P53野生型作為使用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療的生物標志的制作方法

專利名稱：P53野生型作為使用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療的生物標志的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于確定增殖性疾病如癌癥對治療劑、尤其是與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑敏感性的生物標志。
大量的mTOR抑制劑具有有效的抗增殖特性，這使得它們可用于癌癥的化療，特別是實體瘤的化療，尤其是晚期實體瘤的化療。如WO 02/66019所公開，mTOR抑制劑也已經與某些細胞毒劑組合使用以進一步改善治療效果或降低副作用。然而，仍然需要更多的基于mTOR抑制劑的組合療法的目標用途，其中需要鑒定對該組合制劑治療可能做出響應的患者。因此需要在例如臨床檢驗中有用的生物標志，其能預測患者中的良性或惡性增殖性疾病如腫瘤對與細胞毒劑結合的mTOR抑制劑治療的響應性。
已經驚奇地發現，野生型p53腫瘤抑制基因(另外也稱作TP53基因)的存在是預測增殖性疾病對mTOR抑制劑和細胞毒劑組合治療敏感性的有用生物標志。特別地，已經發現在人癌細胞系中野生型p53基因的存在與源自mTOR抑制劑與破壞或影響DNA完整性的細胞毒劑組合治療的細胞殺傷/編程性細胞死亡/細胞凋亡增加十分相關。因此，當用于治療保留野生型p53的癌細胞時，與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑更有可能表現出更顯著的抗增殖/細胞殺傷作用。p53蛋白質(由TP53基因編碼)是腫瘤抑制物，其在哺乳動物細胞的細胞周期停滯、衰老、分化和編程性細胞死亡/細胞凋亡的調節中發揮重要作用。特別地，p53通路在暴露于壓力(例如DNA破壞、致癌壓力、低氧、缺乏存活信號)的哺乳動物細胞中誘導細胞周期停滯和/或細胞凋亡。在所有的人類癌癥中，有大約一半存在TP53突變，并且在許多癌細胞中誘導p53響應的能力較差(Vousden和Lu，NatureReviews，2002，2594-604)。人p53的序列(mRNA[編碼序列；1182個核苷酸]和蛋白質[393個氨基酸])可以從GenBank登錄號NM 000546或者P04637獲得。人TP53基因的完整序列可以從GenBank登錄號U94788獲得。
因此，本發明基于對傾向于異常增殖細胞中野生型p53(TP53)基因存在的確定。
本發明在一個方面提供了野生型p53(TP53)基因的存在(與p53[TP53]基因缺乏、缺少和缺失或突變的p53[TP53]基因的存在相對)作為用于確定增殖性疾病對與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療敏感性的生物標志的用途。
野生型p53(TP53)基因意味著不僅指內含子和外顯子，還指與內含子和外顯子相關或物理上接近的調節區、尤其是最5’端外顯子的5’端的那些調節區。其包括例如天然基因的全長DNA序列以及任選地密碼子的核苷酸取代(包括倒位)、插入和缺失，其前提條件是其表達野生型p53蛋白質或其功能等效物，例如保留其誘導細胞凋亡特性的功能性p53蛋白質。相反地，p53(TP53)基因的缺乏、缺少、缺失或突變是指導致p53(TP53)基因表達喪失或者突變基因表達的遺傳和外遺傳改變，例如擴增、甲基化、多態性、核苷酸突變、缺失、倒位、移位和雜合性丟失(LOH)，其中突變基因的表達造成例如不再保留誘導細胞凋亡特性的突變p53蛋白質的表達。
還在另一方面，本發明提供了確定受試者中增殖性疾病對與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療敏感性的方法，其包括確定來自受試者的樣品中p53(TP53)狀態(野生型對突變體或缺少/缺乏)。
在另一方面，本發明提供了選擇患有增殖性疾病的受試者用于進行與細胞毒劑結合的mTOR抑制劑治療的方法，其包括通過上述方法確定每一位受試者中增殖性疾病對組合治療的敏感性，以及選擇保留野生型p53(TP53)基因的受試者用于進行所述組合治療。
如此處使用的術語“mTOR抑制劑”包括但不限于雷帕霉素(西羅莫司)或其衍生物。雷帕霉素是已知由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)產生的大環內酯抗生素。適宜的雷帕霉素衍生物包括例如式A的化合物或者當R2aa為-CH2-CH2-OH時的其前體藥物，例如其可生理水解醚。
其中R1aa為CH3或C3-6炔基，R2aa為H或-CH2-CH2-OH、3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基-丙酰基或四唑基，并且Xaa為＝O、(H，H)或(H，OH)，條件是當Xaa為＝O且R1aa為CH3時R2aa不是H。
