專利名稱：一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法
技術領域：
本發明涉及一種制藥廢水的毒性檢測與評價方法，更具體的說是一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法。
背景技術：
評價毒物毒性的方法有很多，國內、國際上都已經有通過檢測受試動物精子形態的方法來評價毒物毒性的方法，北京醫科大學用氯乙烯對小鼠進行吸入染毒，觀察精子形態，計算畸形率，評價其毒性。Quinto I等用美福鐵和亞胺硫磷等毒物對小鼠通過腹腔注射的方法染毒，然后觀察精子形態、計算畸形率。沒有通過測試小鼠精子形態以及生精細胞百分率檢測合成制藥廢水毒性的相關文獻，對于應用小鼠精子形態以及生精細胞百分率來評價合成制藥廢水毒性的方法目前仍是空白。一些制藥廠的生產廢水，含有眾多的有機物，尤其是合成生產神經調節類藥物的制藥廠，廢水中含有機氯及其它苯環與雜環化等有機污染物，其中持久性有機污染物POPs(persistent organic pollutants)及環境激素EH(environmental hormone)類污染物多達十幾種以上，而目前對于這種廢水的生物毒性及其對人類健康和生態安全所產生的危害還不清楚。由于常規的檢測方法與排放標準不足以準確檢測與評估POPs和EH的生物分子毒性，所以評估POPs和EH的環境健康危險性與生態安全風險性，至今還是一項國際性的重大難題。
發明內容
1、要解決的技術問題本發明的目的是提供一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，特別是對其中含有持久性有機污染物POPs和環境激素EH類污染物制藥廠廢水，可以簡便、準確的檢測生殖毒性進而評價其生物毒性。
2、技術方案采用的技術方案如下
一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，包括以下步驟(1)以制藥廠生產廢水為測試廢水，以小鼠為受試生物，通過經口灌胃對小鼠進行染毒；(2)測試期(1～3個月)滿后觀察小鼠精子形態、計算精子畸形率；(3)測定各類生精細胞百分率，將染毒組數據與對照組進行差異顯著性檢驗；(4)用檢驗結果來評價制藥廢水對小鼠精子毒性。
步驟(1)中所述的制藥廠廢水中含有持久性有機污染物POPs和環境激素EH類污染物。步驟(3)中的各類生精細胞百分率是指單倍體、二倍體和四倍體細胞分別占總生精細胞的百分率。步驟(2)中按照小鼠精子畸變形圖計數各組小鼠畸形精子數和精子總數，計算精子畸形率。
流式細胞儀DNA定量分析具體方法流式細胞儀檢測后，用配套軟件分析后可以得到單倍體、二倍體和四倍體細胞分別占總生精細胞的百分率，以x±s表示，應用excel統計軟件進行t檢驗。判斷樣品組和對照組小鼠各種生精細胞所占比例的差異顯著性。單倍體細胞由精子細胞和精子組成，二倍體細胞由精原細胞、次級精母細胞組成，四倍體細胞由初級精母細胞和處于G2M期精原細胞組成。單倍體細胞百分數可以用于評估睪丸生精功能，因次級精母細胞存在的時間短，二倍體細胞百分數可以指示精原細胞的數量。若染毒組小鼠的單倍體或二倍體生精細胞百分率與對照組存在顯著性差異，則說明該制藥廢水對小鼠的生精功能產生損傷，具有一定的生殖毒性。
精子畸形率檢測具體方法在顯微鏡下觀察染毒組與對照組小鼠精子形態，按照小鼠精子畸變形圖(來自張希橋、楊志華.關于精子畸變分型的參考意見.衛生毒理學雜志，1995，9(1)46)計數各組小鼠畸形精子數和精子總數，計算精子畸形率。用excel軟件進行差異顯著性的x2檢驗。判斷染毒組和對照組小鼠精子畸形率的差異顯著性。若具有差異顯著性，則說明該制藥廢水可對小鼠精子產生損傷，使其精子畸形率上升，具有一定的生殖毒性。
