專利名稱：分子間隔臂、其制備方法、以及在包含分子或生物分子的分析芯片上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子間隔臂、用于制備將分子單元連接到固相載體的間隔臂的方法、以及這種間隔臂在包含分子或生物分子的分析芯片上的應用。
在以下的披露內容中，方括號[]之間的標記指代在說明書末尾列出的參考文獻。
本發明針對的分析芯片更具體地，但不是唯一地，為生物芯片和用于生物分析的微系統。可將它們分成三類DNA芯片、芯片實驗室(lab-on-chip)以及細胞芯片(cell-on-chip)。
當前，出現了新型的芯片糖芯片(glycochip)。這種生物芯片或者是天然或合成物質沉積的結果，或者是各種寡糖序列的支持的多步平行合成(組合化學)的結果，寡糖表現了某些大類的內源性糖綴合物的分子多樣性，例如硫酸乙酰肝素。本發明尤其適用于這種新型的生物芯片，因為其尤其允許利用化學方法將這些分子連接到生物芯片載體，與現有技術相比，該化學方法有效并且簡單。
可通過本發明的間隔臂連接到固相載體的分子或生物分子(特此稱為“分子單元”)可以為例如核酸(DNA或RNA)、糖、糖蛋白、糖脂等。其他的進一步實例在下面給出。
背景技術：
在大多數生物芯片中，間隔物(spacer)提供固相載體[2]和例如寡肽、寡核苷酸[3]或寡糖[4]探針之間的連接。這種間隔物可以同時起多種作用連接分子、空間隔開臂、探針斷裂的部位等。
實際上，載體通過探針接近目標的識別部位可阻礙、或甚至阻止探針/目標識別，并因此損害生物芯片的分析精度和質量。當探針較小時，例如在糖芯片的情形中，尤其如此。
下面的原理公式表示間隔物的形成然后斷裂的總圖解，其中X’表示固相載體，而X”為分子單元。
到目前為止，已生產了許多間隔臂，但是它們具有某些未解決的缺點。具體地說，它們的結構對可用來將它們連接到固相載體的化學方法具有嚴格限制，和/或它們不可能容易地連接任何類型的生物分子，和/或它們是如此化學上穩定的，以至于一旦連接到固相載體，它們就不容易被斷裂以便恢復生物分子，并且所述斷裂可導致所述分子或載體的破壞。
文獻[4](US-A-6,579,725)描述了用于連接寡糖的間隔臂。盡管比其他更早的現有技術的間隔臂更有效，但是這種間隔臂沒有可能同時解決所有上述問題。還會注意到，不能一直如所希望的那樣產生其長度、官能度、反應性以及阻礙性。
發明內容
準確地說，本發明通過提供下式(I)的分子間隔臂使得同時解決現有技術的所有上述問題成為可能 其中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、以及R3為如下X0和X4各自獨立于其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As以及Si；X1、X2和X3各自獨立于其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As和Si，以及選自各自含有例如2～20個碳原子的芳基或雜芳基；Z1和Z2各自獨立于其他取代基地選自C-R、Si-R、C、N、P以及As，其中R為含有例如1～40個碳原子的烷基；
R1、R2和R3各自獨立于其他取代基地選自H、烷基、芳基以及雜芳基，每個含有2～20個碳原子；[Gp]表示保護仲胺-N-的基團或參與間隔臂官能化的分子；其中，n、m和p各自為大于或等于1的整數并彼此獨立地進行選擇，優選地為1≤n、m和p≤40；其中，[Sup]表示H或所述間隔臂可共價連接的硅烷化固相載體；其中，[mo]表示H或用于通過所述間隔臂共價連接到所述硅烷化固相載體的分子單元。
當然，X0至X4為形成本發明的間隔臂主鏈的原子，例如選自H、O、各含有2～20個碳原子的烷基、芳基以及雜芳基的基團可能連接到這些原子。
這種間隔臂(I)可通常用于將分子單元[mo]連接到固相載體[Sup]，例如為了制造生物芯片，或者更有利地用于制造糖芯片，其中[mo]通常為使所述生物芯片官能化(功能化)的分子。
根據本發明，優選地，在上面定義的間隔臂[1]中X0和X4各自獨立于其他取代基地選自C、O、N、S以及Si；和/或X1、X2和X3各自獨立于其他取代基地選自C、O、N、S和Si，以及選自各含有例如2～10個碳原子的芳基或雜芳基；和/或
