專利名稱：單細(xì)胞藻流式分析微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種利用流式細(xì)胞儀原理設(shè)計(jì)制作的適用于海洋單細(xì)胞藻檢測的微流控芯片。
背景技術(shù)：
微全分析系統(tǒng)(Micro-total analysis system，μ-TAS)概念的提出在分析科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，引導(dǎo)化學(xué)分析設(shè)備向著微型化、集成化與便攜化的趨勢發(fā)展。它利用微加工工藝在芯片上制作微閥、微管道、微反應(yīng)器、微流量傳感器、微檢測器等功能單元構(gòu)成微型化學(xué)系統(tǒng)。微流控芯片系統(tǒng)具有高效、低耗、微型化和集成化的特點(diǎn)，適于各類現(xiàn)場分析和實(shí)時測定。1995年Mathies和Woolley首次采用微電泳芯片進(jìn)行了DNA測序研究，在有效分離長度3.5cm的通道上，10min內(nèi)測序約150個堿基，準(zhǔn)確率97％。1998年Ramsey等在微流控芯片上集成了細(xì)胞消解、PCR擴(kuò)增和電泳分離等功能的微芯片基因分析系統(tǒng)。
流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液，用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。
使用流式細(xì)胞儀檢測微型浮游植物正為越來越多的研究者所采用，Paau等和Yentsch等都作了相關(guān)研究，促進(jìn)了流式細(xì)胞計(jì)在海洋微型浮游植物檢測中的運(yùn)用。流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，細(xì)胞體內(nèi)色素及其他物質(zhì)在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。特定波長熒光信號的強(qiáng)度代表了所測單細(xì)胞藻中色素的組成和含量。但目前，流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不適用于現(xiàn)場分析，微流控芯片的出現(xiàn)為流式細(xì)胞技術(shù)的現(xiàn)場應(yīng)用提供了可能。
發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是提供一種微型、便攜且適于現(xiàn)場分析的微流控芯片，它可以對海洋單細(xì)胞藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和種群組成分析。
本實(shí)用新型是以標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)為基礎(chǔ)，以玻璃為微流控芯片材料，在芯片上構(gòu)建微通道和微儲液池，使樣品的進(jìn)樣、檢測集成在芯片上來完成。微流控芯片包括結(jié)構(gòu)對稱的基片和蓋片，在基片和蓋片上構(gòu)建有液流系統(tǒng)和用于檢測的光纖通道。液流系統(tǒng)采用ψ型結(jié)構(gòu)，中間通道為樣品通道，兩側(cè)支通道稱為鞘流通道，鞘流通道的作用是樣品中的藻細(xì)胞以單行排列，樣品通道與鞘流通道尺寸一致，鞘流通道為1/4圓弧狀，樣品通道與鞘流通道端點(diǎn)切線方向相一致，這樣鞘流與樣品流同向匯合，避免液流匯合產(chǎn)生渦流擾動，保證了液流系統(tǒng)的穩(wěn)定性；樣品通道與鞘流通道的末端分別構(gòu)建有儲液池，樣品通道的另一端還有一廢液池；在芯片上構(gòu)建與進(jìn)樣通道垂直的光纖通道，使激光器耦合光纖水平插入該通道，將激發(fā)光引入到分離通道的檢測區(qū)域附近。在進(jìn)樣通道的另一側(cè)與入射光光纖通道平行的位置構(gòu)建光纖通道，用于將前向散射光引入相應(yīng)檢測器。在芯片進(jìn)樣通道監(jiān)測區(qū)域上方安置光學(xué)檢測系統(tǒng)，檢測熒光和側(cè)向散射光，當(dāng)藻細(xì)胞經(jīng)過檢測口時，受到激光照射，產(chǎn)生熒光(黃熒光、紅熒光、綠熒光)和散射光(前向散射和側(cè)向散射)，通過對幾種光信號的綜合分析，對藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。該芯片省去了由多個光學(xué)元件才能完成的三維準(zhǔn)直、反射和會聚復(fù)雜光路系統(tǒng)，將光傳輸過程中的強(qiáng)度損失降到最低，實(shí)現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化、便攜化和集成化的特點(diǎn)。