式A化合物公開于例如WO 94/09010、WO 95/16691、WO 96/41807、USP 5,362,718或WO 99/15530中，其在此引用作為參考。它們可通過如所公開制備或者通過與這些參考文獻中所述類似的方法制備。
式A的代表性雷帕霉素衍生物為例如32-脫氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32-脫氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氫-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧-32(S或R)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素、40-[3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯基]-雷帕霉素(也稱為CCI779)或者40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也稱為ABT578)。優選的化合物為例如WO 94/09010中實施例8公開的40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素，或WO 96/41807中公開的32-脫氧雷帕霉素或16-戊-2-炔基氧-32(S)-二氫-雷帕霉素。雷帕霉素衍生物還包括如WO 98/02441和WO01/14387中公開的所謂的雷帕霉素類似物(rapalog)，例如AP23573、AP23464、AP23675或AP23841。其他雷帕霉素衍生物的例子為所公開的TAFA-93(雷帕霉素前體藥物)、biolimus-7或biolimus-9。
在每一次引用專利申請或科學出版物的情況下，涉及化合物的主旨在此引入本申請作為參考。同樣還包括其可藥用鹽、相應的外消旋物、非對映異構體、對映體、互變異構體，以及如果存在例如此處所公開的溶劑合物、水合物和多晶型物的情況下上面所公開化合物的相應晶體變型。用作本發明組合的有效成分的化合物可如引用文獻所述分別制備和施用。
如此處使用的術語“細胞毒劑”為對細胞結構和功能有害的制劑，例如破壞或影響DNA完整性并可最終造成細胞死亡的制劑，例如抗腫瘤藥物，比如微管活性劑，或者尤其是破壞DNA的藥物，例如抗腫瘤抗代謝物、鉑化合物、烷化劑、或者拓撲異構酶I或II抑制劑。術語“細胞毒劑”也包括造成DNA破壞的輻射處理，例如電離輻射，如放射性碘。這種輻射處理也可與細胞毒劑治療組合使用。術語“細胞毒劑”也包括一種、兩種或更多種可以“雞尾酒”療法施用的細胞毒劑。
如此處使用的術語“拓撲異構酶I抑制劑”包括但不限于拓撲替康、伊立替康、gimatecan、9-硝基喜樹堿和大分子喜樹堿綴合物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)。可以施用例如以商標CAMPTOSARTM所銷售的伊立替康。可以施用例如以商標HYCAMTINTM所銷售的拓撲替康。
如此處使用的術語“拓撲異構酶II抑制劑”包括但不限于安慈那環素，如阿霉素(包括脂質體制劑，例如CAELYXTM)、柔紅霉素、表阿霉素、去甲柔毛霉素和奈莫柔比星；蒽醌類的米托蒽醌和洛索蒽醌以及鬼臼毒素類的依托泊苷和替尼泊苷。可以施用例如以商標ETOPOPHOSTM所銷售的依托泊苷。可以施用例如以商標VM 26-BRISTOLTM所銷售的替尼泊苷。可以施用例如以商標ADRIBLASTINTM所銷售的阿霉素。可以施用例如以商標FARMORUBICINTM所銷售的表阿霉素。可以施用例如以商標ZAVEDOSTM所銷售的去甲柔毛霉素。可以施用例如以商標NOVANTRONTM所銷售的米托蒽醌。
術語“微管活性劑”涉及微管穩定劑和微管去穩定劑，這包括但不限于紫杉類，例如紫杉醇和多西他賽；長春花生物堿，例如長春花堿，特別是硫酸長春花堿、長春花新堿，特別是硫酸長春花新堿、和長春烯堿；discodermolide和埃博霉素及其衍生物，例如埃博霉素B或其衍生物。可以施用例如以商標TAXOLTM所銷售的紫杉醇。可以施用例如以商標TAXOTERETM所銷售的多西他賽。可以施用例如以商標VINBLASTINR.P.TM所銷售的硫酸長春花堿。可以施用例如以商標FARMISTINTM所銷售的硫酸長春花新堿。Discodermolide可如US 5,010,099所公開獲得。
如此處使用的術語“烷化劑”包括但不限于環磷酰胺、異環磷酰胺、馬法蘭或亞硝基脲(BCNU或GliadelTM)。可以施用例如以商標CYCLOSTINTM所銷售的環磷酰胺。可以施用例如以商標HOLOXANTM所銷售的異環磷酰胺。
