專利名稱：快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于果蔬及原糧類食品中甲霜靈殘留檢測試紙及其檢測方法，屬膠體金免疫檢測領域。
背景技術：
由于蔬菜生長期短且病蟲害較為嚴重，因而，在蔬菜種植過程中常常需要連續多次施藥。而不少蔬菜需要多次采收，采收與施藥的時間間隔短，造成采收時蔬菜中的農藥殘留量往往較高，很容易超過國家規定的標準。而蔬菜中農藥殘留量超標會嚴重影響人類健康水平，已成為不容忽視的食品污染源。政府和各職能部門對食品的農藥殘留問題十分關注。但由于農藥的毒性和害蟲的抗藥性形成一個惡性循環，因此全面徹底禁止高劇毒農藥的使用將有一個較長的過程，即使是全面使用中、低毒農藥，農藥惡性中毒事件仍然發生。因此對分析檢測的對象、種類、數量、范圍、指標等諸多方面都提出了新的要求和更高標準。
甲霜靈(metalaxyl，D，L-N-(2，6-二甲基苯基)-N-(2’-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯)，屬苯基酰胺類，是一種作為保護和治療作用的內吸性殺菌劑，可由種子、根、莖、葉吸收并傳導到植物內部，適用于由空氣和土壤帶菌病害的預防和治療，主要用于防治各種氣候條件下由霜霉目真菌引起的病害。如馬鈴薯晚疫病、葡萄霜霉病、煙草霜霉病、啤酒花霜霉病和萵苣霜霉病。雖然甲霜靈對人畜的毒性不高，但是屬于內吸性殺菌，在食品和蔬菜中的殘留量季節性超標情況較多，中毒事件常有發生。鑒于上述情況，甲霜靈已被列為農藥殘留的重要檢測對象。
目前，檢測農藥殘留的分析方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質譜(MS)聯用法(GC/MS)。“酶抑制率法+分光光度法”已被列為國家推薦標準(GB/T 5009.199-2003)。該法快速、靈敏、操作簡便且成本低廉，可實現快速初篩，但受檢測范圍和精度的限制。而氣相色譜法(GC)可實現精度的定量分析但速度較慢，檢測成本較高。總之，這些方法普遍存在著樣品前處理過程復雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，耗時，檢測設備昂貴，并要求有專業的技術人員及較長的分析周期。
因此，利用競爭法原理，在傳統免疫檢測法的基礎上引入了膠體金快速檢測技術，研制出甲霜靈膠體金競爭法檢測試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業人員檢測，真正達到復雜原理與簡易操作的有機統一，同時具有保存方便，有效期長的特點。
發明內容
本發明針對上述存在的一些問題，提供了一種適用于檢測甲霜靈是否超標的膠體金測定試紙。
為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的在甲霜靈殘留檢測試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和甲霜靈單克隆抗體金標墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在甲霜靈單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。關于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標墊的組合方法已是公知技術。萬華普曼生物工程有限公司于1998年獲得競爭法檢測嗎啡試紙的國藥字批準文號國藥準字S19990038號，并將產品投放市場。
甲霜靈殘留檢測試紙的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，試驗線是由甲霜靈-BSA包被。把檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入果蔬汁中，由于毛細管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當移動至甲霜靈單克隆抗體金標墊時，樣品中的甲霜靈與甲霜靈單克隆抗體金標探針發生特異結合，當移動至固定有甲霜靈-BSA聯結物試驗線時，由于甲霜靈單克隆抗體金標墊中的抗體與樣品中甲霜靈優先結合成復合物而失去其與甲霜靈-BSA結合，因此其膠體金不能滯留于試驗線上，試驗線處沒有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽性；相反如果樣品中沒有甲霜靈，甲霜靈單克隆抗體金標墊中的抗體移動到試驗線上，甲霜靈單克隆抗體就會與甲霜靈-BSA聯結物發生特異結合，使膠體金滯留于試驗線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競爭法原理。試驗線的顏色深淺與樣品中甲霜靈含量高低成反比。從陽性過渡到陰性，由于所測甲霜靈含量不同，試驗線的顏色也不同，形成一個紅色顏色梯度差，以這種原理檢測出OD值，從而推斷出試驗線所反應實際甲霜靈的量。
試驗線的最低檢出量可達甲霜靈含量為50ng/ml。試驗線的檢測值設定為國家頒布的果蔬農藥殘留檢測標準甲霜靈含量為0.5mg/kg或小粒水果農藥殘留檢測標準甲霜靈含量為1mg/kg或原糧農藥殘留檢測標準甲霜靈含量為0.05mg/kg。
用競爭法制成試紙其檢測甲霜靈設定檢出量以上，觀察窗處出現一條紅線為陽性；設定檢出量以下出現雙紅線為陰性；設定檢出量時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，從而得出判斷。
