鋅指蛋白hzf1抗體的制作方法

專利名稱：鋅指蛋白hzf1抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物蛋白的特異性抗體、其制備方法及其應用。更具體地，本發明涉及鋅指蛋白HZF1的特異性多克隆和單克隆抗體、它們的制備方法及其在與HZF1功能相關疾病診斷中的應用。該抗體可應用于與HZF1功能和紅系細胞分化和巨核細胞分化異常相關的腫瘤、貧血和細胞減少癥的診斷以及與HZF1表達和功能和其他細胞和組織分化發育相關疾病的診斷中。
背景技術：
真核生物有機體的發育涉及生長及按照準確時空的細胞和組織分化。分化了的細胞形態和功能特異性是由特定基因的表達決定的。作為維持生命重要生理過程的造血涉及骨髓多能造血干細胞向具有不同形態及功能的血細胞的分化和發育成熟。雖然已提出不同的造血機制模型，但人們相信干細胞向某類細胞鏈系的分化決定和進一步分化發育成熟可能涉及許多基因的表達，由這些基因表達形成的調節網絡最終決定了細胞的特異形態及功能。不正常的造血細胞分化可能導致嚴重的血液系統疾病，如在血液系統腫瘤中的分化阻抑或逆分化以及由于干/祖細胞增殖或分化異常導致的再生障礙性貧血。與造血細胞分化有關的重要基因及調節網絡的確定對揭示細胞分化機制具有重要的理論意義，并可能對某些與造血相關的血液性疾病(如血液系統腫瘤、貧血和細胞較少癥等)的防治產生實際意義。本發明涉及一種生物蛋白特異性抗體、它的制備方法及其應用，更具體地，本發明涉及一種編碼鋅指蛋白(HZF1)的特異性抗體、它的制備方法及其在與HZF1功能相關疾病診斷中的應用。該抗體可應用于包括針對與HZF1功能和造血細胞分化及腫瘤相關疾病的診斷以及與HZF1功能和其他細胞和組織分化發育和腫瘤相關疾病的診斷中。
比本申請稍早提交的另一份專利申請中(發明名稱為“鋅指蛋白HZF1基因的功能及其應用”，申請號為200510109116X)，發明人對鋅指蛋白HZF1的表達和功能做了深入的研究。利用細胞轉染和報告基因技術證明HZF1蛋白定位于細胞核。這與從蛋白結構推斷HZF1可能作為一個轉錄因子在基因轉錄調節中發揮作用相一致。用Northern雜交分析證明HZF1mRNA在廣泛的組織和多種血液細胞系中有不同程度的表達，說明其可能在多種細胞和組織中行使功能。HZF1mRNA在處于紅系和巨核系共同祖細胞階段的紅白血病K562細胞中表達很低，但隨著hemin誘導的紅系分化及PMA誘導的巨核系分化表達上調，暗示HZF1可能在紅系分化和巨核細胞分化中發揮作用。應用反義核酸和RNA干擾技術，發現內源HZF1表達的抑制嚴重阻遏K562細胞向紅系和巨核系兩個方向的分化，證明了HZF1在紅系和巨核系分化和發育中的重要作用。造血細胞分化發育的異常通常與某些疾病密切相關，如血液系統腫瘤(白血病)細胞的分化阻遏或逆向分化，再生障礙性貧血中的干/祖細胞分化阻遏等。影響HZF1功能和表達的因素有可能導致上述疾病，因此HZF1有可能成為控制和治療某些白血病和再生障礙性貧血的靶基因。許多鋅指蛋白，特別是C2H2型鋅指蛋白已被證明影響多種組織和細胞的分化和發育，我們已證明HZF1在造血組織以外的其他組織表達，因此HZF1也可能在其他組織細胞的分化發育中具有重要作用。上述內容在此引入作為參考。
發明詳述本發明涉及一種編碼鋅指蛋白(HZF1)的特異性多克隆抗體和單克隆抗體、它們的制備方法及其在與HZF1功能相關疾病診斷中的應用。因此，本發明提供了一種利用HZF1抗體作為檢測細胞和組織中HZF1表達水平的手段。
進一步地，本發明提供了一種與HZF1功能及紅系分化和巨核細胞分化相關的腫瘤、貧血和紅細胞或(和)巨核細胞減少癥的診斷手段。
本發明還提供了一種與HZF1功能相關的其他疾病的診斷手段。
本發明中的術語“抗體”涉及所有可能類型的抗體，特別涉及多克隆和單克隆抗體，還涉及通過化學、生物化學或基因技術方法產生的抗體。制備這樣的分子的方法對于本領域技術人員是公知的。