Z1和Z2各自可獨立于其他取代基地選自C、N、C-R以及Si-R，其中R為含有1～30個碳原子，優選1～20個碳原子，更優選1～10個碳原子的烷基；和/或R1、R2和R3各自可獨立于其他取代基地選自H，烷基、芳基以及雜芳基，每個含有2～10個碳原子；根據本發明，n、m和p也可彼此獨立地進行選擇，使得1≤n、m和p≤30，優選為1≤n、m和p≤20，并且更優選為1≤n、m和p≤10。
根據本發明，作為實例，在上面定義的間隔臂[1]中，X0和X4為C；X1、X2和X3為C；Z1和Z2為C；并且R1、R2和R3為H。
根據本發明，保護基團[Gp]可以為本領域技術人員已知的任何保護仲胺的基團。優選那些能夠經受住用于合成間隔臂、用于將其連接到載體以及用于將其連接到分子單元[mo]的化學反應的基團。其可選自例如Ac、Bn(芐基)、C1～C40芳基(R)、Troc、z、TCA、BOC、Fmoc等，以便與間隔臂(I)的仲胺一起形成以下化學基團中的一種(＞N-表示受保護的仲胺)＞N-Ac乙酰胺(＞N-CO-Me)；＞N-Bn苯甲酰胺；＞N-RC1～C40芳酰胺；＞N-Troc氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(＞N-C(O)OCH2CCl3)；＞N-z氨基甲酸芐酯(＞N-C(O)OCH2Ph)；＞N-TCA三氯乙酰胺(＞N-CO-CCl3)；＞N-BOC氨基甲酸叔丁酯(＞N-C(O)OCMe3)；＞N-Fmoc氨基甲酸9-芴基甲酯 (Ph＝苯基并且Me＝甲基)。
根據本發明，優選地保護基團選自Ac、BOC或C1～C40芳基。
根據本發明，參與間隔臂官能化的分子[Gp]可以為例如C1～C40、例如C1～C30、例如C1～C20或C1～C10烷基或芳基。其可為任何取代基(不必需是保護性的)，當使用時，該取代基可參與間隔臂的官能化。其可以為例如疏水基，可以使得間隔臂相對于要進行連接的分子[mo]和/或其在間隔臂使用(例如，用在糖芯片或蛋白芯片上)過程中的作用變得更加特異的和/或更加有選擇性的。
根據本發明，固相載體可以為例如任何可被硅烷化的載體。其可以是例如板、小珠(billes)或毛細管。其可以是例如基于硅土、玻璃或其他本領域技術人員已知的材料，例如用于制備生物芯片的載體或表面。載體的硅烷化可通過本領域技術人員已知的任何方法進行。
根據本發明，分子單元[mo]可為天然或合成的分子。例如由于分析的原因，其可為任何必須連接到載體的分子。其可以是小分子，例如具有在約180～400000g.mol-1范圍內的分子量。當其是糖(sugar)時，[mo]可具有例如在180～10000g.mol-1范圍內的分子量。當其是蛋白質或肽時，[mo]可具有例如在5500～400000g.mol-1范圍內，通常在5500～220000g.mol-1范圍內(大多數蛋白質的分子量)的分子量。
這種分子單元[mo]可為例如選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物、肽、蛋白質、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂、糖脂蛋白等。
在單糖之中，可以提到的是葡萄糖、葡萄糖胺、疊氮葡萄糖胺、D-核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、2-脫氧-D-核糖、L-巖藻糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-神經氨酸、D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-山梨醇、D-甘露醇等。
在寡糖之中，可以提到的是蔗糖，乳糖，硫酸乙酰肝素片段，肝素、軟骨素、硫酸皮膚素的糖片段，劉易斯抗原等。
在多聚寡糖之中，可以提到的是硫酸乙酰肝素、肝素、軟骨素、硫酸皮膚素等的糖部分。
在糖綴合物之中，可以提到的是硫酸乙酰肝素、肝素、軟骨素、硫酸皮膚素等。
