基乙醇的樣品緩沖液中，以此作為樣品用于試驗，通過采用了12％丙烯酰胺分離凝膠的プレツプセル960進行分離，得到76kDa蛋白質。所得各組分在透析后進行冷凍干燥。使用這些凍干物，用生理鹽水分別制備0.1％的24kDa蛋白質溶液和0.1％的76kDa蛋白質溶液，以500μl分注到1ml容量的Eppendorf管中，作為抗原溶液，免疫前在-20℃冷凍保存。
2)免疫使用5只5周齡的BALB/c小鼠(日本クレア株式會社)作為供試動物。初次免疫時，向分別裝有500μl 0.1％24kDa蛋白質溶液和0.1％76kDa蛋白質溶液的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。另外，追加免疫時，以3周的間隔進行兩次。免疫時，向分別裝有500μl 0.1％的24kDa蛋白質溶液和0.1％的76kDa蛋白質溶液的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。
3)血液中抗體效價的測定初次或追加免疫時，在注射了24kDa蛋白質溶液或76kDa蛋白質溶液一周后，由各BALB/c小鼠的尾部靜脈采血。采集的血液在室溫中放置2小時，然后離心，得到血清。制備這些血清的10倍稀釋梯度，通過非競爭法ELISA檢測小鼠血液中抗24kDa蛋白質抗體效價和抗76kDa蛋白質抗體效價。二次抗體采用堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.)。
4)雜交瘤的制備雜交瘤的制備按照Khler和Milstein的方法(1975)進行。即，對抗體效價充分提高的小鼠從尾部靜脈分別以100μl注射0.1％的24kDa蛋白質溶液或0.1％的76kDa蛋白質溶液。靜脈注射4天后，由小鼠體內無菌摘除脾臟。將脾臟切細后，用RPMI1640清洗，過滅菌尼龍網(細胞篩網，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾細胞懸浮液。通過1,000rpm×10分鐘的離心，收集脾細胞，再次懸浮于RPMI1640，計數細胞數。將該脾細胞懸浮液和小鼠骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653)懸浮液以細胞數10∶1混合，再以1,000rpm×10分鐘進行離心，得到顆粒。向該顆粒中滴加平均分子量3,350的45％聚乙二醇，進行細胞融合。向細胞溶液中加入RPMI1640，稀釋后，離心得到顆粒。向該顆粒中加入HAT選擇培養基，分注到24孔細胞培養板(Becton Dickinson)中，在5％CO2下、在37℃培養，形成5×106細胞/孔。其中所述HAT選擇培養基是在雜交瘤用培養基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基)中加入100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培養基。
5)有限稀釋法克隆將細胞培養板各孔的培養上清作為ELISA的一次抗體，用于試驗，檢測生成抗24kDa蛋白質抗體或76kDa蛋白質抗體的雜交瘤的存在。將通過ELISA對24kDa蛋白質或76kDa蛋白質顯示陽性的孔的雜交瘤轉移至96孔細胞培養板(Becton Dickinson)，進行有限稀釋法克隆，形成0.9個細胞/孔。向96孔細胞培養板的各孔中加入4周齡BALB/c小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，形成5×106個細胞/孔。克隆的雜交瘤的培養使用含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml的鏈霉素的RPMI1640培養基。
6)抗體的篩選單克隆抗體的篩選通過檢測對24kDa蛋白質、76kDa蛋白質、用PBS稀釋的蕎麥粗蛋白(以下可稱為“NBW”)或者變性劑增溶的蕎麥粗蛋白(以下可稱為“DBW”)的反應性的不同來獲得特異性不同的克隆。蕎麥粗蛋白如下制備向蕎麥粉中加入20倍量的PBST，在4℃攪拌過夜，離心后進行脫脂處理，回收上清，透析，然后冷凍干燥，制備成蕎麥粉萃取物。變性劑增溶如下進行稱量10mg蕎麥粗蛋白，加入6g尿素、0.2ml 2-巰基乙醇、1ml 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、1.5ml蒸餾水，用鋁箔覆蓋，然后在100℃油浴加熱1小時，進行變性處理，將其作為DBW。通過非競爭法ELISA檢測培養上清對24kDa蛋白質、76kDa蛋白質、NBW、DBW的反應性。
7)腹水的采集和MAb的純化按照Jones等人(1990)的方法，首先向BALB/c小鼠中腹腔內注射0.2ml不完全弗氏佐劑。一周后，對每只小鼠接種5×106個細胞的克隆雜交瘤。腹水潴留后，通過針筒采集腹水。通過蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)對采集的腹水進行純化。
8)MAb的特性和MAb的類、亞類和型使用固相法確定抗24kDa蛋白質MAb或抗76kDa蛋白質MAb的特性。固相法是采用預先將24kDa蛋白質、76kDa蛋白質、NBW或DBW固定在細胞培養板的孔內，使抗24kDa蛋白質MAb或76kDa蛋白質MAb與該固定化抗原作用的方法。通過單克隆小鼠免疫球蛋白同種型試劑盒(Pharmingen)，對MAb的類和亞類確定為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL(κ)和IgL(γ)。
9)MAb的生物素化為了進行夾層ELISA試驗，對純化的MAb分別進行生物素化處理。使用50mM的碳酸緩沖液(pH 8.5)制備成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，攪拌，然后一邊冰冷卻一邊靜置2小時。然后用PBS置換為20mg/ml。
1-2結果1)抗24kDa蛋白質MAb和76kDa蛋白質MAb的特性和類、亞類得到了5種對24kDa蛋白質具有特異性的MAb、4種對76kDa蛋白質具有特異性的MAb。它們分別對固相抗原的特異性如表15和表16所示。



2)組合條件以對固相抗原顯示陽性反應的各MAb分別作為固相或生物素化抗體，從夾層ELISA的檢測靈敏度考慮，選擇出用于檢測NBW和DBW的MAb的組合。結果，選擇出平板固定化抗體PBW2(FERM ABP-10273)和生物素化抗體PBW3(FERM ABP-10274)作為可檢測NBW的組合，選擇出平板固定化抗體PBW1(FERM ABP-10272)和生物素化抗體PBW2作為可檢測DBW的組合。通過夾層ELISA進行的PBW2和PBW3對各種蕎麥粗蛋白的反應性結果如圖15所示。通過夾層ELISA進行的PBW1和PBW2對各種蕎麥粗蛋白的反應性如圖16所示。
3)通過MAb混合系對NBW、DBW的檢測將通過夾層ELISA選擇的MAb混合，確認NBW、DBW的檢測靈敏度。即，對于NBW，以生物素化PBW3作為二次抗體，將以單獨PBW2作為平板固定化抗體的情況、將PBW1和PBW2混合的情況的情況進行比較。對于DBW，以生物素化PBW3為二次抗體，將高檢測靈敏度的平板固定化抗體PBW1和生物素化PBW2的組合、將PBW1和PBW2混合的平板固定化抗體的情況進行了比較。如圖17和圖18所示，將平板抗體(プレ-ト抗體)混合的情況對于NBW、DBW都顯示吸光值高，表明可提高檢測度。