術語“抗腫瘤抗代謝物”包括但不限于5-氟尿嘧啶、喃氟啶、卡培他濱、克拉屈濱、阿糖胞苷、磷酸氟達拉濱、氟尿嘧啶核苷、吉西他濱、6-巰基嘌呤、羥脲、氨甲喋呤、依達曲沙和此類化合物的鹽，并且還包括ZD1694(RALTITREXEDTM)、LY231514(ALIMTATM)、LY264618(LOMOTREXOLTM)和OGT719。可以施用例如以商標XELODATM所銷售的卡培他濱。可以施用例如以商標GEMZARTM所銷售的吉西他濱。
如此處使用的術語“鉑化合物”包括但不限于碳鉑、順鉑和奧沙利鉑。可以施用例如以商標CARBOPLATTM所銷售的碳鉑。可以施用例如以商標ELOXATINTM所銷售的奧沙利鉑。
增殖性疾病可為良性或者惡性增殖性疾病，例如良性前列腺增生，或者腫瘤疾病，優選地是惡性增殖性疾病，例如癌癥如腫瘤和/或轉移瘤(不管曾經位于何處)，例如腦和其他中樞神經系統腫瘤(例如腦膜、腦、脊髓、腦神經和中樞神經系統其他部位的腫瘤，例如成膠質細胞瘤或髓質母細胞瘤)；頭部和/或頸部癌癥；乳腺腫瘤；循環系統腫瘤(例如心臟、縱隔和胸膜，以及其他胸內器官、血管腫瘤和腫瘤相關的血管組織)；排泄系統腫瘤(例如腎、腎盂、輸尿管、膀胱、其他和未指明的排尿器官)；胃腸道腫瘤(例如食管、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸乙狀結腸連接處、直腸、肛門和肛管)；涉及肝和肝內膽管、膽囊和肝道的其他和未指定部位、胰、其他和消化器官的腫瘤；頭部和頸部；口腔(唇、舌、牙齦、口腔底、腭、以及口腔的其他部位、腮腺，以及唾液腺的其他部位、扁桃體、口咽、鼻咽、梨狀窩、下咽部，以及唇、口腔和咽的其他部位)；生殖系統腫瘤(例如外陰、陰道、子宮頸、子宮體、子宮、卵巢，以及其他與雌性生殖器官相關的部位，胎盤、陰莖、前列腺、睪丸，以及其他與雄性生殖器官相關的部位)；呼吸道腫瘤(例如鼻腔和中耳、副鼻竇、喉、氣管、支氣管和肺，例如小細胞肺癌或非小細胞肺癌)；骨骼系統腫瘤(例如骨和四肢的關節軟骨、骨關節軟骨和其他部位)；皮膚腫瘤(例如惡性皮膚黑素瘤、非黑素瘤皮膚癌、皮膚基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、卡波西肉瘤)；和涉及其他組織的腫瘤，包括周圍神經和自主神經系統、結締組織和軟組織、腹膜后腔和腹膜、眼及附屬器官、甲狀腺、腎上腺和其他內分泌腺以及相關結構、淋巴結的繼發惡性腫瘤和未指定惡性腫瘤、呼吸系統和消化系統繼發惡性腫瘤以及其他部位的繼發惡性腫瘤、血液和淋巴系統腫瘤(例如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS相關的淋巴瘤、惡性免疫增殖性疾病、多發性骨髓瘤和惡性漿細胞瘤、淋巴細胞白血病、急性或慢性粒細胞白血病、急性或慢性淋巴細胞白血病、單核細胞白血病、其他未指定細胞類型的白血病、未指定細胞類型的白血病，淋巴組織、造血組織和相關組織的其他和未指定的惡性腫瘤，例如彌漫型大細胞性淋巴瘤、T細胞淋巴瘤或皮膚T細胞淋巴瘤)。骨髓癌癥包括例如急性或慢性粒細胞白血病。
無論腫瘤和/或轉移灶的部位如何，在上文和隨后提到腫瘤、腫瘤疾病、癌或癌癥的地方，也備選地或額外地意指最初器官或組織和/或任何其他部位的轉移灶。
在淋巴癌或骨髓癌的情況下，術語細胞毒劑還可為例如白消安、阿糖胞苷、6-硫鳥嘌呤、氟達拉濱、羥脲、普魯芐肼、博萊霉素或甲氨喋呤。在淋巴癌或骨髓癌的情況下，優選作為細胞毒劑的是拓撲異構酶II抑制劑，例如道諾紅霉素或去甲柔毛霉素或者，尤其是靶向、降低或抑制PDGFR或c-AbI家族成員和其基因融合產物活性的化合物，例如伊馬替尼、法尼基轉移酶抑制劑、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、碳鉑或midostaurine。
根據本發明的方法，可篩選患此類增殖性疾病的受試者以預測他們對mTOR抑制劑與細胞毒劑組合治療的敏感性。此方法可在體外進行，例如在來自受試者的生物組織樣品上進行。樣品可為從哺乳動物體分離的任何生物材料，如組織、細胞系、血漿或血清、細胞或組織裂解物，優選地為腫瘤組織。
通過基于例如遺傳和后遺傳變化的DNA分析的任何技術方法，例如對擴增、甲基化、多態性、核苷酸突變(例如密碼子175Arg、245Gly、248Arg、249Arg、273Arg、282Arg和其他的突變)、核苷酸缺失、倒位和/或移位和雜合性丟失(LOH)的DNA掃描，分析生物樣品的p53(TP53)基因的狀態。可通過基于如RNA表達或基于如蛋白質表達/修飾的任何技術分析生物樣品的p53(TP53)狀態，其中基于RNA表達的技術使用如RNA印跡或RT-PCR技術，基于蛋白質表達/修飾的技術使用如蛋白質印跡、免疫組化或ELISA技術，包括免疫測定法、免疫沉淀和電泳測定法。