然而在抗體制備過程中，抗原的選擇起了關鍵的作用。現有技術中已經鑒別了多個C2H2型鋅指蛋白基因，近來從對基因組順序的分析預測人類基因組包含700多個編碼C2H2型鋅指蛋白的基因(Nature409860-921，2001)。由于這些蛋白的鋅指區氨基酸順序高度保守，從而使得制備針對某一鋅指蛋白的高特異性抗體具有較高難度。我們通過與GenBank中的順序進行BLAST同源性比較，搜尋HZF1中低同源性順序作為抗原。優選地使用非鋅指部分序列作為抗原。把相應于這些氨基酸順序的DNA順序插入pET30a載體，感染大腸桿菌，獲得了穩定的能誘導表達HZF1融合蛋白的克隆，進而制備和純化了融合蛋白，免疫兔，最終獲得針對HZF1蛋白的高效的和高特異性抗體。并進一步利用雜交瘤技術獲得了針對HZF1蛋白的高效的和高特異性單克隆抗體。
附表(SEQUENCE LISTING)說明附表列出了構建的表達HZF1融合蛋白的重組質粒pET30aHZF1中的表達序列及相應氨基酸序列。從第142到720核苷酸為插入pET30a載體的HZF1cDNA中編碼HZF1非鋅指區的順序(相應于融合蛋白中的第48到240氨基酸)。其余為原載體中的表達順序。表達和純化的這一融合蛋白被用作免疫抗原。


圖1表明得到了優化表達HZF1融合蛋白的BL21菌株，HZF1融合蛋白可在大腸桿菌中誘導表達。圖中M代表蛋白marker，泳道1和3為IPTG誘導4h的菌裂解物，泳道2和4為未經IPTG誘導的菌裂解物。
圖2表明使用BL21表達HZF1的菌株可誘導表達HZF1融合蛋白，采用Novagen公司的Ni柱可以很好地純化HZF1蛋白，得到的蛋白純度高。圖中泳道1為通過Ni柱結合HZF1融合蛋白后的流出液，泳道2和3為使用Ni柱純化后的HZF1融合蛋白。
圖3顯示了兔免疫血清的ELISA分析結果，表明由于用HZF1融合蛋白接種，兔產生了對其的強的免疫應答，而在免疫前的血清中沒有發現對HZF1的免疫應答。
圖4顯示用Western blot方法，證明抗HZF1抗體沒有和表達HZF1融合蛋白的菌株中的其它蛋白產生免疫應答，而只和HZF1融合蛋白發生免疫應答。圖中泳道1為沒有誘導的轉化菌(pET30a-HZF1)，泳道2為IPTG誘導4h的轉化菌(pET30a-HZF1)。
圖5顯示用HZF1抗體和Western blot方法，證明在經過hemin誘導或PMA誘導48h的人紅白血病細胞K562(已知其表達高水平的HZF1mRNA)中檢測到高水平HZF1蛋白，而在未誘導的K562細胞中(已知其表達很低水平的HZF1mRNA)未能檢測到HZF1蛋白。說明抗HZF1抗體可以很好地識別和結合細胞和組織中表達的HZF1蛋白。
圖6顯示了單克隆抗體的ELISA分析結果，說明獲得了高滴度的單克隆抗體。
圖7顯示用HZF1單克隆抗體和Western blot方法證明，在經過hemin誘導48h的人紅白血病細胞K562(已知其表達高水平的HZF1mRNA)中檢測到高水平HZF1蛋白，而在未誘導的K562細胞中(已知其表達很低水平的HZF1mRNA)未能檢測到HZF1蛋白。說明獲得的單克隆抗體特異地與HZF1蛋白結合而不與其它蛋白發生結合，能用于組織和細胞中HZF1蛋白的特異檢測。
圖8顯示了K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i穩定轉染子用HZF1抗體的western blot檢測。轉染了空載體pAVu6的穩定轉染子細胞(對照)經hemin或PMA誘導48h后，可檢測到高水平HZF1蛋白，而能夠表達HZF1特異干擾RNA的K562pAVu6HZF1i穩定轉染子細胞經hemin或PMA誘導48h后，未能檢測到HZF1蛋白。結果說明抗HZF1抗體特異地與HZF1蛋白結合而不與其它蛋白發生結合。同時，當內源表達的HZF1蛋白被抑制時，抗HZF1抗體與HZF1蛋白的免疫應答也就消失。
圖9顯示了穩定轉染子細胞用hemin誘導不同時間后聯苯氨染色測定。圖中空心方框代表K562pAVu6-HZF1i穩定轉染子(圖8已證明它們誘導后不表達HZF1)，實心方框代表K562pAVu6穩定轉染子(圖8已證明它們誘導后HZF1表達增加)。結果說明了HZF1蛋白表達參與促進腫瘤細胞系K562脫離分化阻抑狀態，向紅系方向繼續分化。
