一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法

專利名稱：一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法
技術領域：
本發明屬于生命科學蛋白質組技術領域，特別涉及小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的精確鑒定以及基于此技術方法對麥谷蛋白亞基的進一步表征。
背景技術：
小麥是世界上栽培面積最大、產量最高、地理分布最廣的重要農作物，其種植面積和產量約占谷物作物的30％，被廣泛應用于食品加工業與家畜飼養業。小麥種子中含有其他糧食作物中所欠缺的面筋蛋白，可制作面包、面條、餅干、糕點和饅頭等多種專用食品。因此，種子蛋白的組成和含量在很大程度上決定小麥加工品質的優劣。
Osborne(1907)根據溶解特點的不同將小麥種子蛋白分為以下四類清蛋白和球蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白。研究表明，小麥谷蛋白多聚體是自然界最大的蛋白分子(Wrigley，1996；Stevenson和Preston，1996)。通常所說的小麥貯藏蛋白是指醇溶蛋白和麥谷蛋白，其中麥谷蛋白約占貯藏蛋白的40％左右。根據還原條件下在SDS-PAGE中的遷移率不同，又可將麥谷蛋白分為兩類高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)。HMW-GS的組成和含量直接影響小麥面粉的烘烤質量，而LMW-GS則與面團彈性密切相關。
大量研究表明，LMW-GS位點的等位變異與小麥的品質差異具有高度相關性。1984年Payne等首先發現LMW-GS組成與四倍體小麥品質有直接關系，例如具有LMW-1型電泳圖譜的品種往往擁有較差的加工品質，而具有LMW-2型電泳圖譜的品種則恰恰相反，往往具有優良的品質特性。1997年Nieto-Taladriz等發現構成LMW-1、LMW-2型的亞基由Glu-3、Glu-2位點上的等位基因控制。Luo等(2001)在比較普通小麥HMW-GS和LMW-GS等位變異對面粉品質影響時發現，Glu-3位點的等位變異對小麥品質相關的技術參數具有顯著的影響，如面粉蛋白含量、SDS沉淀值、子粒硬度等。迄今為止，研究單個LMW-GS對小麥品質的影響還比較少。1998年Sissons等用RP-HPLC分離了一些LMW-GS進行品質研究，發現N-端為METSHIPGL-的LMW-GS可以改善面粉的混合特性。1999年Lee等對細菌表達的3個LMW-GS進行了品質的研究，發現來自一粒小麥A基因組的LMW-E2和LMW-E4比來自一粒小麥D基因組的LMW-16/10能夠更有效地提高面粉合面特性，增加面團的延展性。
基于在SDS-PAGE中遷移率的不同，可將LMW-GS分為B、C和D型亞基。B型亞基的相對分子質量為40000-50000Da，C型亞基的相對分子質量為30000-40000Da，D型亞基是很微小的一部分，僅在少數小麥品種中出現。編碼B型亞基的基因位點在第一部分同源群染色體短臂的Glu-3位點。編碼C型亞基的基因位點可能在第一部分同源群染色體短臂的Gli-1位點或在第6部分同源群染色體短臂上的Gli-2位點。D型亞基也許在Gli-1位點。研究表明低分子量谷蛋白亞基基因位點與醇溶蛋白的基因位點緊密相連，如Gli-1位點，含有3種蛋白質基因ω醇溶蛋白基因、γ醇溶蛋白基因和低分子量谷蛋白亞基基因。
B型亞基和C型亞基有相似的結構。中央重復區都全部由脯氨酸和谷氨酞胺的重復序列組成，這些重復序列主要形成β轉角。N端是一個非常短的非重復序列，C端也由非重復序列組成，其二級結構主要為α螺旋，且包含其所有的半胱氨酸殘基。C端的8個半胱氨酸殘基的位置是高度保守的。B型亞基中有1～8號中的6個半胱氨酸殘基(1-5和7號)，另外還有一個6’在C端。對B型低分子量谷蛋白亞基的測序發現一些B型低分子量谷蛋白亞基還含有另外一個半胱氨酸殘基。對編碼B型低分子量谷蛋白亞基的基因序列分析表明，其N端應有一個半胱氨酸殘基，但是在大多數小麥品種的B型低分子量谷蛋白亞基中卻沒有發現，而在中央重復區的N端發現有一個半胱氨酸殘基。
C型低分子量谷蛋白亞基和α或γ醇溶蛋白結構相似。可能是由于醇溶蛋白基因發生了突變，使其可以形成分子間二硫鍵，所以屬于谷蛋白類。醇溶蛋白是單體蛋白，不能形成聚集體。Cα型和Cγ型分別含有6個和8個保守的半胱氨酸殘基，然而Cα型亞基的基因序列顯示在N端應有一個半胱氨酸殘基。在Cγ型中央重復區的N端有一個半胱氨酸殘基。另外，在Cγ型亞基中央重復區，一些小麥品種中另外出現了一個半胱氨酸殘基。