例如，可在標準的免疫測定法形式中使用對p53蛋白質或p53翻譯后修飾，如磷酸化(例如Ser46的磷酸化)、泛素化或乙酰化特異的抗體以測量p53蛋白質/磷酸化/泛素化/乙酰化水平。使用如單克隆抗體或多克隆抗體的ELISA(酶聯免疫吸附測定法)類型測定法、免疫沉淀類型測定法、常規的蛋白質印跡測定法和免疫組化測定法也可用于測定作為生物標志的p53蛋白質/轉錄后修飾的水平。
對p53蛋白質/轉錄后修飾特異的多克隆和單克隆抗體可根據已知的免疫方法產生或商業購買(例如Santa Cruz Biotechnology Inc目錄號sc6253)。
也可通過雙向(2-D)凝膠電泳測量p53狀態。2-D凝膠電泳為本領域已知并且一般包括沿第一向的等電聚焦(IEF)和隨后沿第二向的SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)。例如，使用抗體通過免疫印跡分析得到的電泳圖。
本發明因此提供了選擇患有增殖性疾病的患者以預測他們對用mTOR抑制劑和細胞毒劑組合治療響應性的方法，其包括通過上述方法確定p53(TP53)狀態。
在另一方面，本發明提供了治療需要其的受試者中的增殖性疾病的方法，其包括通過上述方法確定來自受試者的樣品中p53(TP53)基因的狀態或p53表達和/或翻譯后修飾的水平，以及用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療受試者。
在備選的實施方案中，本發明提供了在需要其的受試者中提高細胞毒劑活性或克服對細胞毒劑抗性的方法，其包括通過上述方法確定來自受試者的樣品中p53(TP53)基因狀態/表達，以及向該受試者并行或按順序施用治療有效量的mTOR抑制劑與所述細胞毒劑。
來自受試者特定組織如腫瘤組織樣品中的p53(TP53)狀態可與對照樣品如來自未患此疾病的受試者的正常組織樣品或者來自同一受試者的正常(即非腫瘤)組織樣品比較。需要組合使用mTOR抑制劑和細胞毒劑的p53(TP53)野生型狀態水平預示著mTOR抑制劑和細胞毒劑組合治療具有有益治療作用(即抗增殖作用和/或提高的細胞殺傷作用)。
此外，可使用此方法幫助選擇細胞毒劑和/或mTOR抑制劑的適當劑量以便為每一個患者優化治療。取決于患者中p53野生型狀態，可使用較低劑量的組合中的有效成分，例如劑量需要不僅通常較小而且應用頻率較低，或者可使用較低劑量以便在控制不需要的增殖的同時降低副作用的發生率。本文考慮的因素包括被治療的特定疾病、被治療的特定哺乳動物、各個患者的臨床狀況、活性化合物的遞送部位、活性化合物的特定類型、施用方法、施用的時間安排、疾病的嚴重性和醫務人員已知的其他因素。
如此處使用的術語“組合治療”或“與……組合”或“與……結合”等等是指包括給單個患者施用所選則的mTOR抑制劑和細胞毒劑，并且旨在包括制劑不必通過相同施用途徑或在同一時間施用的治療方案。例如，可以單獨實體同時地、并行地或順序地向患者施用mTOR抑制劑和細胞毒劑，而沒有特定時間限制，其中此類施用提供了兩種化合物在體內的治療有效水平。
可通過上面提到的考慮因素控制待施用組合的每一活性成分的治療有效量，并且為預防、改善或治療疾病的最小量。此量優選地低于對宿主有毒性或使宿主明顯更易感的量。
如WO 02/66019中公開，適當的mTOR抑制劑劑量為例如大約0.1-30mg級別的日劑量率，例如作為單劑量或分次劑量或間歇(例如一周一次)口服大約0.05-20mg活性成分。可通過任何常規途徑施用雷帕霉素或其衍生物，例如式A的化合物，尤其是以如片劑、膠囊劑、口服溶液形式經腸施用，如口服，或者以含如大約0.1％-大約99.9％、優選大約1％-大約60％有效成分的注射溶液或混懸液形式經腸胃外施用。
可以大約1-5mg/m2/天的劑量范圍向人施用拓撲替康。可以大約50-350mg/m2/天的劑量范圍向人施用伊立替康。
可以大約50-300mg/m2/天的劑量范圍向人施用紫杉醇。可以大約25-100mg/m2/天的劑量范圍向人施用多西他賽。
可以大約50-1500mg/m2/天的劑量范圍向人施用環磷酰胺。可以大約0.5-10mg/m2/天的劑量范圍向人施用馬法蘭。
可以大約50-1000mg/m2/天、如500mg/m2/天的劑量范圍向人施用5-氟尿嘧啶。可以大約10-1000mg/m2/天的劑量范圍向人施用卡培他濱。可以大約1000mg/m2/周的劑量范圍向人施用鹽酸吉西他濱。
可以大約每四周大約200-400mg/m2的劑量范圍向人施用碳鉑。可以大約每三周大約25-75mg/m2的劑量范圍向人施用順鉑。可以大約每兩周大約50-85mg/m2的劑量范圍向人施用奧沙利鉑。
可以大約2.5-850mg/天、更優選5-600mg/天和最優選20-300mg/天的劑量范圍向人施用伊馬替尼。
在根據本發明的方法中使用的優選組合為例如雷帕霉素、40-[3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯基]-雷帕霉素或40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素與細胞毒劑如吉西他濱或順鉑的組合。如上文所公開，在根據本發明的方法中使用的備選組合為起增效作用數量的mTOR抑制劑與細胞毒劑如吉西他濱或順鉑的組合。