2.通過夾層ELISA檢測食品中的NBW、DBW通過上述1中選擇的PBW1、PBW2、PBW3的組合，嘗試是否可以檢測實際食品中的蕎麥粗蛋白2-1材料和方法1)模型肉食制品的制備選擇肉食制品作為定量試驗的模型食品，按照表17所示的配比制備含有各濃度蕎麥粗蛋白的模型肉食制品。豬瘦肉是從豬上等肉中除去脂肪、筋，制成5mm的絞肉使用。按照各配比稱量添加物，用食品加工機混合，然后充填到氯乙烯管中，在75℃加熱30分鐘。


2)通過夾層ELISA進行定量分析(模型咸肉)將各模型咸肉用食品加工機均勻磨碎，作為分析樣品。稱量1g樣品，加入19g PBST，用勻漿器攪拌30秒。進行3,000rpm×20分鐘的離心，用濾紙過濾上清，稱量0.5ml該上清，加入9.5ml PBST，作為ELISA用樣品。校正曲線同樣采用使用PBST的蕎麥粗蛋白的梯度稀釋品。
(模型加熱制品)將各模型加熱制品用食品加工機均勻磨碎，作為分析用樣品。稱量1g樣品，加入19g含有1％SDS、1％2-巰基乙醇的PBS，用勻漿器攪拌30秒。然后在100℃加熱1小時。冷卻后進行3,000rpm×20分鐘的離心，用濾紙過濾上清，量取0.5ml該上清，加入9.5ml PBST，作為ELISA用樣品。校正曲線同樣使用經SDS、2-巰基乙醇處理的蕎麥粗蛋白的梯度稀釋品。
2-2結果通過夾層ELISA對模型肉食制品中的蕎麥粗蛋白進行分析，模型咸肉的結果如表18所示，模型加熱制品的結果如表19所示。


*1(分析值/添加量)×100*2未檢出[表19]

*1(分析值/添加量)×100)*2未檢出由以上結果表明不管是像模型咸肉那樣未加熱的蕎麥粗蛋白，還是像模型加熱制品那樣加熱變性的蕎麥粗蛋白，都可以以高回收率檢測出蕎麥粗蛋白。由此可知通過可與未變性蕎麥蛋白結合的MAb和可與變性蕎麥粗蛋白結合的MAb的組合，對于未加熱(未變性)、加熱(變性)的任何狀態的蕎麥蛋白都可以以高靈敏度進行分析。
3.通過免疫色譜檢測變性和未變性蕎麥粗蛋白3-1材料和方法1)膠體金標記和結合墊的制備用2mM硼酸緩沖液(pH 9.0)將PBW3MAb溶液制備成1mg/ml。向5ml預先用0.2M碳酸鉀溶液制備成pH 9.0的膠體金溶液(シグマ制造)中加入50μl MAb溶液，在室溫下反應30分鐘，然后加入625μl10％BSA溶液，再反應15分鐘。進行離心，用1％BSA溶液制成OD525＝1.0。以68μl/cm2涂布在玻璃纖維制結合墊(日本ミリポア)上并干燥。
2)抗體固定化膜的制備用PBS將PBW1和PBW2的MAb溶液制備成8mg/ml，以1∶1的比例混合，將其呈直線狀涂布于硝基纖維素膜上并干燥。然后用含有1％脫脂乳的10mM磷酸緩沖液(pH 7.5)、在37℃封閉1小時，用10mM磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗并干燥。
3)免疫色譜條的組裝和評價分別貼裝上述制備的樣品墊、結合墊、抗體固定化膜、吸收墊，制成免疫色譜條。將上述2中制備的模型肉食制品適當稀釋，用作被檢液。
3-2結果通過膜涂布MAb PBW1+PBW2和膠體金標記MAb PBW3的組合，無論蕎麥蛋白加熱、非加熱，都可以以最低50ppb(食品中的2ppm)檢測。該結果表明不管是以制造工藝中混入的蕎麥蛋白為對象，還是以加熱后的制品為對象，可以設計出可對應上述任何情況的免疫色譜條。
在市售的變應原檢測用免疫色譜條中滴加含有0.1M尿素+0.2％2-巰基乙醇的PBS，以此作對照，則產生非特異性條帶，為假陽性。這說明如果不使用蛋白質變性劑，則可作為變應原檢測的對象被限制在極狹窄的范圍內，該蛋白質變性劑用于從因加熱等而變性的食品蛋白中有效萃取變應原。
實施例51.抗Ara h1MAb的確立1-1材料和方法1)Ara h1蛋白質的制備向市售花生中加入5倍量的20mM雙tris-丙烷緩沖液(pH 7.2)，在室溫下攪拌2小時，然后進行3000×g的離心，除去沉淀和油分。將所得水溶性組分再次進行10000×g離心，得到上清。再用SourceQ(アマシヤム·フアルマシア)、通過20mM雙tris-丙烷緩沖液(pH7.2)、NaCl的線性梯度(0-1M)對上清進行純化。將純化的Ara h1組分用蒸餾水透析，然后冷凍干燥，制成未變性Ara h1(以下稱為“NAh1”)。變性Ara h1(以下稱為“DAh1”)如下獲得稱量10mg NAh1、6g尿素、0.2ml 2-巰基乙醇(以下稱為2-ME)、1ml 50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.6)、1.5ml蒸餾水，用鋁箔覆蓋，然后在100℃油浴中加熱1小時，進行變性處理。然后透析，冷凍干燥。用該凍干物、用生理鹽水分別制備0.1％的DAh1溶液和0.1％的DAh1溶液，以500μl分別分注到1ml容量的Eppendorf管中，免疫前在-20℃冷凍保存。
2)免疫使用5只5周齡的BALB/c小鼠(日本クレア株式會社)作為供試動物。初次免疫時，向分別裝入有500μl 0.1％NAh1溶液和0.1％DAh1溶液的Eppendorf管中等量加入完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。追加免疫時，以每2周的間隔進行3次。免疫時，向分別裝有0.1％NAh1溶液和0.1％DAh1溶液的Eppendorf管中等量加入不完全弗氏佐劑(Difco)，用漩渦混合器攪拌，將制備的乳液用于試驗。每只小鼠以150μl腹腔內注射該乳液。
3)血液中抗體效價的測定初次或追加免疫時，在注射NAh1溶液或DAh1溶液一周后，由各BALB/c小鼠的尾部靜脈采血。采集的血液在室溫下放置2小時，進行離心，得到血清。制備該血清的10倍稀釋梯度，通過非競爭法ELISA檢測小鼠血液中抗NAh1抗體效價和抗DAh1抗體效價。二次抗體使用堿性磷酸酶標記抗小鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoReserchLaboratories Inc.)。
4)雜交瘤的制備雜交瘤的制備按照Khler和Milstein的方法(1975)進行。即，對抗體效價充分提高的小鼠，從尾部靜脈分別注射100μl 0.1％的NAh1溶液或0.1％的DAh1溶液。靜脈注射4天后，從小鼠體內無菌摘除脾臟。將脾臟切細后，用RPMI1640清洗，過滅菌尼龍網(細胞篩網，70mm，Becton Dickinson制造)，得到脾細胞懸浮液。通過1,000rpm×10分鐘的離心收集脾細胞，再次懸浮于RPMI1640中，計數細胞數。將該脾細胞懸浮液和小鼠骨髓瘤細胞(P3X63Ag8.653)懸浮液按照細胞數10∶1混合，再次以1,000rpm×10分鐘進行離心，得到顆粒。向該顆粒中滴加平均分子量為3,350的45％聚乙二醇，進行細胞融合。向細胞溶液中加入RPMI1640，然后離心得到顆粒。向該顆粒中加入HAT選擇培養基，分注到24孔細胞培養板(Becton Dickinson)中，在5％CO2下、在37℃培養，使細胞數為5×106個細胞/孔。其中所述HAT選擇培養基是在雜交瘤用培養基(含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基)中加入100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸腺嘧啶的培養基。