D型低分子量麥谷蛋白亞基和C型亞基一樣與醇溶蛋白有相似的生化特性，甚至氨基酸序列也是如此。D型亞基和ω型醇溶蛋白一樣屬于貧硫蛋白，由很小的N端、C端和中央重復區組成。中央重復區富含谷氨酰胺，脯氨酸和苯丙氨酸，由交搭β轉角組成。一般認為D型低分子量谷蛋白亞基可能是由ω型醇溶蛋白編碼基因突變而造成一個半胱氨酸殘基能夠形成分子間二硫鍵，形成聚合體而導致的。
與HMW-GS相比，低分子量麥谷蛋白亞基的組成更為復雜，一個品種一般具有20-50個基因。因此，長期以來由于缺乏有效的分離方法，與HMW-GS相比，國內外對LMW-GS的研究相對滯后，由于常規分離方法SDS-PAGE分辨度不高，操作復雜，所得到的分子量往往與實際的分子量相差較大，因此急需建立新的、更加有效的分離鑒定技術。

發明內容
本發明的目的在于確立一種穩定、快速的質譜方法，從而可以對小麥低分子量谷蛋白亞基進行精確的分子量測定。通過這一蛋白質組學技術，可快速準確的鑒定出小麥低分子量谷蛋白亞基的分子量，分析小麥谷蛋白的低分子量亞基組成，從而鑒定并表征不同品種的小麥。
本發明采用的技術方案是一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法，包括如下步驟1.在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜樣品時，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，再用75-85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亞基；2.在獲得低分子量谷蛋白亞基沉淀后，用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，溶解液的配比為以溶解液體積為計量基準，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的15-25％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜樣品時，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，目的在于先去除蛋白提取液中的高分子量谷蛋白亞基。
目前小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的測定主要采用SDS-PAGE凝膠電泳方法。但SDS-PAGE測定蛋白質的分子量是根據蛋白質的遷移率和分子量的對數間的線性關系對其進行分子量的測定，但有一部分蛋白質在SDS體系中的相對遷移率與其分子量不呈線性關系，如電荷異常或構象異常的蛋白質，組蛋白F1本身帶有大量的正電荷，結合的SDS不足以消除原來正電荷的影響，帶有較大輔基的蛋白質(如某些糖蛋白)以及一些結構蛋白(例如膠原蛋白)和一些含二硫鍵較多的蛋白質，電泳的相對遷移率與分子量的對數不呈線性關系。所以傳統的SDS-PAGE對蛋白分子量的測定存在很大誤差。質譜是通過測定樣品離子的質荷比來進行分子量測定的方法，其精確度極高。本發明以質譜技術為核心，建立了一套精確測定小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的方法。
質譜是通過測定樣品離子的質荷比來進行成份和結構分析的方法，其發展得益于兩種軟電離技術的發展(張國安等，2003)電噴霧電離和基質輔助激光解吸電離(MALDI)。電噴霧電離方法是利用高電場使質譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電在N氣流的作用下，液滴爆裂并最終成噴霧狀，分析物離子化以帶電荷方式進入質量分析器。MALDI離子源產生的離子多為單電荷離子，質譜圖中的譜峰與樣品各組分中的質量數有一一對應關系，且MALDI對鹽和表面活性劑有較強耐受力，適合高通量分析。因此MALDI-MS最適合分析多肽以及蛋白質混合物，這種儀器是現今靈敏度最高的質譜儀，能夠對極微量樣品進行分析。
質譜主要用于解決兩個分析問題精確測定生物大分子，如蛋白質、核苷酸、糖類等的分子量，并提供分子結構信息；對存在于生命復雜體系中的微量或痕量小分子生物活性物質進行定性或定量分析(吳世榮等，2004)。蛋白質類生物大分子分子量的測定有著十分重要的意義，如對均一蛋白質一級結構的測定，既要測定蛋白質的分子量，又要測定亞基和寡聚體的分子量，以及水解、酶解片段的分子量。常規的分子量測定主要有滲透壓法、光散射法、超速離心法、凝膠層析及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。這些方法存在樣品消耗量大，精確度低、易受蛋白質的形狀影響等缺點(趙善楷等，1996)。