圖10顯示了K562pAVu6HZF1i和K562pAVu6轉染子細胞PMA誘導的巨核系分化。圖中左側峰代表二倍體細胞，右側峰代表四倍體細胞。結果說明在K562pAVu6HZF1i穩定轉染子細胞內RNA干擾對內源HZF1表達的抑制減弱了K562細胞PMA誘導的巨核系分化。同時說明了HZF1蛋白表達參與促進腫瘤細胞系K562脫離分化阻抑狀態，向巨核系方向繼續分化。
實施例使用的材料微量滴定板用于ELISA的Immuno Plate F96 MaxiSorp(Nunc)二抗HRP標記的羊抗兔抗體(Santa Cruz Biotechnology)ECL檢測試劑盒用于western blot顯色(Amersham)Ni柱Ni-NTA His·BindResins(Novagen)細胞系人紅白血病細胞系K562；BALB/C骨髓瘤細胞系MOPC-21。
實驗動物新西蘭大白兔；純種BALB/C小鼠0.2MPB溶液 由0.2M Na2HPO4和0.2M NaH2PO4溶液根據pH要求混合配制。
純化緩沖液B8M尿素0.1MPB0.01M Tris-ClpH值8.0純化緩沖液C8M尿素0.1MPB0.01M Tris-Cl
pH值6.3純化緩沖液D8M尿素0.1MPB0.01M Tris-ClpH值5.9純化緩沖液E8M尿素0.1MPB0.01M Tris-ClpH值4.5PBS-T NaCl 8.0gNa2HPO4·12H2O 2.9gKH2PO4，0.2gTween-20，0.5ml加ddH2O至100mlpH值7.4包被緩沖液 儲備A液0.2M 21.2gNa2CO3加ddH2O到1000ml儲備B液16.8gNaHCO3加ddH2O到1000ml將80ml(A)+170ml(B)+250mlddH2O混合pH值9.6底物 A液檸檬酸(無水)1.92g加ddH2O到1000mlB液Na2HPO4·12H2O7.16g加ddH2O到1000ml取2.43ml(A液)+2.57ml(B液)+5mlddH2O+30％H2O215μl+鄰苯二胺4mg混合pH值5.0終止溶液 2M硫酸細胞裂解液A 1％Triton X-1000.15M NaCl0.01M磷酸鈉(pH7.2)10％甘油10mM焦磷酸鈉
1mM EDTA1mM dithiothreitol1mM phenylmethylsulfonyl fluoride1μg/ml leupeptin20μg/ml aprotinin2μg/ml pepstatinPI溶液 500μg/ml PI，溶于3.8×10-2M枸櫞酸鈉PH值7.0HAT培養液(在100ml完全培養液中，加入次黃嘌呤1.362mg，氨基喋呤0.0176mg，胸腺嘧呤0.388mg。)實施例1表達HZF1融合蛋白的工程菌的獲得HZF1是一個鋅指蛋白，其鋅指區具有很高的保守性。為了產生抗HZF1特異性抗體，以pCMV-HZF1為模板(本申請專利發明人發現和保存的含HZF1cDNA的質粒)為模板，設計引物PCR擴增HZF1編碼N端非鋅指區序列(從第2氨基酸開始到第198氨基酸)。
PCR反應體系包括上下游引物P1和P2各20pmol(上游引物P1為GCA GAT ATC GAGCTC TCA GTT CCA G，含有EcoRV酶切位點；下游引物P2為TCA CT CGA GT GAG TGGACT TTC AGC，含有XhoI酶切位點)，模板pCMV-HZF1 0.02μg，10×PCR buffer 5μl，10nmol/L dNTP 1μl，pfu polymerase一個單位。PCR反應條件為95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共33個循環。利用PCR產物純化試劑盒純化擴增產物，用EcoRV和XhoI雙酶切。pET30a載體進行同樣的雙酶切。用連接酶于16℃連接目的片段與載體片段，轉化BL21(DE3)感受態細胞，挑取克隆，提取質粒，用PCR方法和DNA序列測定方法進行檢測驗證。附表列出了表達HZF1融合蛋白的重組質粒中的表達序列及相應氨基酸序列。