5)有限稀釋法克隆將細胞培養板各孔的培養上清作為ELISA的一次抗體，用于試驗，檢測生成抗NAh1抗體或DAh1抗體的雜交瘤的存在。將通過ELISA對NAh1或DAh1顯示陽性的孔的雜交瘤轉移至96孔細胞培養板(Becton Dickinson)上，進行有限稀釋法克隆，形成0.9個細胞/孔。向96孔細胞培養板的各孔中加入4周齡BALB/c小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，形成5×106個細胞/孔。克隆的雜交瘤的培養使用含有10％胎牛血清、40mM 2-巰基乙醇、100U/ml青霉素、100g/ml的鏈霉素的RPMI1640培養基。
6)抗體的篩選單克隆抗體的篩選通過檢測對NAh1、DAh1、或花生粗蛋白的未變性物(以下稱為“NP-e”)、尿素處理(以下稱為“DP-e”)四種的反應性的不同而得到特異性不同的克隆。NP-e如下獲得向花生中加入5倍量的20mM雙Tris-丙烷緩沖液(pH 7.2)，在室溫下攪拌2小時，然后進行2次離心，將所得上清進行透析，冷凍干燥。DP-e如下制備稱量10mg NP-e，加入6g尿素、0.2ml 2-ME、1ml 50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、1.5ml蒸餾水，用鋁箔覆蓋，然后在100℃油浴中加熱1小時，進行變性處理。通過非競爭法ELISA檢測培養上清對NAh1、NP-e、DAh1或DP-e的反應性。
7)腹水的采集和MAb的純化按照Jones等人(1990)的方法，首先對BALB/c小鼠腹腔內注射0.2ml不完全弗氏佐劑。一周后，對每只小鼠接種5×106個細胞克隆的雜交瘤。腹水潴留后，通過針筒采集腹水。通過蛋白G柱(アマシヤム·フアルマシア)對采集的腹水進行純化。
8)MAb的的特性和MAb的類、亞類和型使用固相法確定抗NAh 1MAb或抗DAh1MAb的特性。固相法采用將NAh1、DAh1、NP-e或DP-e預先固定在細胞培養板的孔中，使抗NAh1MAb或抗DAh1MAb與該固定化抗原作用的方法。通過單克隆小鼠免疫球蛋白同種型試劑盒(Pharmingen)對MAb的類和亞類確定為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgL和IgL(γ)。
9)MAb的生物素化為了進行夾層ELISA試驗，對純化的MAb分別進行生物素化處理。使用50mM的碳酸緩沖液(pH 8.5)制備成20mg/ml，加入10μl以3mg/100μl溶解于DMSO的NHS-生物素溶液，攪拌，然后一邊冰冷卻一邊靜置2小時。然后用PBS置換為20mg/ml。
1-2結果1)抗NAh1MAb和DAh1MAb的特性和類、亞類得到7種對NAb1具有特異性的MAb、3種對DAh1具有特異性的MAb。它們對固相抗原的特異性分別如表20和表21所示。



2)組合條件以對固相抗原顯示陽性的各MAb分別作為固相或生物素化抗體，從夾層ELISA的檢測靈敏度考慮，選擇出用于檢測NP-e和DP-e的MAb的組合。結果選擇出平板抗體PAh1-2(FERM ABP-10270)和生物素化抗體PAh1-1(FERM ABP-10269)作為可檢測NP-e的組合，選擇出平板抗體PAh1-2和生物素化抗體PAh1-3(FERM ABP-10271)作為可檢測DP-e的組合(圖19和圖20)。
3)通過MAb混合系檢測NP-e、DP-e在固相中混合PAh1-2(細胞保藏號)、生物素化PAh1-2(細胞保藏號)和PAh1-3(細胞保藏號)，確認NP-e、DP-e的檢測靈敏度。各MAb的濃度設定為50μg/ml。結果，通過MAB混合系均可檢測出NP-e、DP-e(圖21和圖22)。
2.通過夾層ELISA檢測食品中的花生粗蛋白通過上述1中選擇的PAh1-1、PAh1-2、PAh1-3的組合，嘗試是否可檢測出實際食品中的花生粗蛋白。
2-1材料和方法1)模型肉食制品的制備選擇肉食制品作為定量試驗的模型食品，按照表22所示配比制備含有各濃度的花生粗蛋白的模型肉食制品。豬瘦肉是從豬上等肉中除去脂肪、筋，制成5mm的絞肉使用。按照各配比稱量添加物，用食品加工機混合，然后充填到氯乙烯管中，在75℃加熱30分鐘。


2)通過夾層ELISA進行定量分析(模型咸肉)將各模型咸肉用食品加工機均勻磨碎，制成分析樣品。稱量1g樣品，加入19g PBST，用勻漿器攪拌30秒。進行3000rpm×20分鐘的離心，用濾紙過濾上清，量取0.5ml所得上清，加入9.5ml PBST，作為ELISA用樣品。校正曲線同樣使用溶解于PBST的花生粗蛋白的梯度稀釋品。
(模型加熱制品)用食品加工機將各模型加熱制品均勻磨碎，作為分析樣品。稱量1g樣品，加入19g含有1M尿素、1％2-ME的PBS，用勻漿器攪拌30秒。然后在100℃進行1小時加熱處理。冷卻后進行3000rpm×20分鐘的離心，用濾紙過濾上清，量取0.5ml上清，加入9.5ml PBST，作為ELISA用樣品。校正曲線同樣使用進行了1M尿素和0.1％2-ME處理的花生粗蛋白的梯度稀釋品。還與用PBST從分析用樣品中萃取并溶解于PBST的花生粗蛋白作為校正曲線、但不使用尿素和2-ME的情況進行比較。
2-2結果關于通過夾層ELISA對模型肉食制品中的花生粗蛋白的分析，模型咸肉的結果如表23所示，模型加熱制品的結果如表24所示，僅由PBST萃取的結果如表25所示。


*1(分析值/添加量)×100*2未檢出[表24]

*1(分析值/添加量)×100*2未檢出

以上結果表明不管是像模型咸肉的未加熱的花生粗蛋白，還是如模型加熱制品的加熱變性花生粗蛋白，都可以以高回收率檢測出花生粗蛋白。由此可知通過將可與未變性蛋白質結合的MAb和與變性蛋白質結合的MAb組合，對于未加熱(未變性)、加熱(變性)的任何狀態的花生蛋白，都可以以高靈敏度分析。還得知將尿素和2-ME用于食品中花生粗蛋白的萃取是有效的，并且必須可與尿素變性的Ah1結合。
3.通過免疫色譜檢測未變性和變性花生粗蛋白3-1材料和方法1)膠體金標記和結合墊的制備用2mM硼酸緩沖液(pH 9.0)將PAh1-1和PAh1-3的MAb溶液制備成1mg/ml。向5ml預先用0.2M碳酸鉀溶液制備成pH 9.0的膠體金溶液(シグマ制造)中加入500ml MAb溶液，在室溫下反應30分鐘，然后加入625μl 10％BSA溶液，再反應15分鐘。進行離心，用1％BSA溶液制成OD525＝2.0，以1∶1的比例混合。以68μl/cm2涂布于玻璃纖維制結合墊上并干燥。
2)抗體固定化膜的制備用PBS將PAh1-2的MAb溶液制成4mg/ml，呈直線狀涂布于硝基纖維素膜上并干燥。然后用含有1％脫脂乳的10mM磷酸緩沖液(pH7.5)、在37℃封閉1小時，然后用10mM磷酸緩沖液(pH 7.5)清洗并干燥。
3)免疫色譜條的組裝和評價分別貼裝上述制備的樣品墊、結合墊、抗體固定化膜、吸收墊，制成免疫色譜條。將上述2中制備的模型肉食制品適當稀釋，用作被檢液。
3-2結果通過膜涂布MAb PAh1-2、膠體金標記MAb PAh1-1和PAh1-3的組合，不管加熱或非加熱，都可以以最低50ppb(食品中的2ppm)檢測出花生粗蛋白。該結果表明無論以制造工藝中混入的花生粗蛋白為對象或加熱后的制品為對象，可以設計出可以對應任何情況的免疫色譜條。
在市售的變應原檢測用免疫色譜條中滴加含有0.01M尿素、0.2％2-ME的PBS，以此作為對照，則產生非特異性條帶，為假陽性。這說明如果不使用蛋白質變性劑，則可作為變應原檢測的對象被限制在極狹窄的范圍內，該蛋白質變性劑用于從因加熱而變性的食品蛋白中有效萃取變應原。