本發明是利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)，快速表征小麥LMW-GS，并確定其精確分子量的一種新方法，該方法具有以下特征(1)樣品用量少，一般半粒種子(約20mg)即可滿足需要。
(2)提取方法簡單，無有毒試劑，而SDS-PAGE提取液中常常含有有毒試劑，樣品制備時間長。
(3)所用時間短，分離迅速，適合高通量分析。SDS-PAGE分離LMW-GS一般需要1-2個小時(小槽薄層膠)或10多個小時(大槽)，經過染色、脫色，得到最后電泳圖譜往往需要1-2天，而MALDI-TOF-MS分析一個樣品只需要幾分鐘。
(4)分辨率高。在SDS-PAGE圖譜中很難區分的亞基在質譜中很容易區分。
(5)檢測靈敏敏度。一般只需10-100pmol蛋白樣品即可檢測，而SDS-PAGE的上樣量至少需要微升級。
(6)可檢測的相對分子質量范圍廣(上限可達幾十萬)。
(7)分辨率(可達600m/Δm)和精確度高(內標法可達0.01％)。
(8)結果保存分析容易。直接以圖片方式存貯，只需做簡單處理即可用于分析比較。
(9)可獲得精確分子量信息，精度遠遠高于SDS-PAGE方法。
獲得精確的分子量信息對進一步研究蛋白質的結構與功能非常重要，特別是蛋白質翻譯后修飾(Protein translational modifications，PTMs)的研究。因此，質譜技術很有可能成為一種高靈敏度鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的微量技術，具有廣闊的應用前景。


圖1六倍體面包小麥品種“京411”(Triticum aestivum L.)低分子量谷蛋白亞基SDS-PAGE(A)和質譜鑒定(B)，圖1A中，1為全部的麥谷蛋白，2為低分子量麥谷蛋白，3為高分子量麥谷蛋白(含部分低分子量谷蛋白)；圖2四倍體野生二粒小麥(Triticum dicoccoides)YS-5和YS-13低分子量谷蛋白亞基的質譜鑒定；圖3二倍體粗山羊草(Aegilops tauschii)低分子量谷蛋白亞基的質譜鑒定；圖4栽培一粒小麥(Triticum monococcum)TM-1和TM-3低分子量谷蛋白亞基的質譜鑒定。
具體實施例方式
實施例1小麥低分子量谷蛋白亞基的SDS-PAGE鑒定(1)植物材料小麥品種“京411”。
(2)LMW-GS的提取20mg種子砸成粉末狀放入1.5ml離心管，加入70％乙醇150μl，渦旋30-60min，10000g離心10min，去上清。加入異丙醇250μl，65℃水浴30min，10000g離心10min，去上清并用濾紙吸干，重復3次。加入0.1ml 50％異丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.0]+1％DTT)渦旋混勻，65℃水浴30min。再加入0.1ml50％異丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.0]+1.4％的4-乙烯吡啶)渦旋混勻，65℃水浴30min，12000g離心15min。取上清用40％丙酮室溫沉淀3小時，12000g離心15min，收集上清；將上清用80％丙酮在-20℃沉淀過夜，13000g離心15min，收集沉淀，沉淀即為小麥低分子量谷蛋白亞基。
(3)LMW-GS的SDS-PAGE分離與鑒定①SDS-PAGE電泳樣品的制備在沉淀中加入100μl的樣品緩沖液(2％SDS，0.02％溴酚藍，0.08M Tris-HCl，pH8.0，40％甘油)，65℃水浴中振蕩30分鐘，12000g離心10分鐘，作SDS-PAGE上樣用。
②SDS-PAGE電泳利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3電泳槽、5％濃縮膠、12％分離膠，Tris-甘氨酸緩沖液系統，15mA電泳2小時，0.1％考馬斯亮藍R-250染色，10％乙醇和10％乙酸脫色，電泳圖譜如圖1A所示。
實施例2LMW-GS的MALDI-TOF-MS鑒定(1)植物材料六倍體面包小麥(Triticum aestivum L.，AABBDD)品種“京411”。
