專利名稱：一種手性免疫傳感器及其制備方法
技術領域：
本發明涉及電化學和生物技術領域，具體的說，本發明提供了一種手性免疫傳感器及其制備方法。
背景技術：
分子手性在自然界生命活動中起著極為重要的作用。人類的生命本身就依賴于手性識別。許多手性藥物與生命體中的藥物靶點發生作用時具有顯著的立體選擇性，藥物對映體在生物體內的吸收、分布和代謝等存在顯著差異，從而使它們之間可以產生不同甚至完全相反的藥理和毒理作用。因此，不斷開拓用于手性識別研究的新技術和新手段，發展精細準確的手性分離分析方法引起了人們廣泛的重視。
現在通常用以識別和分離手性對映體分子的方法主要有酶法、超臨界流體色譜(SFC)法、化學法、高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜(GC)法、毛細管電泳(cap illaryelectrophoreisis，CE)法和分子烙印法拆分等等。在這些方法中，不同類型的手性選擇分子是方法靈敏與否的關鍵所在。常見的手性選擇物質有金屬絡合物，環糊精及其衍生物，Chirasil-Val衍生物等等。但是這些手性選擇物質通常對兩種對映體均表現出相當大的交叉反應性，普遍存在選擇性不夠高，區分能力不夠強的缺點。基于上述研究現狀，一種新型的基于手性抗體的對映體分離分析方法逐漸開始嶄露頭角。我們都知道，具有特定功能的抗體分子理論上可以由任何人們感興趣的分子經過生物反應獲取，因此，美國Hofstetter教授的研究小組開始進行手性抗體的相關研究工作。他們利用生物方法獲得的手性抗體通過與手性氨基酸側鏈的馳豫效應，可以對D型和L型兩種小分子手性氨基酸進行精確的識別。手性氨基酸在醫藥，食品以及化工產業中具有舉足輕重的地位，它與人類的生命活動密切相連，尤其與某些特殊疾病的治療藥物研究息息相關。由于這種手性抗體對氨基酸高度的對映選擇性和靈敏快速的區分能力，他們開始嘗試建立一種手性免疫傳感器，不僅用來區分兩種手性氨基酸，還能夠進行痕量的單一對映體純度的研究。檢測方法中他們選擇了SPR，光學懸臂梁，酶聯免疫，磁珠磁性檢測等等，靈敏度很高選擇性非常強，但都存在費事、費時、運作條件要求高、收率不穩定的問題。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種手性免疫傳感器。
本發明的另一個目的是提供上述手性免疫傳感器的制備方法。
本發明提供了一種手性免疫傳感器，該傳感器由電極或者芯片及其表面的巰基乙酸基團和手性抗體組成，手性抗體通過巰基乙酸基團固定在電極表面或者芯片檢測分離通道內壁表面。
所謂“手性抗體”是指對分子的手性具有特異識別能力的抗體，通常一種抗體只能識別并結合一種或者一類單一手性的分子。
本發明的傳感器中，電極是金盤電極、金膜電極、鉑盤電極或玻碳電極等。
本發明的傳感器中，芯片是硅基集成多通道芯片，均勻噴涂金材料制成微陣列電極體系。
本發明的傳感器中，偶聯有抗體的傳感器表面由長鏈烷基巰醇進行封閉。具體的封閉劑為十六巰醇、十八巰醇或二十巰醇等。
另一方面，本發明提供了上述手性免疫傳感器的制備方法。該制備方法包括以下步驟(1)清潔電極或者芯片，將其置于巰基乙酸中并除去表面物理吸附，再用羧基活化劑活化；(2)將(1)得到的電極或者芯片置于0.01mg/mL--0.2mg/mL的手性抗體溶液中，0-5℃過夜；(3)將(2)得到的電極或者芯片清洗、去活化并封閉；(4)將(3)得到的電極或者芯片與電化學裝置連接，制成傳感器。