優選地，TP53為人基因。
本發明的方法優選地在呈現p53(TP53)野生型狀態的的腫瘤細胞上進行。
在另一個實施方案中，驚奇地發現，在p53(TP53)野生型細胞中用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療所引起的增加的細胞殺傷/編程性細胞死亡/細胞凋亡與細胞毒性誘導的p21Waf1/Cip1(也稱作CDKN1A、WAF1、CIP1、SDI1、CAP20、MDA-6、p21)蛋白質(此后稱為p21)表達上調的強烈弱化有關。
p21為細胞周期蛋白激酶“抑制劑”cip/kip家族的成員，其在允許細胞周期通行以及阻止細胞凋亡中發揮作用。在本發明的背景中，p21作為對脅迫信號例如DNA損傷的響應、對活化p53的響應而使細胞生長停滯的功能很確定。的確，可以假設增加的p21蛋白質表達允許此類受脅迫細胞存活，例如允許細胞完成DNA修復過程。由此，作為對細胞毒素處理做出響應而削弱p21表達的增加可促進細胞殺傷/編程性細胞死亡/細胞凋亡(Weiss，Cancer Cell，2003，4425-429)。人p21的序列(mRNA[編碼序列495個核苷酸]和蛋白質產物[164個氨基酸])可以從GenBank登錄號NM000389、NM 078467或AAH01935獲得。人p21基因的完整序列可以從GenBank登錄號NM 078467獲得。
此外，一些癌癥患者具有增加的總的或胞質腫瘤p21表達，其與預后較差和對化學治療響應性較差關聯(Weiss，見上)。評價癌癥患者中基礎p21表達也可用于選擇進行特定化學療法治療、例如基于與一種或多種細胞毒劑和任選放療組合的mTOR治療的患者。
因此，本發明還提供i.p21用作確定受試者的增殖性疾病對與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療敏感性或響應性的生物標志的用途；ii.選擇患有增殖性疾病的受試者用于使用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療的方法，其包括通過上述方法確定每一個受試者中增殖性疾病對使用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療的敏感性，以及選擇對組合治療表現出基礎p21表達增加的那些受試者；iii.確定受試者中的增殖性疾病對使用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療敏感性或響應性的方法，其包括在單獨用細胞毒劑治療和細胞毒劑與mTOR抑制劑組合治療之前和/或之后確定來自受試者的樣品中p21表達水平；iv.在用細胞毒劑治療的受試者中提高該細胞性劑活性或克服對細胞毒劑抗性的方法，其包括-通過上述方法確定來自受試者的樣品中p21表達水平，-如果在施用細胞毒劑之后p21表達上調，則向該受試者施用治療有效量的與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑，-用mTOR抑制劑和細胞毒劑組合治療之后再次確定來自受試者的新樣品中p21表達的水平，和-如果p21表達下調，則再用mTOR抑制劑與所述細胞毒劑并行或按順序治療受試者。
如上面已經提到，如上面針對p53所公開確定p21蛋白質水平；然而，應當理解，使用p21特異性抗體而不是p53特異性抗體，例如商業購買的單克隆或多克隆抗體(例如Oncogene Research products，Clone EA10，目錄號OP64)。
受試者特定組織如腫瘤組織樣品中的水平可與對照樣品如未患此疾病的受試者正常組織樣品或同一受試者的正常(即非腫瘤)組織樣品比較。p21表達誘導的缺乏或削弱(當用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑的治療與單獨用細胞毒劑治療所誘導的p21表達相比)預示著與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑具有有益治療作用(即抗增殖/細胞殺傷作用)。評價細胞毒劑對p21表達的誘導和/或mTOR抑制劑對p21表達的反作用也可用于調整細胞毒劑的劑量，如降低細胞毒劑量。
本實施例舉例說明本發明，但不構成對本發明的任何限制。