產業實用性根據本發明，在食品等中所含的乳變應原、卵清蛋白變應原、小麥變應原、蕎麥變應原、花生變應原的免疫學檢測方法中，在變性/未變性的任何狀態下，都可以定性且定量的檢測出這些變應原。
序列表序列表<110>Prima Meat Packers，Ltd.
<120>變應原的檢測方法<130>2004P2325<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>199<212>PRT<213>cow<400>1Arg Pro Lys His Pro Ile Lys His Gln Gly Leu Pro Gln Glu Val Leu1 5 10 15Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe Phe Val Ala Pro Phe Pro Gln Val Phe20 25 30Gly Lys Glu Leu Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser35 40 45Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp Ile Lys Gln Met Glu Ala Glu Ser5055 60Ile Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn Ser Val Gln Gln Lys His
65 70 7580Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu85 9095Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val100105 110Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His115120 125Ala Gln Gln Lys Glu Pro Met Ile Gly Val Asn Gln Glu Leu Ala Tyr130 135 140Phe Tyr Pro Glu Leu Phe Arg Gln Phe Thr Gln Leu Asp Ala Tyr Pro145150155160Ser Gly Ala Trp Tyr Tyr Val Pro Leu Gly Thr Gln Tyr Thr Asp Ala165 170175Pro Ser Phe Ser Asp Ile Pro Asn Pro Ile Gly Ser Glu Asn Ser Glu180 185190Lys Thr Thr Met Pro Leu Trp19權利要求
1.變應原的檢測方法，該變應原檢測方法是使用識別未變性和變性的乳變應原、未變性和變性的卵清蛋白變應原、未變性和變性的小麥變應原、未變性和變性的蕎麥變應原、或未變性和變性的花生變應原的各2種或多種單克隆抗體進行的，其特征在于以αs1酪蛋白的主要蛋白質αs 1αs 1酪蛋白、乳清的主要蛋白質β乳球蛋白、卵清蛋白的主要蛋白質卵白蛋白和卵類粘蛋白、小麥的主要蛋白質麥醇溶蛋白、蕎麥的主要蛋白質——分子量24kDa和76kDa的蛋白質，或者花生的主要蛋白質Ara h1為指標。
2.變應原的檢測方法，其特征在于將識別未變性乳變應原的單克隆抗體和識別變性乳變應原的單克隆抗體結合使用。
3.權利要求2的乳變應原的檢測方法，其特征在于使用分別識別不同表位的2種或以上單克隆抗體作為識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體。
4.權利要求2或3的乳變應原的檢測方法，其特征在于識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體是抗αs1酪蛋白單克隆抗體。
5.權利要求4的乳變應原的檢測方法，其特征在于抗αs1酪蛋白單克隆抗體是識別未變性αs1酪蛋白、尿素處理αs1酪蛋白、未變性酪蛋白鈉和變性酪蛋白鈉的抗αs1酪蛋白單克隆抗體。
6.權利要求4或5的乳變應原的檢測方法，其特征在于抗αs1酪蛋白單克隆抗體是識別SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白的氨基酸序列第132號-第193區域的單克隆抗體。
7.權利要求4-6中任一項的乳變應原的檢測方法，其特征在于抗αs1酪蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10263)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN1和/或雜交瘤(FERM ABP-10264)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN2。
8.權利要求4-7中任一項的乳變應原的檢測方法，其特征在于通過夾層ELISA，可以在10-1000ppb的濃度范圍內對食品中的未變性αs1酪蛋白和尿素處理αs1酪蛋白進行定性且定量的分析。
9.權利要求2或3的乳變應原的檢測方法，其特征在于識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體是抗β乳球蛋白單克隆抗體。
10.權利要求9的乳變應原的檢測方法，其特征在于抗β乳球蛋白單克隆抗體是識別未變性β乳球蛋白、尿素處理β乳球蛋白、還原羧甲基化β乳球蛋白的抗β乳球蛋白單克隆抗體。
11.權利要求9或10的乳變應原的檢測方法，其特征在于抗β乳球蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10281)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG1和/或雜交瘤(FERM ABP-10282)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG2和/或雜交瘤(FERM ABP-10283)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG3。
12.權利要求9-11中任一項的乳變應原的檢測方法，其特征在于可通過夾層ELISA，在30-1000ppb的濃度范圍內對食品中的未變性β乳球蛋白和尿素處理β乳球蛋白進行定性且定量的分析。
13.權利要求2-12中任一項的乳變應原的檢測方法，其特征在于使用尿素和2-巰基乙醇，從檢樣中萃取酪蛋白和/或乳清蛋白。
14.權利要求1-13中任一項的乳變應原的檢測方法，其特征在于該方法使用識別未變性酪蛋白的一或多種單克隆抗體和識別變性酪蛋白的一或多種單克隆抗體，以及使用識別未變性β乳球蛋白的一或多種單克隆抗體和識別變性β乳球蛋白的一或多種單克隆抗體。
15.乳變應原檢測試劑盒，該試劑盒具備識別未變性乳變應原的單克隆抗體和識別變性乳變應原的單克隆抗體，并在將識別未變性乳變應原的單克隆抗體和識別變性乳變應原的單克隆抗體結合使用的條件下使用。
16.權利要求15的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中的識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體是具備分別識別不同表位的兩種或以上的單克隆抗體。