當移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無甲霜靈，標記的金標探針都會與已設定好的羊抗鼠多克隆抗體結合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產生則代表操作有誤，檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經過期。
由于采用上述技術方案，本發明所提供的一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，而且結果易讀。
圖1為本發明一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙的主視結構圖。
圖2為發明圖一的側視結構圖。
圖3為檢測顯示陽性結果圖。
圖4為檢測顯示陰性結果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗線，5、單克隆抗體金標墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實施例1.利用化學方法將小份子甲霜靈與大分子BSA聯接合成免疫原即甲霜靈-BSA。
2.甲霜靈單克隆抗體的制備(1)將制備的甲霜靈-BSA免疫BALB/c小鼠。用SP20細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能同時與甲霜靈分子結合的單克隆抗體用于膠體金標記。
3.膠體金的制備及與甲霜靈單克隆抗體的結合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90～95℃，加入適量枸櫞酸三納繼續加熱攪拌至沸騰5分鐘，冷卻后避光保存備用。
(2)把甲霜靈單克隆抗體標記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4.制膜機制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合按公知技術組合。
6.使用方法把試紙的樣品吸液層端放入果蔬汁中(液面不得超過MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時觀察結果。
7.結果判斷檢測甲霜靈濃度0.5mg/kg以上，觀察窗處出現一條紅線為陽性；0.5mg/kg以下出現雙紅線為陰性；0.5mg/kg時在試驗線處為一條模糊陰影線為界限值，此界限值為國家頒布的蔬菜農藥殘留檢測標準0.5mg/g。從而得出判斷。
權利要求1.一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、甲霜靈單克隆抗體金標墊(5)、樣品吸液層(6)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和甲霜靈單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在甲霜靈單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。
2.根據權利要求1所述的一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
3.根據權利要求1所述的一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線是由甲霜靈-BSA包被制成。
4.根據權利要求1所述的一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于金標墊是由甲霜靈單克隆抗體作為膠體金標記。
5.根據權利要求1所述一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線的檢測值設定為國家頒布的果蔬農藥殘留檢測標準甲霜靈含量為0.5mg/kg。
6.根據權利要求1所述一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線的檢測值設定為國家頒布的小粒水果農藥殘留檢測標準甲霜靈含量為1mg/kg。
7.根據權利要求1所述一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線的檢測值設定為國家頒布的原糧農藥殘留檢測標準甲霜靈含量為0.05mg/kg。
8.根據權利要求1所述一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗線的檢測值設定為最低檢出量甲霜靈含量為50ng/ml。
專利摘要一種快速檢測甲霜靈殘留的膠體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、甲霜靈單克隆抗體金標墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有甲霜靈－BSA聯結物試驗線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和甲霜靈單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在甲霜靈單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層，通過膠體金免疫競爭方法制成試紙，利用免疫膠體金法來檢測果蔬中的甲霜靈殘留量是否超標。該方法具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業人員檢測，真正達到復雜原理與簡易操作的有機統一，同時具有保存方便，有效期長的特點。
文檔編號G01N33/543GK2833595SQ20052010617
公開日2006年11月1日 申請日期2005年8月24日 優先權日2005年8月24日
發明者萬積成 申請人:萬積成