實施例2陽性克隆的蛋白表達分析為了優化HZF1融合蛋白的表達，挑取正確的陽性克隆單菌落接種于3ml LB培養基中，37℃振蕩培養過夜。取過夜培養物30μl接種于3ml新鮮LB培養基中，37℃振蕩培養至OD600nm為0.6，加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃繼續培養。在IPTG誘導4h后分別取1mL培養物，離心收集菌體，進行10％SDS-PAGE蛋白電泳分析。如圖1所示，在1mmol/L IPTG中誘導4h后，HZF1融合蛋白得到了大量的表達。可以看到兩個克隆用IPTG誘導后比在未誘導的樣品中增加了一個約30kD并且表達量很高的條帶，說明HZF1基因在原核中獲得了高效的表達。
實施例3HZF1融合蛋白的表達和純化為了純化HZF1融合蛋白，大量培養表達融合蛋白的菌株，經IPTG誘導后用Novagen公司的Ni柱純化上清中的HZF1融合蛋白。用200mLLB大量培養表達HZF1蛋白的陽性克隆，用1mmol IPTG誘導4h，收集細菌。細菌沉淀在冰上15min，重懸于純化緩沖液B中每克5ml。攪拌15-60min在室溫或輕柔的顛倒裂解，避免產生氣泡，裂解液半透明時即可。在室溫以10000g離心20～30min，保留上清。加1ml 50％Ni-NTA His·Bind漿到4ml裂解物中，室溫下輕微振蕩混合15～60min。仔細將裂解物-resin注入Ni柱，柱子的底蓋關閉。打開底蓋，收集流出的液體。保存流出液準備SDS-PAGE分析。用4ml純化緩沖液C洗兩遍，用0.5ml純化緩沖液D洗脫目的蛋白4遍，接著再用0.5ml純化緩沖液E洗脫4遍，收集洗脫液。10％SDS-PAGE分析純化結果。如圖2所示，可以看到在用Ni柱處理后的廢液中幾乎看不到HZF1融合蛋白，而從Ni柱上洗脫下來的蛋白全部是純的HZF1蛋白。說明采用Ni柱純化得到了高純度的HZF1融合蛋白。
實施例4兔免疫血清多克隆抗體的制備用提純的HZF1融合蛋白與完全弗式佐劑混合，超聲乳化。采用背部皮下多點注射，免疫新西蘭大白兔，3周后加強免疫，2周重新加強免疫，2周后再強化一次。于第4次加強免疫后一周收集兔血清。
實施例5用ELISA方法檢測免疫血清的效價與前血清(pre-serum)相比較，針對純化的HZF1蛋白，對回收并合并的兔免疫血清進行針對純化的HZF1蛋白的分析，以測定接種過HZF1蛋白后的兔的總的免疫應答。借助于ELISA測試進行該項研究。純化的HZF1融合蛋白用包被緩沖液(pH9.6)稀釋至所需的蛋白濃度(100ng/100μl)，每孔加入100μl，4℃過夜，或37℃4h。將平板凹孔中的液體傾盡，用PBS-T洗滌三次。每孔加1％BSA200μl(用PBS-T配制)37℃1h，用PBS-T洗滌三次。將待檢測血清用生理鹽水1∶100到1∶150000稀釋。100μl/孔4℃過夜用PBS-T洗滌三次。每孔加入100μl用PBS-T配制的以1/1000稀釋的HRP標記的羊抗兔抗體，37℃2h，用PBS-T洗滌三次。每孔加入底物緩沖液100μl，37℃30min。加入50μl 2M H2SO4終止反應。用酶標儀測490nm光密度。抗血清測定值減去相應稀釋倍數的免疫前的血清吸收值大于0.2時為陽性。圖3顯示了該項實驗的結果由于用HZF1蛋白接種，兔產生了對其的強的免疫應答，而在前血清中沒有發現抗HZF1抗體。抗體效價在1∶100000以上。
實施例6用HZF1抗體多克隆抗體分析HZF1融合蛋白工程菌中的蛋白為了檢測抗血清的特異性，首先對表達HZF1融合蛋白的菌株的IPTG誘導前后的裂解物上清進行比較。借助于Western Blot檢測進行該項研究。用5mL LB培養表達HZF1蛋白的陽性克隆，用1mmol IPTG誘導4h，收集細菌。用5mL LB培養表達HZF1融合蛋白的陽性克隆。在沒有IPTG誘導的條件下培養4h，收集細菌，作為對照。用超聲裂解兩種樣品細菌，取得上清進行SDS-PAGE電泳。用電轉移法將蛋白轉移到PVDF膜上，用10mL 5％的脫脂奶粉封閉。一抗為1∶10000兔抗人HZF1免疫血清。二抗為1∶2000HRG標記的羊抗兔IgG。使用ECL Western Blotting檢測試劑盒顯影。圖4顯示了該項實驗的結果在IPTG誘導的細菌總蛋白中檢測到HZF1表達，而在未用IPTG誘導的細菌總蛋白中沒有檢測到HZF1蛋白。結果說明HZF1抗體只和HZF1融合蛋白發生免疫應答，而不與菌珠中表達的其它蛋白產生免疫應答。