17.權利要求15或16的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體是抗αs1酪蛋白單克隆抗體。
18.權利要求17的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于抗αs1酪蛋白單克隆抗體是識別未變性αs1酪蛋白、尿素處理αs1酪蛋白、未變性酪蛋白鈉和變性酪蛋白鈉的抗αs1酪蛋白單克隆抗體。
19.權利要求17或18的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于抗αs1酪蛋白單克隆抗體是識別SEQ ID NO.1所示的αs1酪蛋白的氨基酸序列第132號-193號區域的單克隆抗體。
20.權利要求17-19中任一項的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于抗αs1酪蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10263)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN1和/或雜交瘤(FERM ABP-10264)生成的抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN2。
21.權利要求15或16的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于識別未變性乳變應原和/或變性乳變應原的單克隆抗體是抗β乳球蛋白單克隆抗體。
22.權利要求21的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于抗β乳球蛋白單克隆抗體是識別未變性β乳球蛋白、尿素處理β乳球蛋白、還原羧甲基化β乳球蛋白的抗β乳球蛋白單克隆抗體。
23.權利要求21或22的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于抗β乳球蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10281)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG1和/或雜交瘤(FERM ABP-10282)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG2和/或雜交瘤(FERM ABP-10283)生成的抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG3。
24.權利要求15-23中任一項的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于識別不同表位的2種單克隆抗體中的至少一種是在免疫色譜中使用的膠體金標記的單克隆抗體。
25.權利要求15-24中任一項的乳變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性酪蛋白的一或多種單克隆抗體和識別變性酪蛋白的一或多種單克隆抗體、以及識別未變性β乳球蛋白的一或多種單克隆抗體和識別變性β乳球蛋白的一或多種單克隆抗體。
26.抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN1，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10263)生成的。
27.抗αs1酪蛋白單克隆抗體Pas1CN2，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10264)生成的。
28.抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG1，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10281)生成的。
29.抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG2，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10282)生成的。
30.抗β乳球蛋白單克隆抗體PβLG3，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10283)生成的。
31.卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于將識別未變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體和識別變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體結合使用。
32.權利要求31的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于使用分別識別不同的表位的2種或以上的單克隆抗體作為識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體。
33.權利要求31或32的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體是抗卵白蛋白單克隆抗體。
34.權利要求33的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于抗卵白蛋白單克隆抗體是識別未變性卵白蛋白和/或還原羧甲基化卵白蛋白的抗卵白蛋白單克隆抗體。
35.權利要求33或34的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于抗卵白蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10265)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA1和/或雜交瘤(FERM ABP-10266)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA2和/或雜交瘤(FERM ABP-10275)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA1和/或雜交瘤(FERM ABP-10276)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA2。
36.權利要求33-35中任一項的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于該方法可通過夾層ELISA，在1.0-10.0ppb濃度范圍內對食品中的未變性卵白蛋白和/或變性卵白蛋白進行定性且定量的分析。
37.權利要求31或32的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體是抗卵類粘蛋白單克隆抗體。
38.權利要求37的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于抗卵類粘蛋白單克隆抗體是識別未變性卵類粘蛋白和/或尿素變性卵類粘蛋白的抗卵類粘蛋白單克隆抗體。