四倍體野生二粒小麥(Triticum dicoccoides，AABB)YS-5、YS-13二倍體粗山羊草(Aegilops tauschii，DD)TD121、TD128、TD132二倍體栽培一粒小麥(Triticum monococcum L.，AmAm)TM1、TM3(2)質譜分析樣品的制備20mg種子砸成粉末狀放入1.5ml離心管，加入0.5M NaCl溶液100μl，渦旋30-60min，5000g離心10min，去上清。加入ddH2O 200μl，渦旋30min，5000g離心10min，去上清，重復3次。加入0.4ml 50％正丙醇渦旋混勻，室溫放置30min，12000g離心5min，去上清，并用濾紙吸干凈，此步驟重復3次。加入0.2ml 50％正丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.5]+1％DTT)，振蕩混勻，65℃水浴30min。取上清用40％丙酮室溫沉淀3小時，13000g離心15min，收集上清。將上清用80％丙酮在-20℃沉淀過夜，13000g離心15min，收集沉淀，沉淀即為小麥低分子量谷蛋白亞基。然后用真空干燥儀干燥沉淀，加入50μl 20％乙腈溶液(含0.1％TFA)溶解。
(3)MALDI-TOF-MS使用島津AX1MA-CFRTMPlus型基質輔助激光解析電離飛行質譜儀(配有軟件用于系統操作和數據處理)，全自動樣品處理，軟件控制精確定位，具有延遲提取(DE)、源后裂解(PSD)功能。
①靶板的清洗(384型)用棉球沾取甲醇，擦去靶板上的樣品，1％甲酸超聲10-15min，ddH2O沖洗，加丙酮超聲10-15min，加甲醇超聲10-15min，加水超聲10-15min，取出靶板，用甲醇沖洗，通風櫥中干燥。
②基質的選擇與制備基質選用芥子酸SA(3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸，3，5-Dimethexycinnamic acid)，10mg基質溶于1ml50％乙腈+0.05％TFA中，避光保存。
③標樣的制備與選擇LMW-GS分子量的測定Albumin-Aldrase(66431.08、33216.0、39212.88)，0.1％TFA溶解。
④上樣前處理1％TFA平衡ZIPtip，過濾樣品，反復抽吸5-10次，1％TFA過濾，0.4μl Elution Buffer洗脫樣品。
⑤參數的設置分子量的測定采用線性模式，分子量范圍10000-100000Da。
⑥點樣(三明治法)基質0.5μl，樣品0.5μl，基質0.5μl。
⑦質譜測定待樣品干燥后將靶板放入質譜的樣品艙，依以下程序進行靶板位置的校正→標樣的測定、校正(選用Average、Threshold-Apex)→樣品的校正、測定(選擇與標樣一致的儀器參數)→數據保存。
⑧圖像處理利用KratosAnalytical ltd.lanchpad V2.4.0軟件進行圖像處理。根據處理結果，可獲得不同品種LMW-GS組成圖譜和各亞基的精確分子量，如圖1B所示。
實施例3低分子量谷蛋白亞基質譜鑒定方法的應用(1)LMW-GS表征與小麥品種鑒定普通小麥為異源六倍體種(2n＝6x＝42)，有許多豐富的近緣種質資源，包括二倍體粗山羊草(DD)、二倍體栽培一粒(AA)、四倍體野生二粒和栽培二粒小麥(AABB)等，在這些近緣種中，LMW-GS變異非常豐富，蘊藏著大量的優質候選基因，是面包小麥品質改良的重要基因資源。因此有效的鑒定手段是充分利用這些資源的關鍵。同時，LMW-GS圖譜可作為品種鑒定的可靠標記，對育種中的標記輔助選擇和品種權益保護具有重要意義。利用所建立的LMW-GS質譜鑒定方法，對不同倍性的小麥進行低分子量谷蛋白亞基的鑒定，獲得了高分辨度的LMW-GS圖譜(結果如圖1-圖4所示)。根據這些低分子量谷蛋白亞基的質譜圖譜，可以對不同的小麥品種或種質進行表征與鑒定。鑒于質譜技術的高靈敏度和高精確度，對LMW-GS的分離鑒定效果明顯優于傳統的SDS-PAGE方法。
(2)LMW-GS的精確分子量確定MALDI-TOF-MS方法可準確測定小麥低分子量谷蛋白亞基的分子量，為進一步研究其結構與功能奠定基礎。小麥不同近緣種低分子量谷蛋白亞基分子量的測定結果見圖2-4圖。質譜方法檢測的LMW-GS的數量比SDS-PAGE多，測得的分子量精度也要高得多，因此該技術是精確測定小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的有效方法。
(3)LMW-GS翻譯后修飾(PTMs)鑒定小麥的面粉品質與麥谷蛋白亞基的組成密切相關，不同類型的麥谷蛋白亞基對于面筋品質的貢獻不同。然而，也有研究表明，即使同一亞基，在不同的小麥品種中對面粉品質的貢獻也不完全相同。針對這一現象，推測小麥麥谷蛋白亞基可能存在翻譯后修飾現象，不同程度的修飾，如糖基化和磷酸化等有可能導致不同品種中同一亞基對面粉品質的貢獻不同。然而，近年來在對小麥麥谷蛋白亞基的翻譯后修飾的研究中，獲得了不同的研究結果。有人認為小麥麥谷蛋白亞基存在糖基化和磷酸化修飾的現象，且發生修飾的程度較高，而有人則認為麥谷蛋白亞基不存在翻譯后修飾。產生這一結果的原因在很大程度上是由于研究方法的不同造成的。MALDI-TOF-MS精確分子量測定方法的建立將進一步促進低分子量谷蛋白亞基翻譯后修飾的深入研究。