本實(shí)用新型將流式細(xì)胞儀液流系統(tǒng)和光學(xué)檢測系統(tǒng)集成，體現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化和集成化的特點(diǎn)，適于各類現(xiàn)場分析和實(shí)時測定。廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞藻、培養(yǎng)細(xì)胞、血球等領(lǐng)域。
圖1是本實(shí)用新型的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
其中，1-樣品入口；2，3-鞘流入口；4-廢液池；5-樣品通道；6，7-鞘流通道；8-通道交匯點(diǎn)；9-入射光纖通道，10-出射光纖通道。
圖2是單細(xì)胞藻流式分析芯片系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
其中，11，12，13-微型泵；14，16-鞘流；15-樣品；17，18，19-熒光檢測器；20-側(cè)向散射光檢測器；21-帶通濾波器；22-二向色濾光片；23-激光器，24-檢測器。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本實(shí)用新型。
實(shí)施例1微流控芯片的結(jié)構(gòu)如圖1所示，微流控芯片結(jié)構(gòu)分兩部分液流系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。液流系統(tǒng)采用ψ型結(jié)構(gòu)，中間通道為樣品通道5，兩側(cè)支通道為鞘流通道6和7，鞘流通道的作用是使樣品中的藻細(xì)胞呈單行排列，樣品通道5與鞘流通道6和7尺寸一致，鞘流通道為1/4圓弧狀，鞘流通道6和7在交匯點(diǎn)8的切線方向與樣品通道5方向相一致，這樣，鞘流與樣品流同向匯合，避免液流匯合產(chǎn)生渦流擾動，保證了液流系統(tǒng)的穩(wěn)定性；在芯片上構(gòu)建與樣品通道垂直的光纖通道9，10，使激光器23耦合光纖水平插入該通道，將激發(fā)光引入到分離通道的檢測區(qū)域附近。在進(jìn)樣通道的另一側(cè)與入射光光纖通道平行的位置構(gòu)建光纖通道，用于將前向散射光引入檢測器24。在芯片進(jìn)樣通道檢測區(qū)域上方安置光學(xué)檢測系統(tǒng)，熒光檢測器17，18，19和側(cè)向散射光檢測器20分別接收相應(yīng)光信號，當(dāng)藻細(xì)胞經(jīng)過檢測口時，受到激光照射，產(chǎn)生熒光(紅熒光、黃熒光、綠熒光)和散射光(前向散射和側(cè)向散射)，熒光和散射光通過二向色濾光片22和帶通濾波器21的選擇性透射和反射，到達(dá)相應(yīng)檢測器。通過對幾種光信號的綜合分析，對藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。該芯片省去了由多個光學(xué)元件才能完成的三維準(zhǔn)直、反射和會聚復(fù)雜光路系統(tǒng)，將光傳輸過程中的強(qiáng)度損失降到最低，實(shí)現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化、便攜化和集成化的特點(diǎn)。
實(shí)施例2微流控芯片的制作1.玻璃基片的制作掩膜膠片上微通道的尺寸設(shè)計(jì)流體通道，30μm；光纖通道，60μm；光纖通道與分離通道間的距離d400μm。將掩膜膠片置于63mm×63mm×1.5mm的勻膠鉻板上，紫外線曝光180秒(波長365nm)，顯影液中顯影100秒后，100℃下烘干半小時。在室溫下用鉻膜刻蝕液(硫酸鈰∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蝕鉻膜，然后用高純水沖洗干凈，烘干。通過數(shù)碼顯微鏡攝像，測得鉻板上的通道尺寸為流體通道，40μm；光纖通道，70μm。用0.5M HF/0.5M NH4F刻蝕劑腐蝕裸露的硼硅玻璃，速率約為10μm/h，刻蝕6小時后，再依次用丙酮、鉻膜刻蝕液除去殘余光膠層和鉻膜，即得基片。用微型臺鉆打孔，鉆頭為1mm的金剛鉆頭，孔的直徑即為液池直徑1mm。顯微鏡下測定微通道尺寸微流體通道，上底寬160μm，下底寬50μm，深度60μm；光纖通道，上底寬190μm，下底寬80μm，深度60μm；光纖通道與分離通道間的距離d340μm；將除光纖通道外的其他區(qū)域用膠帶保護(hù)好，繼續(xù)刻蝕光纖通道，直到通道尺寸達(dá)到上底寬600μm，下底寬80μm，深度270μm；光纖通道與分離通道間的距離d120μm2.蓋片的制作與基片制作方法相同，構(gòu)造相同，但不打孔。