在肽和蛋白質之中，可以提到的是趨化因子、細胞因子(細胞活素)、胰島素、纖維蛋白原、肌球蛋白、血紅蛋白等。
在酶之中，可以提到的是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、連接酶。
在糖蛋白之中，可以提到的是免疫球蛋白G、透明質酸等。
在脂之中，可以提到的是水解類脂脂肪(甘油+3個脂肪酸)、蠟(脂肪酸+脂肪醇)、固醇酯(固醇+脂肪酸)、磷脂(磷脂酸(甘油、2脂肪酸+磷酸酯或磷酸鹽))、磷脂質(甘油+2脂肪酸+磷酸酯或磷酸鹽)、鞘脂(鞘氨醇+脂肪酸+磷酸酯或磷酸鹽+氨基醇)；非水解類脂烷烴、類胡蘿卜素、固醇(膽固醇)、類固醇(雌二醇、睪酮)、酸(脂肪酸)、二十酸等。
在脂肪酸之中，可以提到的是花生四烯酸、亞油酸、亞麻酸、月桂酸、神經酸、棕櫚酸、油酸等。
在糖脂之中，可以提到的是半乳糖神經酰胺、葡(萄)糖神經酰胺、神經節苷脂、腦苷脂(脂肪酸+鞘氨醇+1糖)、神經節苷脂(脂肪酸+鞘氨醇+多個糖、神經氨酸)等。
在糖脂蛋白之中，提到的可以是MPB83(商標名)、GLP19(商標名)以及IRBP(商標名)。
本發明還涉及用于通過間隔臂(有利地為本發明的間隔臂)將分子單元[mo]共價連接到固相載體的方法。
該方法可包括以下步驟(i)還原下式的化合物的腈官能團 (ii)從下式的生物分子的烯丙基官能團形成醛官能團
(iii)在所述經還原的腈官能團和所述醛官能團之間，進行還原性胺化，接著對形成的仲胺進行保護，以便獲得活化的生物分子，用于連接到載體，所述活化的生物分子為下式 (iv)固相載體硅烷化，以及具有下式的分子的硅烷化載體的官能化 (v)在使載體官能化的分子和活化的生物分子之間進行復分解反應，以便形成根據本發明的連接生物分子和載體的間隔臂。
在這個方法中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、R3以及[mo]為如上文所定義的。
根據本發明，下式的化合物
可以是例如烯丙基化的糖，[mo]為所述糖。這種烯丙基化的糖可通過本領域技術人員已知的任何方法獲得，其中該方法不會損壞糖。其可以是例如在文獻[5]中所描述的方法。
根據本發明，仲胺也可用保護基團進行保護。因此，本發明的方法還可包括將保護基團[Gp]連接到仲胺官能團上的步驟。保護基團可以是如上文所定義的。可通過本領域技術人員已知的任何化學方法將其連接到仲胺，例如根據在文獻[7]中所描述的方法之一進行。
為了實現本發明這種方法的各個步驟，可使用本領域技術人員已知的常規的有機化學方法。這樣，作為實例，對于腈還原的步驟，可使用在文獻[6]中描述的方法。對于從生物分子的烯丙基官能團形成醛官能團的步驟，可使用在文獻[5]中描述的臭氧分解方法。對于在經還原的腈官能團和所述醛官能團之間進行還原性胺化、接著對氮進行保護以便獲得活化的生物分子的步驟，可使用在文獻[7]中描述的方法。對于固相載體的硅烷化及其官能化的步驟，可使用在文獻[8]中描述的方法。對于復分解反應，可使用在文獻[10]中描述的方法。
因此，本發明的間隔臂可由相連的三個部分形成，首先，通過還原性胺化接著通過對在分子單元一側的氮進行保護，其次，用格拉布斯(Grubbs)復分解反應。格拉布斯復分解是例如在文獻[11]中所描述的。
插入碳鏈的氮原子具有若干優點在兩個鏈段的連接過程中獲得，其為可用各種方式進行保護的仲胺形式，以便賦予間隔物特定的反應性。該官能團可有利地按情況通過用各種保護基團或用參與間隔臂的官能化的分子進行調節，使得可以改變和控制間隔臂的親水性或疏水性，并且控制其空間位阻。還有利地有可能調節間隔臂該部分的親電/親核或酸/堿性因此氮原子保護基團的性質優選為了優化反應、相互作用、包括表征或分析的操作的條件進行選擇，無論在間隔區斷裂以便釋放分子單元之前或之后。例如，利用乙酰基基團，由于其小尺寸，所以獲得較小的空間位阻，這在使用間隔臂，例如在分子芯片上使用時可使分子識別最優化。又例如，利用丁基基團，獲得疏水碳基取代基，其使間隔臂的該部分具有疏水性，這使得例如親水蛋白質對間隔臂的親水部分的識別更具特定性和更具選擇性([mo])。
因此，本發明提供了可調節的間隔臂(或“間隔物”)，其不同的結構影響臂的反應性，即，其化學和/或電化學和/或空間行為。
