專利名稱：心血管疾病診斷和預測多指標蛋白芯片檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于體外臨床檢驗和生物芯片技術領域，確切地說，是一種適于心血管疾病的診斷，預測和預后的八項指標(CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，FABP和GPBB)集成檢測的反應板和試劑盒背景技術心血管疾病包括心臟和血管系統疾病。20世紀以來，隨著人類社會文明的進步，醫學技術得到大幅度發展，感染性疾病逐步得到控制。而經濟的發展，人們生活水平和生活方式的改變，使人類疾病譜也發生了顯著變化，即轉向慢性非傳染性疾病為主向的改變。其中心血管疾病在西方國家已逐步成為引起死亡的主要病因，由心血管疾病引起的死亡人數約占世界總死亡人數的1/4，被稱為人類健康的“頭號殺手”，嚴重威脅人類的生命和生活質量，造成巨大的人力和經濟資源的浪費。因此建立一套可以準確、快速、方便地預測和診斷心血管疾病的檢測系統已迫在眉睫。
目前最常見的心血管疾病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱為冠心病，是由冠狀動脈粥樣硬化導致的管腔阻塞所引起，并進一步導致心肌缺血、缺氧所引起的心臟組織壞死以及冠狀動脈功能性改變。
大量的研究表明冠狀動脈粥樣硬化本身是一個炎癥的過程，持續的低水平的炎癥預示著心血管疾病發生的可能性。目前在炎癥指標中，C-反應蛋白(high sensitivity-CRP(hs-CRP))對心血管，腦血管以及外周血管疾病有著最好的預測及預后效果。
當冠心病發作時，心肌的缺血缺氧所導致的心肌損傷，會使得一些心肌細胞蛋白被釋放入血，這些指示蛋白對冠心病的診斷有著及其重要的意義。目前，醫院檢測冠心病最為常用的指標是CK-MB，但它的地位正被cTnI和cTnT這兩個同時具有高靈敏度和高特異性的“金指標”所取代。但這兩個指標釋放入血的時間相對較晚，因此還需要Myoglobin，FABP和GPBB這三個指標的配合來進行早期的診斷。
除了冠心病以外，充血性心力衰竭也是一種常見的心血管疾病，NT-proBNP是診斷這種疾病的最靈敏和有效的指標。
目前對心血管疾病的診斷和預測主要是對單個指標進行檢測，費時費力。本實用新型通過對八個指標的快速檢測實現對心血管疾病的發生和發展進行全面的預測，診斷及預后，對心血管疾病的預防和治療有著重要的指導意義。
發明內容
本實用新型的目的是提供一種可同時對心血管疾病進行預測，診斷和預后判斷的方法。我們的試劑盒通過檢測血清或血漿中的CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，FABP和GPBB這八項指標，來達到這一目的。
在本實用新型的第一方面，提供了一種心血管疾病的診斷和預測八項指標集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括12-200個樣本孔，5-8個標準品孔，其中，其特征在于每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的微點陣。在每一反應孔內還設有一定位基準點。
在一優選例中，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
在另一優選例中，所述樣本孔的數量為4-195個。
在另一優選例中，所述的抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體在固相載體上各有2個點樣點。
在另一優選例中，所述反應孔每孔設有一個定位基準點。
在本實用新型的第二方面，提供了一種心血管疾病的診斷和預測八項指標集成檢測試劑盒，它包括本實用新型上述的心血管疾病的診斷和預測六項指標集成檢測反應板。
在另一優選例中，還包括酶標工作液、檢測液和標準品。
在另一優選例中，所述的酶標工作液由HRP標記的相應抗原或單克隆抗體組成，所述的檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
在另一優選例中，所述的發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
圖1是本實用新型一種固相載體上心血管疾病檢測的八項指標的點樣示意圖圖2是本實用新型的反應孔中進行的各抗原——抗體反應的示意圖具體實施方式
心血管疾病八項指標集成檢測的關鍵是要使八項指標檢測的靈敏度和特異性均達到要求以保證結果的準確可靠，而相應的難點是如何將濃度差高達10000倍的各檢測指標整合到一個孔里來檢測。經過深入而廣泛的研究，本實用新型采用兩種不同的反應方式進行檢測，并對檢測反應板作了改進，同時本實用新型采用的微點陣檢測技術，酶免疫間接法和化學發光檢測技術，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，從而解決了上述問題。
具體而言，為提高心血管疾病八項指標(CRP，Myoglobin，cTnI，cTnT，NT-proBNP，CK-MB，FABP和GPBB)的檢測效率，本實用新型應用微點陣檢測技術，結合酶免疫間接法和化學發光檢測技術設計了一種心血管疾病八項指標集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括12-200個樣本孔，5-8個標準品孔，其中，其特征在于每一反應孔的底部平面上有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的微點陣。
各反應孔的數量沒有特別限制，通常樣本孔為12-200個，較佳地5-50個。標準品孔3-10個，較佳地5-8個。
在本實用新型中，反應孔的形狀和大小沒有特別限制，可以是圓形、方形、六角形、橢圓形、或其他形狀。大小通常為直徑0.5-5cm，深度為0.5-2cm。
在本實用新型中，反應板基板的材料可以選用本領域常用的各種材料，較佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本實用新型中，包被心血管疾病抗體的固相載體可以選用本領域常用的各種固相載體，包括(但并不限于)玻璃片、塑料、硝酸纖維(NC)膜、PDVF膜等，較佳的固相載體包括NC膜、PDVF膜。
在固相載體上，各有抗CR，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體1-3個點樣點，較佳地2個點樣點。此外，較佳地在固相載體上還包括一個定位點(見圖1)。各點樣點之間的距離通常為0.1-5mm。