3.將基片與蓋片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高純水中超聲清洗5-10分鐘，用氮?dú)獯蹈桑缓笤诔瑑舡h(huán)境中將兩者對齊密封，高溫下鍵合。升溫程序?yàn)橐?0℃/min從室溫升至550℃，時間30分鐘；以20℃/min從550℃升至610℃，時間30分鐘；以20℃/min從610℃升至635℃，時間30分鐘；以10℃/min從635℃升至650℃，時間6小時。然后自然冷卻到室溫。經(jīng)顯微鏡下觀測，鍵合后通道無變形，且達(dá)到完全密封。鍵合后的芯片微通道呈橢圓形，樣品通道長軸長約190μm，短軸長約120μm；光線通道長軸約600μm，短軸約540μm。
實(shí)施例3微流控芯片分析檢測系統(tǒng)如圖2所示，在樣品通道5的進(jìn)口1接進(jìn)樣泵12，兩側(cè)鞘流通道6和7在其入口2和3處接鞘流14，16。樣品和鞘流液通過泵11、12和13輸送，鞘流與樣品同向流動，鞘流液與樣品在匯合點(diǎn)8匯合后以層流的形式向前流動，通過調(diào)節(jié)鞘流和樣品流速，使樣品中細(xì)胞呈單行排列，并向前移動通過檢測區(qū)，在檢測區(qū)域細(xì)胞被來自光纖的激光激發(fā)，通道另一側(cè)的光纖接受前向散射光，并將其傳輸?shù)焦鈱W(xué)檢測器24，側(cè)向的光經(jīng)二向色濾光片22和帶通濾波器21的分光、濾光，分別被側(cè)向散射光檢測器20、紅色熒光檢測器17、黃色熒光檢測器18和綠色熒光檢測器19接收記錄，綜合各類光信號得到微型浮游植物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的信息。
本實(shí)用新型在利用流式細(xì)胞儀基本原理設(shè)計(jì)制作的微流控芯片上構(gòu)建了實(shí)現(xiàn)流式細(xì)胞技術(shù)所需的液流系統(tǒng)和檢測通道，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞藻流式分析系統(tǒng)的微型化、集成化和簡單化；制造成本低，易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。
權(quán)利要求1.一種單細(xì)胞藻流式分析微流控芯片，其特征在于它包括結(jié)構(gòu)對稱的基片和蓋片，在基片和蓋片上構(gòu)建有包括中間樣品通道和兩側(cè)鞘流通道的ψ型結(jié)構(gòu)的液流系統(tǒng)和用于檢測的光纖通道。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的鞘流通道為1/4圓弧狀，樣品通道與鞘流通道通端點(diǎn)切線方向相一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的光纖通道與進(jìn)樣通道互相垂直。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于它是以玻璃為材料制作的。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種單細(xì)胞藻流式分析微流控芯片，它包括結(jié)構(gòu)對稱的基片和蓋片，在基片和蓋片上構(gòu)建有包括中間樣品通道和兩側(cè)鞘流通道的ψ型液流系統(tǒng)和用于檢測的光纖通道；樣品通道與鞘流通道尺寸一致，鞘流通道為1/4圓弧狀，樣品通道與鞘流通道端點(diǎn)切線方向相一致；在芯片上構(gòu)建與進(jìn)樣通道垂直的光纖通道，使激光器耦合光纖水平插入該通道，將激發(fā)光引入到分離通道的檢測區(qū)域附近；在芯片進(jìn)樣通道監(jiān)測區(qū)域上方安置光學(xué)檢測系統(tǒng)，檢測熒光和側(cè)向散射光，通過對光信號的綜合分析，對藻進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類。該芯片省去了由多個光學(xué)元件才能完成的三維準(zhǔn)直、反射和會聚復(fù)雜光路系統(tǒng)，將光傳輸過程中的強(qiáng)度損失降到最低，實(shí)現(xiàn)了微流控芯片系統(tǒng)的微型化、便攜化和集成化的特點(diǎn)。
文檔編號G01N21/64GK2821565SQ20052008437
公開日2006年9月27日 申請日期2005年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月19日
發(fā)明者蘇榮國, 王修林, 祝陳堅(jiān) 申請人:中國海洋大學(xué)