專利名稱：一種檢測動物源性食品中萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學檢測領域，具體地說，提供一種檢測動物源性食品中萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
萊克多巴胺(Ractopamine)是一種苯乙醇胺類藥物。用于畜牧漁業，它是一種“營養再分配劑”，屬于β興奮劑，萊克多巴胺做為“瘦肉精”的替代品效果好，經濟回報高，使用普遍；用于醫藥，它是一種強心藥，可用于治療肥胖癥和肌肉萎縮癥。但人累計攝入劑量超過一定值，或實用萊克多巴胺高殘留在內臟組織時，出現中毒反應，癥狀表現為骨骼肌收縮增加，破壞快縮肌纖維與慢縮肌纖維之間的融合，引發肌肉震顫，四肢和面部的肌肉尤為明顯，其它中毒癥狀包括心動過速、心率失常、腹痛、肌肉疼痛、惡心和暈眩等，因此我國禁止使用，我國農業部第176號公告規定萊克多巴胺為禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物。因此，檢測萊克多巴胺在動物性食品中的殘留量是非常必要的。
目前，常用于萊克多巴胺殘留檢測的方法主要有微生物法和儀器分析法。
微生物檢測法雖然經濟、操作簡便，但在樣本中有其他微生物抑制劑存在時，其靈敏度和特異性受到限制；高效液相色譜分析法、氣譜、氣質聯機法等單純的儀器分析方法，雖然靈敏度高，但樣本前處理及測定操作煩瑣，費用高，不適宜于大量樣本篩查，可以作為殘留的確證分析。
發明內容
(一)要解決的技術問題本發明目的在于提供一種結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶的用于動物源性食品中萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。
(二)技術方案本發明所提供的酶聯免疫試劑盒包括(1)包被了萊克多巴胺抗原或抗抗體的酶標板；(2)萊克多巴胺抗體；(3)酶標記物；(4)萊克多巴胺標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復溶液；(8)終止液。
其中所述的包被了萊克多巴胺抗原的酶標板在制備的過程中，所用的包被原是使用活性酯法(DCC、NHS)將萊克多巴胺與載體蛋白偶聯得到的；包被的抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；所用的包被液是pH值9.6、0.05～0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液，所用的封閉液是含有3～10％小牛血清的溶液。
其中所述的萊克多巴胺抗體在制備過程中，所用的免疫原是采用活性酯法(DCC、NHS)將萊克多巴胺與載體蛋白進行偶聯得到的，所用的抗體稀釋液是pH值8.2、0.05～0.1mol/L、含有3～5％小牛血清的磷酸鹽緩沖液。本發明所述試劑盒中萊克多巴胺抗體的蛋白濃度為0.5～5.0μg/L。
酶標記物為酶標記抗抗體或酶標記萊克多巴胺抗原，酶標記抗抗體為酶標記羊抗鼠抗抗體或酶標記羊抗兔抗抗體，酶標記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯得到的，酶標記萊克多巴胺抗原是采用混合酸酐法將標記酶與萊克多巴胺半抗原進行偶聯得到的。所用標記酶可為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，本發明優選為辣根過氧化物酶。辣根過氧化物酶可采用現有技術中的多種方法將其與抗抗體或萊克多巴胺抗原進行偶聯，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發明經過長期的勞動創造將過碘酸鈉法進行了改良，使其省時、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體或萊克多巴胺抗原的濃度比率，節省了原材料。
其中所述標準溶液的濃度為0～40.5μg/L，可選擇0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。
其中所述的底物顯色液是當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液。
其中所述的濃縮洗滌液為含有0.8～1.2％吐溫20的磷酸鹽緩沖液。
其中所述的濃縮復溶液為含50％甲醇、pH8.0～8.6、0.1～0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。
其中所述的終止液為1～2mol/L的硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液。
可作為固定萊克多巴胺偶聯抗原或抗抗體載體的物質很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等。
本發明還提供了使用上述試劑盒定性、定量檢測動物源性食品中萊克多巴胺殘留量的方法，它包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結果。
優選地，樣品處理方法為a、豬尿尿樣用NaOH溶液調節pH至10～11后，加入無水Na2SO4，再加入乙酸乙酯-丙酮，振蕩后離心(或靜置分層)。取有機相在氮氣流下吹干。用稀釋的復溶液溶解。
b、組織稱取組織，先加入無水乙腈，再加入無水Na2SO4。充分振蕩。取上清液，氮氣流下吹干。加入緩沖液混合，加入異丁醇和無水Na2SO4，振蕩萃取，離心，取出上層有機相，氮氣流下吹干。用稀釋的復溶液溶解即可進行分析。
c、飼料樣本準確稱取飼料于離心管中。加入甲醇和乙醇，充分振蕩，離心。取上清，氮氣吹干。加入二氯甲烷，溶解殘留物，再加入緩沖液充分混合，離心，取上層液加入已經稀釋了的復溶液，即可進行分析。
優選地，其中試劑盒檢測是向包被有萊克多巴胺偶聯抗原的酶標板微孔中加入標準品溶液或樣品溶液，再加入萊克多巴胺抗體，溫育后洗滌拍干，加入酶標記抗抗體后顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。或者，是向包被有抗抗體的酶標板微孔中加入萊克多巴胺抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標萊克多巴胺抗原和標準品溶液或樣品溶液，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。
優選地，檢測結果分析過程為用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。計算公式為百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％公式中B為標準溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標準溶液的平均吸光度值。以萊克多巴胺濃度的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應每一個樣品中萊克多巴胺的濃度則可從標準曲線上讀出，根據酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標準溶液顏色的比較可判斷樣品中萊克多巴胺的濃度范圍。