39.權利要求37或38的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于抗卵類粘蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10279)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM1和/或雜交瘤(FERM ABP-10280)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM2和/或雜交瘤(FERM ABP-10277)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM1和/或雜交瘤(FERM ABP-10278)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM2。
40.權利要求34-36中任一項的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于該方法可通過夾層ELISA，在10-100ppb濃度范圍內對食品中的未變性卵類粘蛋白和/或變性卵類粘蛋白進行定性且定量的分析。
41.權利要求31-40中任一項的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于該方法是使用尿素和2-巰基乙醇，從檢樣中萃取卵白蛋白和/或卵類粘蛋白。
42.權利要求31-41中任一項的卵清蛋白變應原的檢測方法，其特征在于該方法使用識別未變性卵白蛋白的1或多種單克隆抗體和識別變性卵白蛋白的1或多種單克隆抗體、以及識別未變性卵類粘蛋白的1或多種單克隆抗體和識別變性卵類粘蛋白的1或多種單克隆抗體。
43.卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體和識別變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體，在將識別未變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體和識別變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體結合使用的條件下使用。
44.權利要求43的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒中的識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體具備分別識別不同的表位的兩種或以上的單克隆抗體。
45.權利要求43或44的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體是抗卵白蛋白單克隆抗體。
46.權利要求45的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于抗卵白蛋白單克隆抗體是識別未變性卵白蛋白和/或還原羧甲基化卵白蛋白的抗卵白蛋白單克隆抗體。
47.權利要求45或46的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于抗卵白蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10265)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA1和/或雜交瘤(FERM ABP-10266)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA2和/或雜交瘤(FERM ABP-10275)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA1和/或雜交瘤(FERM ABP-10276)生成的抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA2。
48.權利要求43或44的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于識別未變性卵清蛋白變應原和/或變性卵清蛋白變應原的單克隆抗體是抗卵類粘蛋白單克隆抗體。
49.權利要求48的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于抗卵類粘蛋白單克隆抗體是識別未變性卵類粘蛋白和/或尿素變性卵類粘蛋白的抗卵類粘蛋白單克隆抗體。
50.權利要求48或49的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于抗卵類粘蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10279)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM1和/或雜交瘤(FERM ABP-10280)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM2和/或雜交瘤(FERM ABP-10277)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM1和/或雜交瘤(FERM ABP-10278)生成的抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM2。
51.權利要求43-50中任一項的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于識別不同表位的2種或以上的單克隆抗體中的至少一種是免疫色譜中使用的膠體金標記的單克隆抗體。
52.權利要求43-51中任一項的卵清蛋白變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性卵白蛋白的1或多種單克隆抗體和識別變性卵白蛋白的1或多種單克隆抗體、以及識別未變性卵類粘蛋白的1或多種單克隆抗體和識別變性卵類粘蛋白的1或多種單克隆抗體。
53.抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA1，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10265)生成的。
54.抗卵白蛋白單克隆抗體PNOA2，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10266)生成的。
55.抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA1，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10275)生成的。
56.抗卵白蛋白單克隆抗體PDOA2，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10276)生成的。