實施例1在96孔板中以每孔2×103個細胞/100μl的密度接種p53(TP53)野生型人腺癌A549(CCL-185)腫瘤細胞(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD.，USA)并在37℃和5％CO2條件下孵育24小時。用與20nM 40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素或媒介物對照DMSO組合的亞最佳濃度的吉西他濱(例如5-17.5nM)再孵育細胞72小時。在細胞中加入YO-PRO染料(YO-PROR-1碘化物[491/509]，目錄號Y3603，Molecular Probes)并用Cytofluor II熒光板讀取儀測定細胞死亡或細胞毒性，并在細胞裂解之后測定相對細胞增殖。在該測定法中，mTOR抑制劑，如40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素顯著(在統計學上)增強了亞最佳濃度吉西他濱細胞的殺傷作用(p＜0.05；ANOVA，Tukey檢驗)。當使用人肺腺癌A549以外的p53(PT53)野生型細胞系如人MCF7乳腺癌細胞(HTB-22；美國典型培養物保藏中心)時獲得與上面公開類似的結果。
然而，用p53(TP53)突變/缺乏的腫瘤細胞系，如PC3M人前列腺癌細胞(以0.8×103個細胞/100μl的密度接種)或MDA-MB231人乳腺癌細胞(以2×103個細胞/100μl的密度接種；HTB-26；美國典型培養物保藏中心)重復該過程。在p53(TP53)突變/缺乏的細胞系中沒有見到細胞死亡的顯著增強或一致增強。
以每個10cm平板0.1×106個細胞/10ml的密度接種A549細胞并在37℃和5％CO2條件下孵育24小時。周與20nM 40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素或媒介物對照DMSO組合的亞最佳濃度的吉西他濱(例如5-12.5nM)再孵育細胞72小時。通過8％SDS-PAGE電泳分離相當于50μg總蛋白的細胞提取物并周抗聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的兔多克隆抗體(CellSignalling Technology目錄號9542)進行免疫印跡分析。在該測定法中，mTOR抑制劑如40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素的存在(與相同濃度的單獨的吉西他濱或mTOR抑制劑相比)導致在亞最佳吉西他濱濃度時的PARP切割(細胞凋亡的標志)增加。這驗證了上面的結果，即在p53(TP53)野生型A549細胞中mTOR抑制劑的存在導致在亞最佳吉西他濱濃度時的細胞死亡水平更高。
實施例2在96孔板中以每孔5×103個細胞/100μl的密度接種p53(TP53)野生型人肺腺癌A549細胞并在37℃和5％CO2條件下孵育24小時。用與20nM40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素或與媒介物對照DMSO組合的亞最佳濃度的順鉑(例如3-10μg/ml)再孵育細胞24小時。如上開展YO-PRO測定法以測定細胞死亡或細胞毒性并在細胞裂解后測定相對細胞增殖。在該測定法中，mTOR抑制劑，如40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素顯著(在統計學上)增強了亞最佳濃度順鉑的細胞殺傷作用(p＜0.05；ANOVA，Tukey檢驗)。隨后用雙因素ANOVA分析表明RAD001和順鉑的相互作用很顯著(p＜0.001)。當使用人肺腺癌A549以外的p53(PT53)野生型細胞系如人MCF7乳腺癌細胞時獲得與如上公開類似的結果。在用人MCF7乳腺癌細胞的的情況中，與化合物的孵育時間為30小時。
然而用p53(TP53)突變/缺乏的腫瘤細胞系，如PC3M(以3×103個細胞/100μl的密度接種)或DU145(以5×103個細胞/100μl的密度接種；HTB-81；美國典型培養物保藏中心)重復該過程。在這種情況中與化合物的孵育時間為22小時(對于DU145)或者30小時(對于PC3M)。在p53(TP53)突變/缺乏的腫瘤細胞系中沒有見到細胞死亡的顯著增強或一致增強。
以每個10cm平板0.1×106個細胞/10ml的密度接種A549細胞并在37℃和5％CO2條件下孵育24小時。用與20nM 40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素或媒介物對照DMSO組合的亞最佳濃度的順鉑(例如0.5-4μg/ml)再孵育細胞24小時。通過8％SDS-PAGE電泳分離相當于50μg總蛋白的細胞提取物并用抗聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和p53的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析。在該測定法中，mTOR抑制劑如40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素的存在(與相同濃度的單獨的順鉑或mTOR抑制劑相比)導致在亞最佳順鉑濃度時的PARP切割(細胞凋亡的標志)增加。這驗證了上面的結果，即在p53(TP53)野生型A549細胞中mTOR抑制劑的存在導致在亞最佳順鉑濃度時的細胞死亡水平更高。