優選地，檢測結果的分析也可以采用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。
優選地，檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1.5小時可以完成，最低檢測限為0.5μg/L。
其中，抗原及抗體的制備方法為(1)抗原的合成半抗原的合成將萊克多巴胺采用氯乙酸鈉合成萊克多巴胺半抗原，采用氯乙酸鈉進行鹵代反應，把萊克多巴胺分子上的羥基取代，合成含有2個碳的羧基間隔臂制備成萊克多巴胺的半抗原。
包被原和免疫原的合成
將萊克多巴胺半抗原和牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、甲狀腺蛋白(BCG)等載體蛋白，分別采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)、混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)、活性酯法(DCC、NHS)進行偶聯得到包被原和免疫原。
通常免疫原的純度要求較高，免疫原的純度越高，制備的抗體特異性越強，至少要達到90％以上，本發明合成的免疫原采用免疫電泳測定其純度為98.5％。
(2)酶標記抗抗體的制備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯。傳統的過碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4∶1；由于辣根過氧化物酶在強氧化的作用下產生許多與抗抗體結合的位點，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當了連接各分子的橋梁，降低了酶標記物的酶活性，使制備的偶聯物中混有許多聚合體，為了解決這個問題，我們將傳統的方法進行了改良，即1)省去了氨基的封閉過程，因為能產生自身氨基連接的氨基實際很少。
2)降低了辣根過氧化物酶∶抗抗體的摩爾濃度比率至2∶1，改良后的方法比傳統的方法簡便，對酶的活性的損失減少。
(3)酶標記萊克多巴胺抗原的制備采用混合酸酐法將辣根過氧化物酶與萊克多巴胺半抗原偶聯得到酶標記萊克多巴胺抗原。
(4)萊克多巴胺單克隆抗體的制備動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以萊克多巴胺與載體蛋白偶聯物為免疫原對小鼠進行免疫，可以得到血液里含有萊克多巴胺特異性抗體的小鼠脾臟。
細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭酶聯免疫方法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
細胞凍存和復蘇取處于對數生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。
單克隆抗體的制備與純化采用體內誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，7～14天后腹腔注射雜交瘤細胞，7～10天后采集腹水。
經辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
(5)萊克多巴胺兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以萊克多巴胺與載體蛋白偶聯物為免疫原對新西蘭大白兔進行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價，心臟采血，經硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
其中所用試劑的配制方法為a.萊克多巴胺標準溶液萊克多巴胺系列標準溶液6瓶，0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L；b.包被緩沖液pH 9.6，0.05～0.1mol/L的碳酸鹽緩沖液；c.封閉液含3～10％小牛血清的溶液；d.濃縮洗滌液含0.8～1.2％吐溫20的磷酸鹽緩沖液(pH7.4，0.012mol/L)，為正常使用濃度的15～25倍；e.酶標記物酶標記抗抗體或酶標記萊克多巴胺抗原；f.底物顯色液A液過氧化氫或過氧化脲；g.底物顯色液B液鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯苯胺(TMB)；h.底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液pH 8.1、含有MgCl20.01％100mmolTris-HCl；i.終止液1～2mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液；j.濃縮復溶液pH8.0～8.6、0.1～0.2mol/L、含50％甲醇的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的5～10倍；k.緩沖液含48％無水碳酸鈉和15％氯化鈉的去離子水溶液。
其中酶標板的制備方法為(1)用包被緩沖液將萊克多巴胺與載體蛋白偶聯物稀釋，向酶聯板微孔中加入抗原稀釋液，放入37℃環境進行孵育，再放入4℃環境過夜(得到的酶聯板的穩定性好)，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37℃孵育，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
(2)用包被緩沖液將抗抗體稀釋，向酶聯板微孔中加入抗抗體稀釋液，放入37℃環境進行孵育，放入4℃環境過夜(得到的酶聯板的穩定性好)，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37℃孵育，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
本發明試劑盒的檢測原理為(1)將萊克多巴胺抗原吸附于固相載體上，加入樣本或萊克多巴胺標準品溶液并加入萊克多巴胺抗體工作液，待測樣品中殘留的萊克多巴胺和固相載體上包被的萊克多巴胺抗原競爭萊克多巴胺抗體，再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中萊克多巴胺殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出萊克多巴胺濃度范圍。
(2)將抗抗體吸附于固相載體上，加入萊克多巴胺特異性抗體工作液，再加入酶標記萊克多巴胺抗原并加入樣本或萊克多巴胺標準品溶液，待測樣品中殘留的萊克多巴胺與酶標記萊克多巴胺抗原競爭萊克多巴胺抗體，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中萊克多巴胺殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出萊克多巴胺濃度范圍。