實施例7用HZF1抗體檢測細胞中HZF1蛋白的表達為研究是否在內源表達HZF1蛋白的人細胞中，抗HZF1的抗體只和HZF1蛋白發生免疫應答。為了該目的，使用了經過hemin誘導的和PMA誘導48h的人紅白血病細胞系K562(表達高水平的HZF1mRNA)。也試驗了未誘導的人紅白血病細胞系K562(表達很低水平的HZF1mRNA)作為對照。K562細胞培養于1640中，每100ml1640完全培養液中加入10ml胎牛血清，100U青霉素，100μg鏈霉素。培養條件為37℃，5％CO2及飽和濕度。向處于對數生長期的K562中加入40μmol/L hemin或5ng/mlPMA誘導48h。收集細胞，將細胞在200μl冰預冷的細胞裂解液A中重懸，使細胞裂解，進行和實施例6相同方法的westernblot分析。圖5顯示了實驗的結果抗HZF1抗體特異地與HZF1蛋白結合，而不與其它蛋白發生結合，證明了HZF1抗體的高度特異性。
實施例8HZF1單克隆抗體的制備8.1.免疫動物的選擇與抗原選擇純種BALB/C小鼠，用上述純化的融合蛋白免疫動物。
8.2細胞融合使用BALB/C骨髓瘤細胞系MOPC-21，用小鼠腹腔巨噬細胞為飼養細胞。
制備飼養層細胞取純種BALB/C系小鼠，6-10周齡處死浸泡在75％酒精3-5min，用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，用無菌注射器注入5ml預冷的培養液，反復沖洗，吸出沖洗液，沖洗液放入10ml離心管，1200rpm離心5-6min，用含20％NCS或FCS的培養液懸浮，調整細胞數至1×105，加入96孔板，100μl每孔放入37℃CO2培養箱培養。
制備免疫脾細胞最后一次加強免疫3天后處死小鼠，無菌取脾臟，培養液清洗脾臟研碎，過不銹鋼篩網離心，細胞用培養液洗2次取108脾臟細胞備用。
制備骨髓瘤細胞取對數生長骨髓瘤細胞離心，用無血清培養液洗2次，取107細胞備用。
融合步驟骨髓瘤細胞與脾臟細胞按1∶10或1∶5的比例混合，在50ml離心管中用無血清培養液洗1次，離心1200rpm，8min，棄上清；90s內加入37℃預溫的1ml45％PEG溶液，邊加邊搖，37℃水浴90s；加37℃預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml；以800rpm離心，6min。棄上清。細胞用含20％小牛血清HAT選擇培養液重懸；將上述細胞加入已有飼養細胞的96孔培養板內，每孔100ul，放入37℃5％CO2培養箱培養。
細胞在HAT培養液(內含完全培養液100ml，次黃嘌呤1.362mg，氨基喋呤0.0176mg，胸腺嘧錠0.388mg)中培養，以選擇雜交瘤細胞(骨髓瘤細胞缺乏TK或HGPRT而不能生長，而脾細胞能生長但不能長期增殖而死亡，只有雜交瘤細胞具有以上兩種酶故能生長。)8.3抗體的檢測用ELISA實驗檢測抗體的產生。
8.4雜交瘤的克隆化與單克隆的選擇用軟瓊脂平板法將抗體陽性孔進行克隆化，挑選單個克隆，并通過ELISA實驗檢測篩選。選擇到一株抗體滴度高的克隆。
實施例9單克隆抗體的大量生產及鑒定用體外培養法將選擇的雜交瘤細胞在體外大規模培養，從細胞培養液中就能提取大量的單克隆抗體。把雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔內增殖，再從小鼠腹水中提取單克隆抗體，進行和實施例5相同的ELISA實驗測定，確定抗體滴度在50000以上(圖6)。
用獲得的單克隆抗體對細胞蛋白進行和實施例6相同的western blot檢測，證明能夠特異檢測HZF1蛋白(圖7)。