本發明可簡單并有效地加以實現，并且間隔物有利地具有以下三種性能，尤其是當其用于糖芯片的制造時首先，間隔物成功地執行臂的功能，以將糖鏈與支撐該鏈的固體表面隔開；接著，隔離物是可斷裂的臂這就有可能容易地并以靶向的方式打開間隔物，以便將糖從支撐相分離出來；最后，借助間隔物的較低程度的化學官能度，在用于例如糖單元上的有機合成過程中進行的反應的許多條件下和當使用糖芯片時，間隔物保持惰性。
除了本發明的上述優點外，發明人在進行各種實驗過程中還注意到以下幾方面由于存在固相載體，所以間隔臂使克服空間問題成為可能。其使得可以在良好空間條件下，研究蛋白質/糖在獲得的糖芯片上的相互作用。其解決了空間位阻問題，該空間位阻問題是當蛋白質靠近糖配體時在現有技術中表現出來并且對后面潛在的相互作用有害。
可調節臂的長度不同大小的功能性同系物的一種明智的選擇，尤其通過起始反應物的選擇，使得制備不同大小的間隔物成為可能。
不僅有可能選擇在糖鏈和固相載體之間的距離，而且有可能通過保護基團控制間隔物的這個部分的親水或疏水性。
間隔物化學結構的簡化，在制造它時和當使用糖芯片時，賦予間隔物在許多有機反應過程中的無化學活性的性能。
由于間隔物缺少相互作用的化學官能團，所以當系統用于糖芯片或更一般性地在小分子芯片的方面，間隔區對與其他分子的可能相互作用沒有影響。
在不損壞生物分子、例如寡糖分子的反應條件下，可將間隔物在其C＝C雙鍵處精確并選擇性地斷裂。實際上，可方便地使用例如臭氧(O3)分解、格拉布斯復分解(格拉布斯催化劑)、或二羥基化接著進行二醇鋨化(diolosmylation)氧化斷裂(OsO4、NaIO4)、以及本領域技術人員已知的其他溫和化學反應用于所述斷裂。
間隔區易于斷裂并且這種斷裂不會改變糖的結構的事實，使得可以對分離出來的寡糖鏈進行結構和構象的分析控制。還易于計算在糖合成過程中連接(“加載”)到固相載體的糖探針的數量。
相比于在文獻[1]中描述的間隔物(例如，辛二醇)，這種間隔區的優點之一在于其長度、官能度、反應性以及空間位阻的適應性可如所希望的產生。
發明人還注意到，本發明的間隔物允許結合極大范圍的糖、寡糖或多糖，該糖、寡糖或多糖非常普遍地被預先合成并在相對于它們還原部分的異頭(anomerique)位置用烯丙基基團加以保護。實際上，這些糖單元可通過一個步驟進行轉化，以便直接連接到間隔物上。因此，這種間隔物有利地與許多糖分子相容，如在文獻例如在文獻[7]、[12]以及[13]中已經合成并描述的。
本發明可用于例如糖芯片、例如能夠通過篩選確定那些識別特定蛋白質的寡糖序列(例如根據在文獻[1]中描述的技術)的芯片的制造。在這種應用中，本發明可以優化篩選方法，并因此更有效地和更快速地具有(disposer)用于治療或生物技術用途的分子。可以預計，在本發明的其他應用中也存在這種能力。
本發明還可用到生物芯片上，在生物芯片中間隔臂必須形成固相載體和寡肽探針、寡核苷酸探針和/或寡糖探針之間的連接。尤其，本發明的間隔臂可用到寡肽芯片如在文獻[3]中描述的芯片上，或用到寡糖芯片如在文獻[4]中描述的芯片上。
通過閱讀作為說明性的以下實施例，其他特征和優點對本領域的技術人員來說也將顯而易見。
具體實施例方式
1)通過實施例，以下披露了利用那些選自本領域技術人員易得到的那些方法進行的間隔物的合成，該間隔物具有相應于十四個碳的鏈的長度。以下用黑體字的標記對應反應圖解。
所選化合物為構成分子單元[mo]的葡萄糖型(1)的單糖(1)(N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNac)在1-位烯丙基化的糖)；帶有待還原的腈官能團的4-戊烯腈(3)；以及用于載體官能化的7-辛烯基三甲氧基硅烷(8)。固相載體由基于二氧化硅的可控孔度玻璃珠(CPG)(商標名)(6)構成。
以下的反應圖解概括了在這些實施例中采用的借助根據本發明的間隔臂用來將寡糖(1)連接到載體(6)的所有化學反應。這些化學反應用字母A到F表示。包括間隔臂斷裂的反應的實例在以下的實施例G中提出。