57.抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM1，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10279)生成的。
58.抗卵類粘蛋白單克隆抗體PNOM2，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10280)生成的。
59.抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM1，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10277)生成的。
60.抗卵類粘蛋白單克隆抗體PDOM2，該抗體是由雜交瘤(FERMABP-10278)生成的。
61.小麥變應原的檢測方法，其特征在于該方法使用識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體。
62.小麥變應原的檢測方法，其特征在于該方法將識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白、且識別不同表位的兩種抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體結合使用。
63.權利要求61或62的小麥變應原的檢測方法，其特征在于抗小麥麥醇溶單克隆抗體是識別未變性小麥麥醇溶蛋白、還原羧甲基化小麥麥醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶小麥麥醇溶蛋白、70％乙醇增溶小麥麥醇溶蛋白、和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體。
64.權利要求61-63中任一項的小麥變應原的檢測方法，其特征在于抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10267)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL1和/或雜交瘤(FERM ABP-10268)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL2。
65.權利要求61-64中任一項的小麥變應原的檢測方法，其特征在于該方法可通過夾層ELISA，在10-100ppb的濃度范圍內對食品中的未變性小麥麥醇溶蛋白、還原羧甲基化小麥麥醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶小麥麥醇溶蛋白、70％乙醇增溶小麥麥醇溶蛋白、和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白進行定性且定量的分析。
66.小麥變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體。
67.小麥變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性小麥麥醇溶蛋白和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白、且識別不同表位的2種抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體。
68.權利要求66或67的小麥變應原檢測試劑盒，其特征在于抗小麥麥醇溶單克隆抗體是識別未變性小麥麥醇溶蛋白、還原羧甲基化小麥麥醇溶蛋白、0.1M乙酸增溶小麥麥醇溶蛋白、70％乙醇增溶小麥麥醇溶蛋白、和變性劑增溶的小麥麥醇溶蛋白的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體。
69.權利要求66-68中任一項的小麥變應原檢測試劑盒，其特征在于抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10267)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL1和/或雜交瘤(FERM ABP-10268)生成的抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL2。
70.權利要求66-69中任一項的小麥變應原檢測試劑盒，其特征在于識別不同表位的2種單克隆抗體的至少一種是在免疫色譜中使用的用膠體金標記的單克隆抗體。
71.抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL1，該抗體由雜交瘤(FERMABP-10267)生成。
72.抗小麥麥醇溶蛋白單克隆抗體PGL2，該抗體由雜交瘤(FERMABP-10268)生成。
73.蕎麥變應原的檢測方法，其特征在于該方法使用識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體。
74.蕎麥變應原的檢測方法，其特征在于該方法將識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白、且識別不同的表位的2種抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體結合使用。
75.權利要求73或74的蕎麥變應原的檢測方法，其特征在于抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體是識別24kDa蛋白質和加熱變性蕎麥粗蛋白單的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體，或者是識別76kDa蛋白質和未變性蕎麥粗蛋白單的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體。
76.權利要求73-75中任一項的蕎麥變應原的檢測方法，其特征在于抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10272)生成的抗24kDa蛋白質單克隆抗體PBW1和/或雜交瘤(FERM ABP-10273)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW2和/或雜交瘤(FERM ABP-10274)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW3。
77.權利要求73-76中任一項的蕎麥變應原的檢測方法，其特征在于該方法可通過夾層ELISA，在10-1000ppb的濃度范圍內對未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白進行定性且定量的分析。
78.權利要求73-77中任一項的蕎麥變應原的檢測方法，其特征在于該方法是使用尿素和2-巰基乙醇，從檢樣中萃取加熱變性蕎麥粗蛋白。
79.蕎麥變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體。
80.蕎麥變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性蕎麥粗蛋白和加熱變性蕎麥粗蛋白、且識別不同的表位的2種抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體。