實施例10用HZF1抗體檢測K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i穩定轉染子細胞中HZF1蛋白表達進一步研究在人細胞系中內源HZF1蛋白表答的變化是否可以為抗HZF1的抗體識別。為了該目的，使用了經過hemin或PMA誘導的轉染了pAVu6HZF1i質粒的人紅白血病細胞系K562(HZF1蛋白的內源表達被抑制)。也試驗了用hemin或PMA誘導的轉染了pAVu6質粒的K562作為對照。根據HZF1cDNA 5’端非鋅指區的一段序列設計siRNA(AATGTCGACCTTCACAAGGAAGACATTCACCTCTGAATGTCTTCCTTGTGAAGTTTTTCTAGAATA)，插入到真核表達載體pAVu6中，構建針對HZF1的RNA干擾質粒pAVu6HZF1。大量提取純化pAVu6HZF1i質粒，轉染K562細胞，48h后用500μg/ml G418篩選，得到4個穩定轉染子庫(K562pAVu6HZF1i-1～4)。同時用pAVu6轉染K562細胞，獲取4個穩定轉染子庫(K562pAVu6-1～4)作為對照。
K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i細胞培養于1640中，每100ml1640完全培養液中加入10ml胎牛血清，100U青霉素，100μg鏈霉素。培養條件為37℃，5％CO2及飽和濕度。向處于對數生長期的K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i中加入40μmol/L hemin或5ng/mL PMA誘導48h。收集細胞，將細胞在200μl冰預冷的細胞裂解液A中重懸，使細胞裂解，從穩定轉染子細胞提取蛋白，用BCA法定量。進行和實施例6相同方法的western blot分析。圖8顯示了實驗結果抗HZF1抗體特異地與HZF1蛋白結合而不與其它蛋白發生結合。同時，當內源表達的HZF1蛋白被抑制時，抗HZF1抗體與HZF1蛋白的免疫應答也就消失。
實施例11實驗K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i穩定轉染子hemin誘導的紅系分化能力為了研究HZF1蛋白在細胞分化和腫瘤中的可能作用，首先分析紅白血病細胞系K562向紅系分化時的情況。按實施例10描述的方法培養K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i穩定轉染子細胞，加入40μmol/L hemin誘導。每隔12h使用聯苯氨染色分析紅系分化情況。在50μl(50μg/ml)聯苯胺中加入1μl 30％過氧化氫混勻即為染色液。取少量細胞，離心收集，PBS洗一遍后，重懸在100μlPBS中，取81μl上述細胞懸液加入9μl染色液混勻后，放置3-5min，然后取部分細胞涂片觀察，計數。一般計200個細胞，算出染色陽性細胞的百分比。圖9顯示了該項實驗的結果K562pAVu6HZF1i轉染子細胞在hemin誘導下聯苯氨陽性細胞比例沒有顯著的增加，而K562pAVu6轉染子細胞在hemin的誘導下聯苯氨陽性的細胞比例明顯升高。這說明K562pAVu6轉染子hemin誘導的紅系分化特性沒有改變，而K562 pAVu6-HZF1i轉染子細胞hemin誘導的紅系分化被抑制。這說明HZF1表達阻遏嚴重抑制紅系分化，也可由此推斷HZF1蛋白表達的增加參與促進腫瘤細胞系K562脫離分化阻抑狀態，向紅系方向繼續分化。
實施例12實驗K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i穩定轉染子PMA誘導的巨核細胞分化能力為了檢測HZF1內源表達的抑制是否影響K562細胞PMA誘導的巨核系分化，我們將穩定轉染子細胞用5ng/ml PMA誘導48h后用PI進行染色，然后用流式細胞儀分析細胞的多倍性(Ploidy)。按實施例10描述的方法培養K562pAVu6和K562pAVu6HZF1i穩定轉染子細胞，加入5ng/mLPMA誘導48h后收集細胞，用PBS洗兩遍，過400目網使細胞成單個細胞，計數。5ng/mLPMA誘導用500μlPBS重懸細胞。