對于這個反應圖解，在糖上表示的基團“R”并沒有有意地進行區分以便簡化表述。這些“R”基團表示在形成糖的環上的各個位置的取代基，其可以彼此相同或不相同，并且其可以是通常在糖上遇到的取代基。在本文提出的具體實施例中，使用的糖為N-乙酰基葡萄糖胺，本領域技術人員可以毫無困難地確定在化合物(1)、(2)、(5)以及(10)的不同位置上的取代基“R”。
實施例A寡糖的活化(反應A)在這個實施例中使用了臭氧分解反應。在文獻[5]中描述了所使用的該方法。
將在異頭位置烯丙基化的糖(1)(0.93mmol)溶解在5ml的二氯甲烷和甲醇(1/1)的混合物中將介質侵入溫度為-78℃的冷浴(丙酮+干冰)中。然后必須將臭氧O3鼓泡通入溶液中一出現藍色(臭氧過量的特征)，就用氬氣(或氮氣)代替臭氧。反應完成時，通過加入二甲基硫Me2S(4.65mmol，5eq)對介質進行還原然后形成二甲基亞砜DMSO。過了整夜，介質慢慢地回復到環境溫度，然后在真空下加以蒸發有機殘留物用二乙醚Et2O進行提取，然后用水洗滌。將有機相在真空下蒸發，然后與甲苯一起共蒸發。將粗產物通過硅膠柱色譜(洗提液石油醚/乙酸乙酯8/2)加以純化。
這樣，以75％的產率獲得醛(2)。
實施例B腈的還原(反應B)在文獻[6]中描述了所使用的方法。
將氫化鋁鋰LiAlH4(381mg，10.03mmol，1eq)加入到新蒸餾的二乙醚(20ml)中。
將4-戊烯腈(3)(814mg，1ml，10.03mmol)慢慢加入到溫度為0℃(冰浴)、氮氣氛下進行攪拌的反應介質中。攪拌在環境溫度下必須連續進行大約20分鐘。
接著，將水(0.4ml)、然后是20％的氫氧化鈉水溶液(0.3ml)、以及最后另一量的水(1.4ml)加入這些加入的進行必須十分小心，因為中和作用可能劇烈。當通過沉淀將二乙醚溶液與無機白色殘留物分離時，萃取上清液。
用二乙醚洗滌白色固體(殘留物)兩次，并將有機相合并。將3M的鹽酸HCl溶液加入到該有機相中，以便獲得酸性pH(pH＜7)沒有進行反應的4-戊烯腈保留在醚相中，而胺進入到水相中。
因此在萃取之后，保存水相并將3M的氫氧化鈉NaOH溶液加入其中，以使pH變為堿性pH(pH＞7)然后胺化的產物在這次新的萃取中將進入醚相中。因此將萃取的醚相用硫酸鎂(MgSO4)進行干燥，然后在真空下蒸發(旋轉蒸發器)。
然后通過分餾(球爐，T≈96℃±9℃)將粗胺(4)純化。
1H NMR分析(Brücker AM 250)
5.82(ddt，3Jtrans＝18Hz，3Jcis＝13Hz，3J(H1)＝6.5Hz，1H，CH＝)，5.00(m，2H，CH2＝)，2.70(t，3JII)＝6.5Hz，2H，CHIII)，2.10(ttd，3J(HII)＝6.5Hz，3J(HC)＝6.5Hz，3J(H2C-)＝1.5Hz，2H，CHI)，1.70(s，2H，NH2)，1.56(quint.，3J(HII)＝3J(HIII)＝6.5Hz，2H，CHII)。
13C NMR分析(Brücker AM 250)138.6(CH＝)，114.6(CH2＝)，42.0(CH2-N)，33.1(CH2)，31.4(CH2)。
實施例C還原性胺化(反應C)在文獻[7]中描述了所使用的化學方法。
將醛(2)(20.87mmol)溶解到通過氫化鈣(CaH2)新蒸餾的二甲基甲酰胺(1.2ml)中攪拌介質并加入胺(4)(31.30mmol，2eq)。在約20分鐘后，將氰基硼氫化鈉NaBH3CN(83.47mmol，4eq)加入到混合物中，將該混合物在環境溫度下持續攪拌整夜。
如果反應沒有完成，則可以再加入NaBH3CN(1eq)。接著，當反應完成時，將吡啶(2.4ml)和乙酸酐(83.47mmol，2eq/胺)加入到混合物中。
當反應完成(在加入之后約1小時)時，用二乙醚和水萃取粗化合物。將合并的有機相用硫酸鎂(MgSO4)干燥，然后進行過濾、在真空下蒸發，然后與甲苯一起共蒸發。
然后通過硅膠色譜(洗提液環己烷/乙酸乙酯的梯度從7/3到5/5)純化化合物(5)。
實施例D載體的官能化(反應D和E)在文獻[7]中描述了所使用的化學方法。
在環境溫度下，在去離子水(6ml)和99％的乙醇EtOH(8ml)的氫氧化鈉NaOH溶液(700mg)中，將可控孔度玻璃珠(6)(CPG，500，2g)非常緩和地攪拌2小時。然后離心分離小珠(billes)，提取上清液，并用去離子水充分地洗滌小珠以便達到中性pH。