3、有益效果本發明提供了一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，可以簡便、準確的檢測生殖毒性進而評價其生殖毒性。本發明可以準確的檢測與評估合成制藥廢水中POPs和EH對小鼠精子的毒性，研究合成制藥廢水安全濃度與劑量，為制定相應的廢水排放標準提供可靠的基礎數據。本發明不僅適用于合成制藥廢水的生物分子毒性檢測，也適用于其它有毒有機廢水毒性的檢測與評估。
四、說明書附1為染毒組小鼠精子形態圖2為對照組小鼠精子形態五具體實施方式
以下通過實施例進一步說明本發明1、材料與方法1.1、受試動物與染毒處理昆明種(Mus musculus，KM)雄性小鼠，體重18～22g，由南京青龍山動物飼養中心提供。隨機分為對照組和染毒樣品組各12只。染毒組經灌胃0.2mL/d合成制藥廢水(徐州恩華制藥廠，簡稱XZEH)染毒處理35d，對照組灌胃0.2mL/d生理鹽水35d。
1.2、測試廢水的水質參數表1 XZEH合成制藥廢水的水質分析結果/mg·L-1
1.3、流式細胞儀DNA定量分析取出受試小鼠睪丸，置于冷PBS液中洗兩次，小心除去被膜和血管，用眼科剪將組織剪碎，轉移至50mL離心管中，漩渦振蕩器振搖1分鐘，使生精細胞震離出組織，再通過100目鋼篩過濾，收集細胞懸液，1200r/min，離心10min后加PBS液調整細胞濃度為106～107個/mL，用70％冷酒精固定過夜。PBS液洗滌兩次，加入含有1％Triton-X-100，RNase-A(20μg/mL)的PI(50μg/mL)溶液1mL，染色30分鐘，PBS液洗滌1次，用美國BD公司的FACScan流式細胞儀檢測。數據均由配套軟件自動分析后獲取，以x±s表示，應用excel統計軟件進行t檢驗。判斷樣品組和對照組小鼠生精細胞指標的差異顯著性。
1.4、精子畸形的細胞毒性檢測取受試小鼠雙測附睪，置于載玻片，加入1～2滴PBS液，剪碎組織，用在光鏡下觀察。然后用移液器吸取50μl液體進行涂片，瑞士染液染色，用NikonTE2000-5熒光顯微鏡觀察拍照。按小鼠精子畸變形圖，計算精子的畸形率，用excel軟件進行差異顯著性的x2檢驗。判斷樣品組和對照組小鼠精子畸形率的差異顯著性。
2、結果2.1、廢水對小鼠生精細胞的毒性分析用流式細胞儀及配套軟件，自動檢測與分析各種生精細胞所占百分率，經統計學計算，XZEH合成制藥廢水對小鼠生精細胞的毒性檢測結果見表2。染毒小鼠生精細胞中的二倍體細胞數量低于對照組20.45％，差異極顯著(P＜0.01)。二倍體生精細胞是有效的生殖細胞，包括精原細胞和次級精母細胞2種。因為次級精母細胞存在的時間短，所以二倍體的生精細胞數量，實際是指正常的精原細胞數量。結果表明，XZEH(徐州恩華)制藥廢水具有降低小鼠正常精原細胞(二倍體生精細胞)數量的遺傳毒性。
表2 XZEH合成制藥廢水對小鼠生精細胞的毒性檢測結果
2.2、廢水致小鼠精子畸形的細胞毒性分析廢水對小鼠精子形態的毒性檢測結果見表2、
圖1和圖2。從表2可以看出，染毒樣品組小鼠畸形精子率為23.53％，高于對照組的15.12％，差異極為顯著。表明XZEH合成制藥廢水提高了小鼠精子的畸形發生率，影響到小鼠后代的繁殖和胚胎發育的質量。
染毒樣品組小鼠精子與對照組小鼠精子的細胞形態比較見圖1、圖2。從圖1可以明顯的看出，染毒小鼠的精子細胞尺寸小、尾部彎曲多、頭部比例小。圖2對照組小鼠的精子細胞尺寸大、尾部順直多、頭部清晰正常。表明XZEH合成制藥廢水存在生殖毒性，影響到精子細胞的生成質量。
2.3毒性評價下表中給出了該制藥廢水中存在的6種主要污染物的一些參數，以及現有的標準中給出的安全劑量
表3 XZEH廢水中6種有機污染物COD/MW的計算及安全劑量的報道值Table 3 COD/MW calculation of six kinds of organic pollutants in XZEH wastewater and safe dose reported
注表3中安全濃度與安全劑量的換算公式安全濃度＝安全劑量(mg/Kg/d)·小鼠體重(0.02Kg)÷灌胃量(0.2mL/d).