上述制備方法中，電極或者芯片的清潔、預處理去除表面物理吸附和活化都是常規技術。巰基乙酸可以將其溶于有機溶劑，例如采用0.01-0.1mg/mL的乙醇溶液。活化劑為常規的羧基活化劑。較好的，(1)中活化劑是乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-烴基磺基琥珀酰亞胺(NHS)的混合物，混合比例為0.05-0.2M EDC/0.0125-0.05M NHS的體積比為4∶1。
上述制備方法中，(1)中活化劑亦可以是乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。
上述制備方法中，“手性抗體”是指對分子的旋光性具有特異識別能力的抗體，通常一種抗體只能識別并結合一種或者一類單一旋光性的分子，這種單一旋光性的分子既可以是氨基酸小分子，也可是氨基酸衍生的蛋白類大分子或磁性粒子等，還可以是一般的具有旋光性的有機分子，如有機胺，有機醇等。本發明的手性抗體通過單一手性分子進行硝化、氫化、重氮化、免疫動物、抽血并純化得到。進行反應具體的原子部位為該單一手性分子中手性基團鄰近的活潑氫逐步被硝基、氨基所取代。整個硝化、氫化、重氮化過程必須保證手性基團的旋光性不受任何影響，重氮化蛋白為經典有機反應，原則上所有具有酪氨酸和組氨酸殘基的蛋白均可以進行重氮化，但BSA和KLH蛋白的重氮反應效果為最佳。
上述制備方法中，(2)中電極或者芯片置于手性抗體溶液中8-20小時。
上述制備方法中，電極或者芯片清洗、去活化及封閉都是常規技術。較好的，(3)中電極或者芯片置于乙醇胺或其他短鏈醇胺類去活化。
上述制備方法中，(3)中電極或者芯片置于十六巰醇十八巰醇或者二十巰醇等長鏈巰醇進行封閉。
一旦獲得了封閉完成的電極或者芯片傳感器，就可以按常規方法與電化學裝置連接，制成傳感器。將制好的傳感器放入待檢測的氨基酸溶液中進行手性抗體與手性氨基酸的識別反應。
對本發明構建的手性免疫傳感器進行檢測。用單通道及多通道電容法和競爭實驗檢測的數據顯示，本發明的傳感器對于小分子的手性氨基酸具有一定的識別和分析能力，具有靈敏度較高，操作簡便，重現性好，成本低廉等一系列優點，有望成為一種新型的手性分離分析研究手段，可應用于新藥研究和分析化學領域。
圖1為抗體產生過程示意圖。其中，Pd-C為鈀-炭。
圖2為電極修飾過程示意圖。其中，EDC為乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，NHS為N-烴基磺基琥珀酰亞胺。偶聯有巰基乙酸基團的金電極經活化劑(如EDC/NHS)活化后，置于手性抗體(H2N-Ab)溶液中，然后用乙醇胺去活化，再用巰醇(如十六巰醇)封閉，即完成對電極的修飾過程。
圖3為不同處理方法下的電極循環伏安實驗測定曲線。A表示裸金電極循環伏安曲線；B表示電極表面修飾手性抗體后循環伏安測定曲線；C表示經16-巰醇封閉后電極表面絕緣后循環伏安曲線。
圖4為電位階躍實驗圖及擬合曲線。
圖5-圖10為六通道電位階越測定曲線。可見，本發明構建的以電極為基礎的手性免疫傳感器具有良好的立體選擇性和手性識別能力。
圖11為三種不同濃度電容隨時間測定曲線圖。
圖12為競爭實驗抗體濃度為1ng/mL時的電容隨氨基酸濃度變化曲線圖。
圖13-圖20為八通道陣列芯片電容測試結果圖。
圖21為八通道陣列芯片電容測試數據處理圖。
具體實施例方式