然后在真空(旋轉蒸發器)下干燥小珠，并在用水洗滌、離心、干燥之前在環境溫度下保持在鹽酸溶液(0.2N HCl)中1小時，然后在80℃的保溫箱中放置15分鐘。然后用乙醇接著用甲苯(離心機)進行洗滌。
然后在參與隨后的硅烷化步驟之前將它們進行干燥，反應混合物在使用之前已經制備了。
將CPG珠(7)引入到甲苯(45ml)、三乙胺Et3N(1.35ml)和7-辛烯基三甲氧基硅烷(8)(C11H24O3Si，M 232.39，100μl)的混合物中將反應介質在80℃(保溫箱)放置16小時。
將小珠通過離心從混合物中提取出來，并用乙醇漂洗多次然后進行干燥(旋轉蒸發器)。然后將它們在110℃的溫度(保溫箱)下放置3小時，以便實施交聯步驟。
這樣實現了硅烷化和交聯步驟，必需中和在硅烷化步驟(“封端”)中還沒有反應的表面硅烷醇的殘余酸性和親水性。將氯化三甲基硅烷TMSCl(109mg，130μl)和在二氯甲烷DCM(10ml)中的三乙胺(506mg，700μl)溶液加入到硅烷化的CPG珠中，并且將混合物在25℃下保持溫和地攪拌2小時。
然后用二氯甲烷(離心機)、接著用乙腈(離心機)充分漂洗小珠。然后在真空(旋轉蒸發器)下將它們加以干燥，并放置在保溫箱(80℃)中以便完成干燥。
從而獲得硅烷化的小珠(9)。
實施例F復分解反應(反應F)在文獻[9]中描述了所使用的化學方法。
在氮氣氛下，將硅烷化的CPG珠(9)(2g，30μmol/g)在二氯甲烷(20ml)中攪拌。然后將糖-間隔物體系(5)(300μmol，＞5eq)和格拉布斯催化劑(6μmol，5mg，0.1eq)加入到介質中。然后使反應介質發生回流，即，44℃的溫度。
在6小時后，加入另一部分格拉布斯催化劑(6μmol，5mg，0.1eq)。將混合物在44℃下保持又一個6小時，然后回復到環境溫度。
將小珠濾出，并用二氯甲烷和用乙醇(離心機)充分洗滌。然后將小珠在真空下加以蒸發以便干燥。
從而獲得了糖珠(billes sucrées)(10)。
實施例A到F的反應圖解 實施例G探針的斷裂(反應G)在文獻[10]中描述了所使用的化學方法。
當已獲得體系(10)(本發明的固相載體-隔離區-寡糖鏈)時，可以斷裂隔離物，而不使糖鏈變性。
在文獻[5]中描述了實驗方案。化學反應式如下 將含糖的CPG珠(10)在1/1的二氯甲烷/甲醇混合物中慢慢地攪拌。使介質達到-78℃的溫度(丙酮+液氮)。
然后將臭氧O3鼓泡通入反應介質中直至出現藍色。
接著，在用二甲基硫中和介質之前，將氬氣鼓泡通入混合物中幾分鐘，然后留置反應介質整夜以回復到環境溫度。
用二乙醚提取小珠，過濾，并用二乙醚和用水漂洗多次。
然后將小珠(12)放到一邊，萃取(二乙醚/水)上清液，并且將有機相用硫酸鎂(MgSO4)干燥、在真空下蒸發和與甲苯一起共蒸發。
從而獲得產物(11)。
2)根據本發明的其他分子已利用上面披露的方法(實施例A到F)加以制備。在下面的實施例中將詳細描述這些分子。
實施例H在這個實施例中，[mo]為通過其C-末端連接到本發明的間隔臂的RGD(Arg-Gly-Asp)肽。載體為如上面所披露的相同的載體。因此，在這個實施例中，用RGD代替了實施例A到F的反應圖解的分子(1)。
由此獲得RGD肽連接到其上的小珠。它們具有下式 [mo]通過C-末端連接的RGD肽(Arg-Gly-Asp)實施例I這個實施例使用如在實施例H中的相同的[mo]，但通過其N-末端連接到本發明的間隔臂。此外，在本發明的間隔臂的 中，X1為C并且n＝20。術語“C”當然是用來表示氫化的碳。
獲得的小珠具有下式
[mo]通過N-末端連接的RGD肽實施例J在這個實施例中，[mo]為“唾液酸化的路易斯a因子(sialyl-Lewis a)”。載體與上面披露的方法中的載體一樣。保護基團為Boc。其連接的化學方法是本領域技術人員已知的。
由此獲得唾液酸化的路易斯a連接到其上的小珠。它們具有下式 [mo]為唾液酸化的路易斯a因子，其中“1”＝H和CH3實施例K在這個實施例中，[mo]為含硫酸鹽的化合物。載體與上面披露的方法中的載體相同。