逐滴加入5ml預冷的無水乙醇，邊加邊震蕩，以防細胞成團快，置4℃固定過夜。取上述固定好的細胞(5×106)，于15ml離心管中，1000rpm離心，去乙醇。用PBS重懸細胞，加入1％BSA或小牛血清，1000rpm離心，去上清，重復一遍。沉淀用適量含1％BSA或小牛血清的PBS重懸。加入100μl10XPI溶液(500μg/ml PI，溶于3.8×10-2M枸櫞酸鈉，pH7.0)。加入100μl RNaseA(10mg/ml)，37℃溫育30min。用PBS漂洗細胞。用流式細胞儀檢測。圖10顯示了該項實驗的結果K562pAVu6HZF1i和K562pAVu6轉染子細胞在沒有PMA誘導的情況下二倍體細胞遠多于四倍體細胞。PMA誘導后K562pAVu6轉染子細胞的四倍體細胞大幅增加，超過了二倍體細胞。而PMA誘導的K562pAVu6HZF1i轉染子四倍體細胞比例雖然增加，但是二倍體仍然多于四倍體。這說明RNA干擾對內源HZF1表達的抑制減弱了K562細胞PMA誘導的巨核系分化。也可以由此推測HZF1蛋白表達的增加參與促進腫瘤細胞K562脫離分化阻抑狀態，向巨核系方向繼續分化。
SEQUENCE LISTING<110>中國醫學科學院基礎醫學研究所<120>鋅指蛋白HZF1抗體<140>2005101093930<141>2005-10-19<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>777<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac120gacgacaagg ccatggctga tatcgagctc tcagttccag gaccatcccc ctggacccct180gcagcccagg cccgtgtgag agatgctcct gctgtgaccc accctggatc tgcagcctgt240ggtaccccct gctgtagtga tactgagctg gaagccatct gccctcacta tcagcagcca300gcagattgtg acaccaggac tgaagacaag gagtttcttc acaaggaaga cattcatgaa360gatttggaat cacaggcaga aatatcagaa aactatgctg gtgatgtttc ccaggtaccc420gagcttggag atctgtgtga tgatgtatca gaaagagact ggggagtccc cgaaggcagg480aggctgccac agtccctctc ccaggagggg gacttcacac cagctgccat ggggctcctt540aggggcccct taggggagaa agatctggac tgtaatggtt ttgacagtcg cttcagtctg600agcccaaacc tgatggcatg tcaggaaatc cctacagaag agaggccaca tccatatgac660atgggtggcc agagtttcca gcacagtgtg gacctaactg gtcatgaggg ggttcccaca720gctgaaagtc cactcactcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaa 777<210>2<211>258<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser1 5 10 15Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp20 25 30Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile35 40 45