另一方面，本實用新型還提供了一種心血管疾病八項指標集成檢測蛋白芯片試劑盒，該試劑盒可實現多指標并行化、微型化、高通量檢測。它包括本實用新型的反應孔板、洗滌液、酶標工作液、檢測液(A、B)、標準品等。其中，酶標工作液由HRP標記的相應抗原或單克隆抗體組成，檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成，發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，使用前混合。
在本實用新型中，各指標的檢測采用酶免夾心法或競爭法，檢測原理如圖2夾心法和圖3競爭法所示。詳細敘述如下1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。封閉，除去未結合的位點。
2)加受檢血清和酶標溶液，酶標溶液包含八項檢測指標的相應的酶標抗體(夾心法)或酶標抗原(競爭法)。對于采用夾心法檢測的指標，特異的酶標抗體(圖示為 與血清中的抗原(圖示為 形成復合物，并進一步與固相抗體(圖示為 形成雙抗夾心復合物。對于采用競爭法檢測的指標，特異的酶標抗原(圖示為 與血清中的抗原(圖示為 競爭性地與固相抗體(圖示為 結合，形成抗原抗體復合物。
3)洗滌除去未結合的抗體，抗原及雜質。
4)加底物固相上的酶催化底物，化學發光，CCD檢測，光強度與標本中受檢抗原的量呈正相關(夾心法)或負相關(競爭法)。
本實用新型巧妙地綜合利用了蛋白質微點陣檢測技術，酶免疫夾心法和競爭法，以及化學發光檢測技術，實現了心血管疾病八項指標的同時檢測。
下面結合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應理解，這些實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1檢測反應板的制備取48孔板，設置42個樣本孔，6個標準品孔。在每個反應孔的底部放置一固相載體(NC膜或PDVF膜)，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myoglobin，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的蛋白質微列陣(圖1)。
實施例2試劑盒制備制備含一心血管疾病八項指標集成檢測的試劑盒，它含有實施例1的反應孔板一塊(24-48人份)，洗滌濃縮液1瓶，酶標工作液1瓶，檢測液A一瓶，檢測液B一瓶，標準品瓶。
洗滌濃縮液、酶標工作液、檢測液A、檢測液B實施例3心血管疾病八項指標集成檢測按以下方法對各測試血請樣品進行檢測1.加檢測血請或標準品于相應反應孔內，75ul/孔。
2.加酶標工作液，75ul/孔。
3.37℃保溫振蕩反應60分鐘。
4.用洗液洗滌4-6次，每次2分鐘，振動。
5.加檢測液20ul/孔，使檢測液均勻分布于孔的底部。
6.CCD檢測，視發光信號強度曝光30-60秒。
結果判定依據不同指標的CutOff值，參考標準品梯度曲線，判定樣品血清的陰陽性。
與此同時，用常規方法對測試的血清樣品進行常規檢測。結果表明，用本實用新型的試劑盒得出的測試結果與常規方法相同。
在本實用新型提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本實用新型的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權力要求書所限定的范圍。
權利要求1.一種心血管疾病的診斷和預測八項指標集成檢測反應板，其特征在于，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括12-200個樣本孔，5-8個標準品孔，其中，其特征在于每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體的微點陣。在每一反應孔內還設有一定位基準點。
2.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
3.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述樣本孔的數量為4-195個。
4.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述的抗CRP，抗CRP，抗Myo，抗cTnI，抗cTnT，抗NT-proBNP，抗CK-MB，抗FABP和抗GPBB等八種抗體在固相載體上各有2個點樣點。
5.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，在每一反應孔內還設有一定位基準點。
6.一種心血管疾病的診斷和預測八項指標集成檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，它包括權利要求1所述的心血管疾病的診斷和預測八項指標集成檢測反應板。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括酶標工作液，檢測液和標準品。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標工作液由HRP標記的相應抗原或單克隆抗體組成，所述的檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
專利摘要本實用新型涉及心血管疾病的診斷和預測的八項指標集成檢測反應板和蛋白芯片試劑盒。所述的反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括12－200個樣本孔，5－8個標準品孔，其中，每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著抗CRP(C－反應蛋白)，抗Myoglobin(肌紅蛋白)，抗cTnI(心肌肌鈣蛋白I)，抗cTnT(心肌肌鈣蛋白T)，抗NT－proBNP(N－末端腦利鈉肽)，抗CK－MB(肌酸激酶同工酶－MB)，抗H－FABP(心型脂肪酸結合蛋白)和抗GPBB(糖原磷酸化酶同工酶BB)等八種抗體的微點陣。本實用新型的反應板和試劑盒可簡便、快速、準確地實現多個人份的心血管疾病的診斷和預測八項指標的同時檢測。
文檔編號G01N33/531GK2783324SQ20052004121
公開日2006年5月24日 申請日期2005年4月28日 優先權日2005年4月28日
發明者穆海東 申請人:穆海東