由此獲得含硫酸鹽的化合物連接到其上的小珠。它們具有下式
[mo]為含硫酸鹽的化合物，Z為保護基團(例如在“發明內容”部分定義的Gp)在另一種方案中，碳X4用硫原子代替。獲得相應的小珠。
實施例L在這個實施例中，[mo]為受保護的糖。載體與上面披露的方法中的載體相同。
由此獲得受保護的糖連接到其上的小珠。它們具有下式 受保護的糖實施例M在這個實施例中，[mo]為唾液酸。載體與上面披露的方法中的載體相同。
由此獲得唾液酸連接到其上的小珠。它們具有下式
唾液酸參考文獻[1]WO-A-03/008927Dukler，N.Dotan，A.Shtavi，A.Gargir. H.M.I.Osborn，T.H.Khan，Tetrahedron，1999，55，1807-1850. D.A.Stetsenko，M.J.Gai，Bioconjugate Chemistry，2001，12，576-586. US-A-6,579,725P.H.Seeberger，R.B.Andrade. R.Roy，C.A.Laferriere，Canadian Journal of Chemistry，1990，68，2045-2054. L.H.Amundsen，L.S.Nelson，Journal of the American ChemicalSociety，1951，73，242-244. J.F.Tolborg，K.J.Jenson，Chemical Communication，2000，147-148. F.Vinet，A.Hoang，EN 00 16940. K.Biswas，D.M.Coltart，S.J.Danishefsky，Tetrahedron Letters，2002，43，6107-6110. C.Sylvain，A.Wagner，C.Miokowski，Tetrahedron Letters，1997，38，1043-1044. Q.J.Plante，E.R.Palmacci，P.H.Seeberger，Science，2001，291，1523-1527. P.H.Seeberger，Chem.Com.，2003，1115-1121. D.M.Ratner，E.R.Swanson，P.H.Seeberger，Org.Lett.2003，4717-4720.
權利要求
1.下式(I)的分子間隔臂 -其中X0和X4為可進行調節的取代基以便使[mo]和[Sup]通過所述間隔臂進行連接，X0和X4不同于H并且各自獨立于間隔臂的其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As和Si；以及-其中，取代基X1、X2、X3、Z1、Z2、R1、R2和R3為如下X1、X2和X3各自獨立于其他取代基地選自C、O、N、S、Se、P、As和Si，以及選自各含有2至20個碳原子的芳基和雜芳基；Z1和Z2各自獨立于其他取代基地選自C-R、Si-R、C、N、P以及As，其中R為含有1至40個碳原子的烷基；R1、R2和R3各自獨立于其他取代基地選自H、烷基、芳基以及雜芳基，每個含有2至20個碳原子；[Gp]表示保護仲胺-N-的基團或參與間隔臂官能化的分子；-其中，n、m以及p各自為大于或等于1的整數并彼此獨立地進行選擇，優選地使得1≤n、m和p≤40；-其中，[Sup]表示H或硅烷化固相載體，所述間隔臂可共價連接到所述載體上；以及-其中，[mo]表示H或用于通過所述間隔臂共價連接到所述硅烷化固相載體的分子單元。
2.根據權利要求1所述的間隔臂，其中，X0和X4獨立于其他取代基地選自C、O、N、S及Si；和/或X1、X2和X3獨立于其他取代基地選自C、O、N、S和Si，以及選自各含有2至10個碳原子的芳基和雜芳基；和/或Z1和Z2獨立于其他取代基地選自C、N、C-R及Si-R，其中R為含有1至30個碳原子的烷基；和/或R1、R2和R3獨立于其他取代基地選自H、烷基、芳基以及雜芳基，每個含有2至10個碳原子。
3.根據權利要求1所述的間隔臂，其中，所述保護基團[Gp]選自Ac、芐基、C1～C40芳基、Troc、z、TCA、BOC以及Fmoc。