Glu Leu Ser Val Pro Gly Pro Ser Pro Trp Thr Pro Ala Ala Gln Ala50 55 60Arg Val Arg Asp Ala Pro Ala Val Thr His Pro Gly Ser Ala Ala Cys65 70 75 80Gly Thr Pro Cys Cys Ser Asp Thr Glu Leu Glu Ala Ile Cys Pro His85 90 95Tyr Gln Prn Pro Ala Asp Cys Asp Thr Arg Thr Glu Asp Lys Glu Phe100 105 110Leu His Lys Glu Asp Ile His Glu Asp Leu Glu Ser Gln Ala Glu Ile115 120 125Ser Glu Asn Tyr Ala Gly Asp Val Ser Gln Val Pro Glu Leu Gly Asp130 135 140Leu Cys Asp Asp Val Ser Glu Arg Asp Trp Gly Val Pro Glu Gly Arg145 150 155 160Arg Leu Pro Gln Ser Leu Ser Gln Glu Gly Asp Phe Thr Pro Ala Ala165 170 175Met Gly Leu Leu Arg Gly Pro Leu Gly Glu Lys Asp Leu Asp Cys Asn180 185 190Gly Phe Asp Ser Arg Phe Ser Leu Ser Pro Asn Leu Met Ala Cys Gln195 200 205Glu Ile Pro Thr Glu Glu Arg Pro His Pro Tyr Asp Met Gly Gly Gln210 215 220Ser Phe Gln His Ser Val Asp Leu Thr Gly His Glu Gly Val Pro Thr225 230 235 240Ala Glu Ser Pro Leu Thr Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Leu Arg Set245 250 255Gly Cys
權利要求
1.鋅指蛋白HZF1高效性和特異性抗體的制備方法。
2.如權利要求1的HZF1高效性和特異性抗體的制備方法，主要指利用HZF1蛋白順序中特異性高的肽段作為抗原，獲得高效性和HZF1特異性抗體。
3.如權利要求2的制備方法，包括利用HZF1蛋白順序中特異性高的肽段作為抗原，獲取多克隆抗體和單克隆抗體的方法。
4.如權利要求2的制備方法，其中高特異性肽段包括用基因工程方法獲得肽段和用化學合成的方法制備的肽段。
5.如權利要求1-4任一項的制備方法，其中鋅指蛋白HZF1的特異性抗體的抗原選自非鋅指區的特異性序列。
6.如權利要求5的制備方法，其中非鋅指區是指除去鋅指區后HZF1蛋白的序列的全部或部分。
7.如權利要求1所述的鋅指蛋白HZF1的特異性抗體在制備用于診斷與HZF1功能相關疾病的試劑中的用途。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于所述的相關疾病是與HZF1表達和功能相關的紅系細胞和巨核細胞分化相關的腫瘤、貧血及紅系細胞或(和)巨核細胞減少癥，以及與HZF1功能和其他細胞和組織分化發育相關的疾病。
全文摘要
本發明涉及一種生物蛋白特異性多克隆抗體和單克隆抗體、它們的制備方法及其應用。更具體地，本發明涉及鋅指蛋白HZF1的特異性多克隆抗體和單克隆抗體、它們的制備方法及其在與HZF1功能相關疾病診斷中的應用。該抗體可應用于與HZF1功能和紅系細胞和巨核細胞分化相關的腫瘤、貧血及紅系細胞或(和)巨核細胞減少癥的診斷以及與HZF1功能和其他細胞和組織分化發育相關疾病的診斷中。
文檔編號G01N33/574GK1951966SQ20051010939
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日 優先權日2005年10月19日
發明者張俊武, 彭瀚, 杜占文, 張昕 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所