實施例1以電極為基礎的手性免疫傳感器的電極修飾過程一手性抗體的產生與提純過程1.免疫原的合成(重氮化蛋白)首先將1mmol的D型苯丙氨酸或L型苯丙氨酸溶解于體積比3∶1的硫酸鹽酸混合溶液中。十分鐘后，向溶液中逐滴加入氫氧化鈉，調節溶液批pH值為8。此時溶液中得到的產物是對硝基苯丙氨酸，將已硝化完畢的產物凍干再結晶后分離出來。接著利用鈀-炭(10％)作為催化劑進行氫化，使得這些硝化后的分子中的硝基全部還原成氨基。通過在甲醇中重結晶產生了純度較高的對氨基苯丙氨酸。氫化后的產物進行NMR，MS，IR等常規分析測定。接著將1mmol的D型或L型對氨基苯丙氨酸溶解于16.3mL的鹽酸溶液中(0.1N)。待溶液冷卻后進行持續的震蕩攪拌，同時仔細慢速地加入等量的亞硝酸鈉進行重氮化反應。10分鐘后向溶液中逐滴加入預先配好的10mg/mL的蛋白質溶液(以KLH鑰孔血藍蛋白為例也可用BSA)。此蛋白溶液為pH值8.5的硼砂緩沖溶液。注意重氮化試劑的用量為所用蛋白質所有酪氨酸和組氨酸殘基總量的兩倍。為了保持整體反應液的pH值仍為8.5可向溶液中加入0.1N的NaOH溶液。整個重氮化蛋白過程應持續過夜并保持4℃低溫。以上過程后將此重氮化蛋白質在pH為7.4的PBS溶液中進行透析。按照這種方法獲得的半抗原密度可以通過經典的光學檢測方法，利用該重氮化蛋白質在460nm和500nm兩處的消光系數進行估算。可以發現，對于D型的重氮化蛋白質平均每個功能單元(分子量為51000)里有8個重氮化殘基，對于L型的重氮化蛋白質則有11個重氮化殘基。
2.抗血清實驗方法將D型和L型的重氮化蛋白質(100μg)與弗氏完全佐劑混合，然后皮下注射至12周大的新西蘭雄白兔的后背中，第一次注射結束后的2周，4周，8周仍將繼續注射，每次均為100μg重氮化蛋白質與不完全弗氏佐劑的混合樣，由此可得到血清樣品。利用非競爭ELISA方法檢測血清當中具有特殊立體選擇性的抗體量。利用45％的硫酸氨進行沉淀實驗，此時手性抗體即可通過沉淀反應被富集。在PBS溶液中進行透析后，利用紫外吸收光譜(280nm)可以檢測抗體濃度。抗體要置于-20℃保存。
二電極預處理及修飾過程1.電極預處理過程金電極分別用0.3及0.05μmAl2O3拋光粉研磨，依次用蒸餾水、3∶1(V/V)硫酸/雙氧水溶液及無水乙醇超聲清洗5min，用高純氮氣吹干。
2.電極修飾過程經過表面清潔處理的金電極浸泡在0.2mg/mL巰基乙酸的乙醇溶液中24小時，用無水乙醇除去其表面物理吸附，并用氮氣吹干；然后置于0.2MEDC/0.05M NHS溶液中30min進行活化；處理后的電極取出后用蒸餾水清洗，浸入0.05mg/mL D型手性抗體溶液中12小時；固定有抗體的電極用蒸餾水清洗后，浸入1M乙醇胺中去活化30min。最后用16-巰醇溶液封閉金電極。所有操作均在4℃下進行。
電極處理情況的檢測結果見附圖3。A表示裸金電極循環伏安曲線；B表示電極表面修飾手性抗體后循環伏安測定曲線；C表示經16-巰醇封閉后電極表面絕緣后循環伏安曲線。
實施例2基于電極利用電容法對D型和L型手性氨基酸進行測定1.單通道及多通道電容法檢測首先測定電極表面修飾抗體后的電容值，再將測定好的手性免疫傳感器放入含有不同濃度抗原(手性氨基酸)的PBS溶液中37℃培育30min，跟蹤整個培育過程，分別于5min，10min，15min，20min，25min，30min采點測定，研究整個免疫反應的動力學過程。進行單通道測定后獲得的電位階躍電流時間響應實驗圖及擬合曲線見圖4。
為了進行高通量，快速靈敏的電容測定，我們采用了多通道電位階躍方法。
在所選定的六個通道中，其中兩個與D型氨基酸孵育結合，另外兩個與L型氨基酸結合，最后兩個作為空白實驗。跟蹤整個手性傳感器的免疫反應過程，我們獲得了如下數據表格表1抗體濃度和氨基酸濃度均為0.05mg/mL時測定的電容隨時間變化圖