4.根據權利要求1所述的間隔臂，其中，所述固相載體[Sup]，當其存在時，選自板、小珠和毛細管。
5.根據權利要求1或4所述的間隔臂，其中，所述[Sup]是基于二氧化硅或玻璃的。
6.根據權利要求1所述的間隔臂，其中，所述[mo]，當其存在時，為分子量在180～400000g.mol-1范圍內的分子。
7.根據權利要求1所述的間隔臂，其中，所述[mo]，當其存在時，選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物、肽、蛋白質、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂以及糖脂蛋白。
8.根據權利要求1所述的間隔臂，其中，所述[mo]，當其存在時，為糖。
9.根據權利要求1到8中任一項所述的間隔臂的應用，用于將分子單元[mo]連接到硅烷化的固相載體[Sup]上。
10.根據權利要求9所述的應用，其中，所述[mo]為分子量在180～400000g.mol-1范圍內的分子。
11.根據權利要求9所述的應用，其中，所述[mo]選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物以及天然或合成的小分子；并且所述[Sup]表示所述間隔臂可連接到其上的硅烷化固相載體。
12.根據權利要求9所述的應用，其中，所述[Sup]選自板、小珠或毛細管。
13.根據權利要求12所述的應用，其中，所述[Sup]是基于二氧化硅或玻璃的。
14.根據權利要求9到13中任一項所述的應用，用于制備生物芯片。
15.根據權利要求9到13中任一項所述的應用，用于制備糖芯片。
16.用于通過間隔臂將分子單元[mo]共價連接到載體的方法，所述方法包括以下步驟(i)還原下式化合物的腈官能團 (ii)從下式的生物分子的烯丙基官能團形成醛官能團 (iii)在所述經還原的腈官能團和所述醛官能團之間，進行還原性胺化，接著對形成的仲胺進行保護，以便獲得用于連接到載體上的活化的生物分子，所述活化的生物分子為下式 (iv)使固相載體硅烷化，以及使具有下式的分子的所述硅烷化的固相載體官能化 (v)在使載體官能化的所述分子和所述活化的生物分子之間進行復分解反應，以便形成根據本發明的連接所述生物分子和所述載體的間隔臂；在所述方法中，取代基X0、X1、X2、X3、X4、Z1、Z2、R1、R2、R3以及[mo]為根據權利要求1所定義的。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，下式的化合物為烯丙基化的糖，所述[mo]為所述糖，
18.根據權利要求16所述的方法，其中，所述[Sup]選自板、小珠或毛細管。
19.根據權利要求16或18所述的方法，其中，所述[Sup]為基于二氧化硅或玻璃的。
20.根據權利要求16所述的方法，其中，所述[mo]為分子量在180至400 000g.mol-1范圍內的分子。
21.根據權利要求16所述的方法，其中，所述[mo]選自單糖、寡糖、多聚寡糖、糖綴合物、肽、蛋白質、酶、糖蛋白、脂、脂肪酸、糖脂以及糖脂蛋白。
22.根據權利要求16所述的方法，其中，所述[mo]為糖。
23.根據權利要求16所述的方法，還包括由將保護基團[Gp]連接到所述仲胺官能團上構成的步驟。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，所述[Gp]選自Ac、芐基、C1～C40芳基、Troc、z、TCA、BOC以及Fmoc。
25.根據權利要求16到24中任一項所述的方法在制備生物芯片中應用。
26.根據權利要求16到24中任一項所述的方法在制備糖芯片中的應用。
全文摘要
本發明涉及分子間隔臂、用于將分子單元連接到固相載體的方法、以及該間隔臂在包含分子或生物分子的分析芯片上的應用。所述間隔臂具有以上化學式(I)，其中，X
文檔編號G01N33/543GK1922195SQ200580005558
公開日2007年2月28日 申請日期2005年2月22日 優先權日2004年2月25日
發明者韋羅妮克·佩雷蒂, 弗朗索瓦絲·維內, 達維德·博納夫 申請人:法國原子能委員會