p53(TP53)狀態預測了如受試者中腫瘤對mTOR抑制劑和細胞毒劑組合的敏感性。如所公開，可使用從腫瘤組織獲得的DNA、RNA或蛋白質評價p53狀態以預測對mTOR抑制劑和細胞毒劑組合的可能的響應性。
實施例3分別以每個6cm平板0.3×106和0.4×106個細胞/4ml的密度接種p53(TP53)野生型A549和MCF7細胞，并在37℃和5％CO2的條件下孵育24小時。用與20nM 40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素或媒介物對照DMSO組合的亞最佳濃度的順鉑(例如0.5-4μg/ml)再分別孵育細胞24小時和30小時。在15％SDS-PAGE電泳分離相當于30μg總蛋白的細胞提取物并用抗p21的小鼠多克隆抗體(Oncogene Research Products，Clone EA10，目錄號OP64)進行免疫印跡分析。單獨的順鉑在兩個細胞系中都以濃度依賴的方式誘導了p21蛋白質表達增加。mTOR抑制劑如40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素的存在顯著削弱了順鉑誘導的p21蛋白質表達上調。與之相反，p53調節的促細胞凋亡蛋白質-Bax蛋白質的表達未受單獨制劑或組合制劑的影響。在該測定法中，mTOR抑制劑的存在抑制了細胞毒性誘導的p21蛋白質的表達。這可以解釋使用順鉑和mTOR抑制劑組合所導致的細胞殺傷/細胞凋亡響應性的增強。
實施例4以每個6cm平板0.1×106個細胞/5ml的密度接種p53(TP53)野生型A549細胞并在37℃和5％CO2的條件下孵育24小時。細胞不經轉染或使用Oligofectamine(Invitrogen，目錄號12252-011)用100nM的靶向人p53(登錄號NM000546；靶序列5’-GCA TCT TAT CCG AGT GGAA-3’)的siRNA或靶向LacZ(登錄號M55068；靶序列5’-GCG GCT GCCGGA ATT TAC CTT-3’)對照siRNA轉染。孵育30小時之后，用濃度逐漸增加的順鉑(例如0.5-6μg/ml)再孵育細胞24小時。用15％(p21)和10％(p53和PARP)SDS-PAGE電泳分離相當于30μg(p21)和50μg(p53和PARP)總蛋白的細胞提取物，并分別使用抗p21和p53/PARP的鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體進行免疫印跡分析。對未轉染細胞或LacZ siRNA對照轉染細胞用順鉑處理則以濃度依賴方式誘導p53和p21蛋白質的表達，在較高順鉑濃度下(2-6g/ml)PARP切割(細胞凋亡的標志)明顯。在p53siRNA轉染細胞中，出現了順鉑誘導的p53蛋白質表達的顯著削弱，其與p21表達、PARP切割和細胞活力喪失的強烈弱化有關。使用靶向人p53的其他兩個siRNA(靶序列5’-GGA AGA CTC CAG TGG TAAT-3’和5’-GAT ATT GAA CAA TGG TTC A-3’)也觀察到了對p53表達、p21表達和PARP切割的相同作用。這些數據直接驗證了用順鉑和mTOR抑制劑組合所導致的提高的細胞殺傷/細胞凋亡響應性是通過p53依賴的機制引起的。
實施例5以每個6cm平板0.1×106個細胞/5ml的密度接種p53(TP53)野生型A549細胞并在37℃和5％CO2的條件下孵育24小時。細胞不經轉染或使用Oligofectamine(Invitrogen，目錄號12252-011)用100nM靶向p21(登錄號NM000389；靶序列5’-GTG GAC AGC GAG CAG CTG A-3’)的siRNA或靶向LacZ(如上文)的對照siRNA轉染。孵育30小時之后，用亞最佳濃度的順鉑(例如1-2μg/ml)再孵育細胞24小時。分別用15％和10％的SDS-PAGE電泳分離相當于30μg(p21)和50μg(PARP)總蛋白的細胞提取物，并分別用抗p21和PARP的鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體進行免疫印跡分析。對未轉染細胞或LacZ siRNA對照轉染細胞用順鉑處理則以濃度依賴的方式誘導p21蛋白質的表達，PARP切割(細胞凋亡的標志)不明顯。在p21siRNA轉染細胞中，出現順鉑誘導的p21蛋白質表達的顯著弱化，其與PARP切割的強烈誘導有關。這些數據直接驗證了細胞毒性誘導的p21蛋白表達的弱化造成了用順鉑和mTOR抑制劑組合處理時細胞殺傷/細胞凋亡響應的提高。