由附圖11可見，當溶液中的氨基酸濃度為1mg/mL時與D型氨基酸結合的電極表面電容變化為與L型氨基酸結合的8倍左右；而當溶液中的氨基酸濃度為0.05mg/mL時與D型氨基酸結合的電極表面電容變化為與L型氨基酸結合的4倍左右；當溶液中的氨基酸濃度為0.01mg/mL時與D型氨基酸結合的電極表面電容變化為與L型氨基酸結合的2倍左右。說明我們構建的電容性手性免疫傳感器具有良好的手性識別能力和立體選擇能力，應用到多通道芯片當中進行手性分子分離分析具有很好的前景。
實施例3利用競爭實驗進一步驗證手性識別實驗結果經過表面清潔處理的金電極浸泡在0.2mg/mL巰基乙酸的乙醇溶液中24小時，用無水乙醇除去其表面物理吸附，并用氮氣吹干；然后置于0.2MEDC/0.05M NHS溶液中30min進行活化；處理后的電極取出后用蒸餾水清洗，浸入5mmol酪胺溶液中12小時，通過重氮化反應在電極表面修飾上D型苯丙氨酸。隨后將修飾好的電極放入預先處理好的溶液中。溶液的處理過程配制兩種不同類型的溶液，一種溶液中加入D型苯丙氨酸與D型手性抗體，另一種加入L型苯丙氨酸與D型手性抗體，配制好之后靜置1小時，讓手性抗體與氨基酸充分作用。放入電極之后表面修飾的手性氨基酸開始與溶液中的氨基酸競爭抗體。隨著兩種氨基酸的不斷加入，電極表面電容呈現規律變化。
競爭實驗結果當溶液中抗體濃度為1ng/mL時，從附圖12可以看到修飾了D型氨基酸的電極表面電容隨著D型氨基酸加入濃度的增大而增大，而加入L型氨基酸時電極電容仍有一些變化，但幅度沒有D型大，說明這種方法構建的手性電化學傳感器確實具有一定的立體選擇效果。
實施例4以芯片為基質的手性免疫傳感器的芯片修飾過程1.八通道電極陣列芯片的制作過程及預處理過程芯片制作是利用n型(100)面的硅片作為起始基底材料。先將硅片表面清潔后，利用光印刷技術和脫模技術，在氧氣的氣氛中沉積上一層100nm的SiO2薄層，再利用濺射方法，依次沉積上20nm的鈦(作為粘合層)和200nm的金，制成圓盤電極。然后，利用光印刷技術和活性離子刻蝕技術，通過等離子增強化學氣相沉積方法在電極的導線上沉積300nm的SiO2薄層。這樣，電極的導線就被保護起來，同時可以使圓盤電極顯露出來。整塊硅片放在500℃的氧氣氣氛中反應30分鐘，最后，利用壓片技術將芯片壓制到一個設計好的管芯中，引出導線，即制成一片符合要求的芯片。圓盤電極直徑1mm。
芯片的預處理過程與電極不同，因為已經集成為一個整體，八個工作電極集成前已經拋光完畢，使用前只需用乙醇和重蒸水逐一清洗30秒即可。利用二茂鐵甲醇作為探針考察金表面狀態，具體結果見附圖13-20。
2.八通道電極陣列芯片的修飾過程經過表面清潔處理的芯片工作電極浸泡在0.2mg/mL巰基乙酸的乙醇溶液中24小時，用無水乙醇除去其表面物理吸附，并用氮氣吹干；然后置于0.2MEDC/0.05M NHS溶液中30min進行活化；處理后的芯片用蒸餾水清洗，加入按實施例1所示方法制備的0.05mg/mL D型手性抗體溶液，浸泡工作電極12小時；固定有抗體的電極用蒸餾水清洗后，加入1M乙醇胺中去活化30min。最后用16-巰醇溶液封閉八個工作電極。所有操作均在4℃下進行。
實施例5多通道電容法檢測以芯片為基質的手性免疫傳感器首先測定工作電極表面修飾抗體后的電容值，再將測定好的手性免疫傳感器加入含有不同濃度抗原(手性氨基酸)的PBS溶液中37℃培育30min，跟蹤整個培育過程，分別于5min，10min，15min，20min，25min，30min采點測定，研究整個免疫反應的動力學過程。在所選定的六個集成陣列芯片中，其中兩個與D型氨基酸孵育結合，另外兩個與L型氨基酸結合，最后兩個作為空白對照。附圖13-20為八通道陣列芯片電容測試數據處理圖。