通過表3的換算，我們得到了一個關鍵的換算因子2.53，通過它可以將COD濃度換算為物質的量濃度。本例中，該廢水的COD濃度為13220mg/L，用換算因子換算后得到其物質的量濃度為5225mg/L(13220÷2.53).。再將其換算為對小鼠的染毒劑量染毒劑量(mg/Kg/d)＝廢水物質的量濃度(5225mg/L)·灌胃量(0.2mL/d)÷體重(0.02Kg)＝52.25mg/Kg/d。由此得到本實施例中對小鼠的染毒劑量為52.25mg/Kg/d。
下面采用應用系數(AF)來計算該制藥廢水的安全劑量，安全劑量＝染毒劑量·應用系數AF，此處應用系數采用0.001(經驗值)，由此得出該制藥廢水的安全劑量為0.05mg/Kg/d，而文獻中檢索到的安全劑量為2.416mg/Kg/d，因此現有的標準不足以控制該制藥廢水的生殖毒性。
權利要求
1.一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，其特征在于包括以下步驟(1)以制藥廠生產廢水為測試廢水，以小鼠為受試生物，通過經口灌胃對小鼠進行染毒；(2)測試期滿后觀察小鼠精子形態、計算精子畸形率；(3)測定各類生精細胞百分率，將染毒組數據與對照組進行差異顯著性檢驗；(4)用檢驗結果來評價制藥廢水對小鼠精子毒性。
2.根據權利要求1所述的一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，其特征在于步驟(1)中所述的制藥廠廢水中含有持久性有機污染物POPs和環境激素EH類污染物。
3.根據權利要求2中所述的一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，其特征在于步驟(3)中的各類生精細胞百分率是指單倍體、二倍體和四倍體細胞分別占總生精細胞的百分率。
4.根據權利要求3中所述的一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，其特征在于步驟(2)中按照小鼠精子畸變形圖計數各組小鼠畸形精子數和精子總數，計算精子畸形率。
5.根據權利要求1～4中所述的一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，其特征在于步驟(2)中采用流式細胞儀進行檢測。
全文摘要
本發明公開了一種制藥廢水的生殖毒性檢測與評價方法，主要進程如下以制藥廠生產廢水為測試廢水，以小鼠為受試生物，通過經口灌胃對小鼠進行染毒；測試期滿后觀察小鼠精子形態、計算精子畸形率；測定各類生精細胞百分率，將染毒組數據與對照組進行差異顯著性檢驗；用檢驗結果來評價制藥廢水對小鼠精子毒性。本發明可以簡便、準確的檢測生殖毒性進而評價其生物毒性。可以準確的檢測與評估合成制藥廢水中POPs和EH對小鼠精子的毒性，研究合成制藥廢水安全濃度與劑量，為制定相應的廢水排放標準提供可靠的基礎數據。本發明不僅適用于合成制藥廢水的生物分子毒性檢測，也適用于其它有毒有機廢水毒性的檢測與評估。
文檔編號G01N15/00GK1793915SQ20051012277
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月2日 優先權日2005年12月2日
發明者程樹培, 趙大勇, 潘文揚, 崔益斌, 朱程軍, 孫石磊, 張徐祥, 蔣麗娟, 肖 琳, 于紅霞, 于洪峰, 魏國哲, 孫成, 孔志明 申請人:南京大學