通過比較用質譜方法測出的谷蛋白亞基的分子量大小和用基因序列推導得到的谷蛋白亞基分子量大小的差異，可以初步判斷小麥谷蛋白亞基翻譯后的修飾狀況。當分子量差異超過基因序列推導的0.1％(質譜儀允許誤差)時，可初步推斷谷蛋白亞基可能發生了某種形式的翻譯后修飾。
根據以上設想，我們采用一對等位基因特異PCR引物對栽培一粒小麥(Triticum monococcum L.，AmAm，2n＝2x＝14)TM-1和TM-3的基因組DNA進行擴增，得到2個不同的全基因編碼序列，包括上游啟動子、開放閱讀框和下游序列，無內含子。根據推導出的氨基酸序列，2個基因LMW-M1和LMW-M3均為典型的LMW-i型亞基，分子量分別為38708.7Da和38720.8Da。然后提取TM-1和TM-3的LMW谷蛋白亞基，利用MALDI-TOF-MS分析獲得了上述2個亞基的精確分子量，分別為38789.6Da和39026.9Da(結果見圖4)。經過比較，發現LMW-M1亞基的分子量與基因推導的十分接近(小于0.1％)，而LMW-M3亞基的分子量差異大于允許誤差，由此推測LMW-M1亞基沒有發生翻譯后修飾，而LMW-M3亞基則存在某種形式的翻譯后修飾，如糖基化和磷酸化修飾等。在此基礎上可進一步進行LMW-GS翻譯后修飾類型、修飾位點及其功能研究。
權利要求
1.一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法，包括如下步驟(1)在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜樣品時，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，再用75-85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亞基；(2)在獲得低分子量谷蛋白亞基沉淀后，用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，溶解液的配比為以溶解液體積為計量基準，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的15-25％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
2.如權利要起1所述的鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法，其特征在于在制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜樣品時，先用40％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，然后用80％的丙酮沉淀清液中的低分子量谷蛋白亞基。
3.如權利要起1所述的鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法，其特征在于用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，溶解液的優選配比為以溶解液體積為計量基準，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的20％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法，屬于生命科學蛋白質組技術領域，特別涉及小麥低分子量谷蛋白亞基分子量的精確鑒定以及基于此技術方法對麥谷蛋白亞基的進一步表征。本發明一種鑒定小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜方法，包括如下步驟(1)制備小麥低分子量谷蛋白亞基的質譜樣品時，先用35－45％的丙酮沉淀蛋白提取液，離心后取上清，再用75－85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亞基；(2)在獲得低分子量谷蛋白亞基沉淀后，用溶解液溶解小麥低分子量谷蛋白亞基，以溶解液體積為計量基準，溶解液中乙腈溶液的體積為溶解液體積的15－25％，TFA所占的體積為溶解液體積的0.1％，其余為水。
文檔編號G01N23/00GK1800812SQ20051013531
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月28日 優先權日2005年12月28日
發明者晏月明, 張倩, 李巧云, 安學麗, 張艷貞, 王愛麗 申請人:首都師范大學