表2抗體濃度和氨基酸濃度均為0.05mg/mL時測定的電容隨時間變化圖(每一個數據均為八通道平均后所得)
芯片電容實驗結果與電極方法所獲類似，當溶液中的氨基酸濃度為0.05mg/mL時與D型氨基酸結合的通道表面電容變化為與L型氨基酸結合的3倍左右，說明本發明構建的手性免疫芯片具有良好的立體選擇性和手性識別能力，該芯片可以對不同構型的手性氨基酸進行高通量，快速靈敏的準確檢測，八通道集成體系不僅可以對多對手性氨基酸進行檢測，還可以進行生物大分子等一系列手性功能單體的識別與檢測，有望成為一種基于電化學方法的新型手性分離分析辦法。
權利要求
1.一種手性免疫傳感器，其特征在于，該傳感器由電極或者芯片及其表面的巰基乙酸基團和手性抗體組成，手性抗體通過巰基乙酸基團固定在電極表面或者芯片檢測通道內壁表面。
2.如權利要求1所述的傳感器，其特征在于，該傳感器中電極是金盤電極、金膜電極、鉑盤電極或者玻碳電極。
3.如權利要求1所述的傳感器，其特征在于，該傳感器中芯片是硅基集成芯片。
4.如權利要求1所述的傳感器，其特征在于，固定有手性抗體的電極表面或者芯片檢測通道內壁表面由十六巰醇、十八巰醇或者二十巰醇進行封閉。
5.如權利要求1所述的傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)清潔電極或者芯片，將其置于巰基乙酸中并除去表面物理吸附，再用羧基活化劑活化；(2)將(1)得到的電極或者芯片置于0.01mg/mL--0.2mg/mL的手性抗體溶液中，0-5℃過夜；(3)將(2)得到的電極或者芯片清洗、去活化并封閉；(4)將(3)得到的電極或者芯片與電化學裝置連接，制成傳感器。
6.如權利要求5所述的傳感器的制備方法，其特征在于，(1)中活化劑是乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-烴基磺基琥珀酰亞胺的混合物，混合比例為0.05-0.2M乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與0.0125-0.05M N-烴基磺基琥珀酰亞胺的體積比為4∶1。
7.如權利要求5所述的傳感器的制備方法，其特征在于，(1)中活化劑是乙基-(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。
8.如權利要求5所述的傳感器的制備方法，其特征在于，(2)中電極或者芯片置于手性抗體溶液中8-20小時。
9.如權利要求5所述的傳感器的制備方法，其特征在于，(3)中電極或者芯片置于乙醇胺或其它短鏈醇胺類中去活化。
10.如權利要求5所述的傳感器的制備方法，其特征在于，(3)中電極或者芯片置于十六巰醇、十八巰醇或者二十巰醇中進行封閉。
全文摘要
本發明涉及電化學和生物技術領域，具體的說，本發明提供了一種手性免疫傳感器及其制備方法。手性研究是目前醫藥，食品以及化工產業中的重要研究課題，但是現有的手性分離分析研究手段和設備儀器往往存在靈敏性不高或者費事、費時、運作條件要求高、收率不穩定等問題。本發明提供了一種手性免疫傳感器，將具有特異性識別能力的手性抗體偶聯到電極或芯片的表面，通過一系列電化學方法的應用達到對手性氨基酸的快速，準確，方便，靈敏的識別與檢測。本發明的手性免疫傳感器有望成為一種新型的手性分離分析研究手段，應用于新藥研究和分析化學領域。
文檔編號G01N33/543GK1790000SQ20051011153
公開日2006年6月21日 申請日期2005年12月15日 優先權日2005年12月15日
發明者孔繼烈, 劉穎, 張松 申請人:復旦大學