序列表<110>諾瓦提斯公司(Novartis AG)<120>P53野生型作為使用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療的生物標志<130>4-33584A<140>
<141>
<150>US 60/546,856<151>2004-02-23<160>5<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列<400>1gcatcttatc cgagtggaa 19<210>2<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列<400>2gcggctgccg gaatttacct t21<210>3<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列<400>3ggaagactcc agtggtaat 19<210>4<211>19
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列<400>4gatattgaac aatggttca 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物序列<400>5gtggacagcg agcagctga 19
權利要求
1.確定具有增殖性疾病的受試者中p53(TP53)狀態用作生物標志的用途，其用于確定該受試者對用與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療的敏感性。
2.根據權利要求1所述的用途，其包括p53(TP53)基因分析和p53表達水平/翻譯后修飾的用途。
3.確定受試者中的增殖性疾病對mTOR抑制劑和細胞毒劑組合治療敏感性的方法，其包括確定來自受試者的樣品中p53(TP53)基因的狀態和/或p53的表達水平/翻譯后修飾。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中增殖性疾病包括癌癥。
5.根據權利要求3-4中任一項所述的方法，其包括確定p53(TP53)的遺傳狀態和/或p53的表達水平。
6.根據權利要求3-5中任一項所述的方法，其中樣品來自受試者的腫瘤。
7.選擇患有增殖性疾病的受試者用于進行mTOR抑制劑和細胞毒劑組合治療的方法，其包括通過權利要求3-6中任一項所述的方法確定每一受試者中增殖性疾病對組合治療的敏感性，以及選擇顯示為野生型p53(TP53)狀態的那些受試者用于組合治療。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法或用途，其中mTOR抑制劑包括雷帕霉素或雷帕霉素衍生物。
9.根據權利要求8所述的方法或用途，其中雷帕霉素衍生物包括40-O-(2-羥乙基)雷帕霉素、40-[3-羥基-2-(羥甲基)-2-甲基丙酸酯基]-雷帕霉素或40-表-(四唑基)-雷帕霉素。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法或用途，其中細胞毒劑選自抗腫瘤抗代謝物、鉑化合物、烷化劑、拓撲異構酶I或II抑制劑、微管活性劑和輻射。
11.p21用作確定受試者中增殖性疾病對與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療敏感性或響應性的生物標志的用途。
12.根據權利要求11所述的用途，其包括確定p21表達水平。
13.確定受試者中增殖性疾病對與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑治療敏感性或響應性的方法，其包括在用細胞毒劑單獨治療之后和細胞毒劑與mTOR抑制劑組合治療之后確定來自受試者樣品中的p21表達水平。
14.在用細胞毒劑治療的受試者中提高該細胞毒劑活性或克服對該細胞毒劑抗性的方法，其包括-確定來自受試者樣品中的p21表達水平，-如果施用細胞毒劑之后p21表達上調，則向該受試者施用治療有效量的與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑，-用mTOR抑制劑和細胞毒劑組合治療之后再次確定來自受試者的新樣品中的p21表達水平，和-如果p21表達下調，則再并行或按順序用mTOR抑制劑與該細胞毒劑治療受試者。
全文摘要
提供了用于確定增殖性疾病如癌癥對治療劑、尤其是與細胞毒劑組合的mTOR抑制劑敏感性的生物標志，其中所述細胞毒劑尤其是破壞或影響DNA完整性的細胞毒劑。
文檔編號G01N33/574GK1957092SQ200580005693
公開日2007年5月2日 申請日期2005年2月22日 優先權日2004年2月23日
發明者I·伯文克, A·布萊, H·萊恩, T·奧賴利, G·托馬斯 申請人:諾瓦提斯公司, 諾瓦提斯研究基金會弗里德里克·米謝爾生物醫學研究所