81.權利要求79或80的蕎麥變應原檢測試劑盒，其特征在于抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體是識別24kDa蛋白質和加熱變性蕎麥粗蛋白單的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體，或者是識別76kDa蛋白質和未變性蕎麥粗蛋白單的抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體。
82.權利要求79-81中任一項的蕎麥變應原檢測試劑盒，其特征在于抗蕎麥粗蛋白單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10272)生成的抗24kDa蛋白質單克隆抗體PBW1和/或雜交瘤(FERM ABP-10273)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW2和/或雜交瘤(FERM ABP-10274)生成的抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW3。
83.權利要求79-82中任一項的蕎麥變應原檢測試劑盒，其特征在于識別不同表位的2種單克隆抗體的至少一種是免疫色譜中使用的膠體金標記的單克隆抗體。
84.權利要求79-83中任一項的蕎麥變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備尿素和2-巰基乙醇，作為從檢樣中萃取蕎麥粗蛋白的萃取劑。
85.抗24kDa蛋白質單克隆抗體PBW1，該抗體是雜交瘤(FERMABP-10272)生成的。
86.抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW2，該抗體是雜交瘤(FERMABP-10273)生成的。
87.抗76kDa蛋白質單克隆抗體PBW3，該抗體是雜交瘤(FERMABP-10274)生成的。
88.花生變應原的檢測方法，其特征在于該方法使用識別未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質的抗Ara h1蛋白質單克隆抗體。89.花生變應原的檢測方法，其特征在于該方法是將識別未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質、且識別不同表位的2種抗Ara h1蛋白質單克隆抗體結合使用。
90.權利要求88或89的花生變應原的檢測方法，其特征在于抗Ara h1蛋白質單克隆抗體是識別未變性Ara h1蛋白質和未變性花生粗蛋白、和/或尿素處理Ara h1蛋白質和尿素處理花生粗蛋白的抗Arah1蛋白質單克隆抗體。
91.權利要求88-90中任一項花生變應原的檢測方法，其特征在于抗花生Ara h1蛋白質單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10269)生成的抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-1和/或雜交瘤(FERMABP-10270)生成的抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-2和/或雜交瘤(FERM ABP-10271)生成的抗加熱變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-3。
92.權利要求88-91中任一項的花生變應原的檢測方法，其特征在于該方法通過夾層ELISA，在10-1000ppb的濃度范圍內對未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質進行定性且定量的分析。
93.權利要求88-92中任一項花生變應原的檢測方法，其特征在于該方法是用尿素和2-巰基乙醇，從檢樣中萃取加熱變性花生Ara h1蛋白質。
94.花生變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質的抗花生Ara h1蛋白質單克隆抗體。
95.花生變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備識別未變性花生Ara h1蛋白質和加熱變性花生Ara h1蛋白質、且識別不同表位的2種抗花生Ara h1蛋白質單克隆抗體。
96.權利要求94或95的花生變應原檢測試劑盒，其特征在于抗Ara h1蛋白質單克隆抗體是識別未變性Ara h1蛋白質和未變性花生粗蛋白、和/或尿素處理Ara h1蛋白質和尿素處理花生粗蛋白的抗Arah1蛋白質單克隆抗體。
97.權利要求94-96中任一項的花生變應原檢測試劑盒，其特征在于抗花生Ara h1蛋白質單克隆抗體是雜交瘤(FERM ABP-10269)生成的抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-1和/或雜交瘤(FERMABP-10270)生成的抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-2和/或雜交瘤(FERM ABP-10271)生成的抗加熱變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-3。
98.權利要求94-97中任一項的花生變應原檢測試劑盒，其特征在于識別不同的表位的2種單克隆抗體的至少一種是免疫色譜中使用的膠體金標記的單克隆抗體。
99.權利要求94-98中任一項的花生變應原檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具備尿素和2-巰基乙醇，作為從檢體中萃取乳清蛋白的萃取劑。
100.抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-1，該抗體由雜交瘤(FERM ABP-10269)生成。
101.抗未變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-2，該抗體由雜交瘤(FERM ABP-10270)生成。
102.抗加熱變性Ara h1蛋白質單克隆抗體PAh1-3，該抗體由雜交瘤(FERM ABP-10271)生成。
全文摘要
本發明提供在含有乳變應原、卵清蛋白、小麥、蕎麥、花生的變應原的食品中，這些變應原即使是變性/未變性的任何狀態，也可以進行檢測的高靈敏度免疫學檢測方法以及使用該方法的檢測試劑盒。該方法是使用識別未變性和變性的乳變應原、未變性和變性的卵清蛋白變應原、未變性和變性的小麥變應原、未變性和變性的蕎麥變應原、或未變性和變性的花生變應原的各2種或多種單克隆抗體的變應原檢測方法，以αs1酪蛋白的主要蛋白質αs1αs1酪蛋白、乳清的主要蛋白質β乳球蛋白、卵清蛋白的主要蛋白質卵白蛋白和卵類粘蛋白、小麥的主要蛋白質麥醇溶蛋白、蕎麥的主要蛋白質——分子量24kDa和76kDa的蛋白質，或者花生的主要蛋白質Ara h1為指標。
文檔編號G01N33/68GK1930474SQ20058000699
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月4日 優先權日2004年3月5日
發明者秋元政信, 加藤重城, 浪岡真 申請人:普利瑪食品株式會社