(三)有益效果本發明檢測萊克多巴胺的試劑盒主要采用間接競爭酶聯免疫測定方法定性或定量檢測豬肉、尿樣、飼料等樣品中萊克多巴胺的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。
本發明該試劑盒采用高特異性的萊克多巴胺單克隆抗體或多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節省時間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發明具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無放射性同位素污染的等優點，可在動物性食品萊克多巴胺殘留檢測中發揮重要作用。
圖1萊克多巴胺檢測標準曲線圖。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1試劑盒組分的制備1、抗原的合成a.取萊克多巴胺半抗原2g溶于20ml，0.5M的氫氧化鈉溶液中。
b.取2g氮羥基琥珀酰甲胺溶于8ml純水并加到萊克多巴胺半抗原溶液中，室溫攪拌反應2.5小時。
c.取人血清白蛋白(HSA)或甲狀腺蛋白(BCG)載體蛋白22g溶于75mlpH9碳酸鹽緩沖液中。
d.將載體蛋白滴加到半抗原溶液中4℃攪拌過夜。
e.將合成的人工抗原用0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次。最后將抗原濃縮保存或凍干保存得到萊克多巴胺免疫原和包被原。
通常免疫原的純度要求較高，免疫原的純度越高，制備的抗體特異性越強，至少要達到90％以上，本發明合成的免疫原采用免疫電泳測定其純度為98.5％。
2、酶標記抗抗體的制備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)進行偶聯，采用的方法是改良的過碘酸鈉法，方法如下a.8mg辣根過氧化物酶溶解于2mL蒸餾水中。
b.加入現配制的100mmol/LNaIO4溶液0.4mL，室溫攪拌反應20分鐘。
c.用1mmol/L醋酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，除去多余的NaIO4，同時使自身偶聯的酶還原。
d.加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.6)40μl和含有16mg IgG的磷酸鹽緩沖液(pH 8.6、5mol/L)2.0mL，室溫攪拌反應4小時。
e.加入現配制的NaBH4水溶液(1mol/L)0.1mL，4℃反應4小時，以還原Schiff堿。
f.純化保存。
3、萊克多巴胺鼠單克隆抗體制備動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以萊克多巴胺與人血清白蛋白偶聯物為免疫原，免疫劑量為80μg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。
細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭酶聯免疫方法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
細胞凍存和復蘇取處于對數生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成5×106個/ml的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。
單克隆抗體的制備與純化采用體內誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，10天后腹腔注射雜交瘤細胞5×106個/只，10天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
4、萊克多巴胺兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以萊克多巴胺與人血清白蛋白偶聯物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
5、酶標板的制備用包被緩沖液將萊克多巴胺與甲狀腺蛋白偶聯物稀釋成0.1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，放入4℃環境過夜(得到的酶聯板的穩定性好)，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實施例2檢測萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒的組建組建檢測萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被萊克多巴胺抗原的酶標板；(2)蛋白濃度為0.5μg/L的萊克多巴胺鼠單克隆抗體；(3)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；(4)萊克多巴胺標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物顯色液A液為過氧化氫，底物顯色液B液為鄰苯二胺；(6)濃縮洗滌液為含0.8％吐溫20的磷酸鹽緩沖液；(7)復溶液為含50％甲醇、pH8.0、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液；(8)終止液為1mol/L的硫酸溶液。
實施例3檢測萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒的組建組建檢測萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被羊抗鼠抗抗體的酶標板；(2)蛋白濃度為5.0μg/L的萊克多巴胺單克隆抗體；(3)用堿性磷酸酯酶標記的萊克多巴胺；(4)萊克多巴胺標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液；(6)濃縮洗滌液為含1.2％吐溫20的磷酸鹽緩沖液；(7)復溶液為含50％甲醇、pH8.6、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液；(8)終止液為2mol/L的氫氧化鈉溶液。
實施例4樣品中萊克多巴胺殘留的檢測1、樣品前處理a、豬尿1ml尿樣用1mol/L NaOH調節pH至10后，加入1g無水Na2SO4，再加3ml乙酸乙酯-丙酮(V/V＝3∶1)，振蕩后3000rpm、15℃以上離心5min(或靜置分層)。取1.5ml有機相在氮氣流下吹干。用1ml已稀釋了的復溶液溶解，取50μl進行分析。
b、組織稱取組織3g±0.1g，先加入無水乙腈9ml再加入2g無水Na2SO4。充分振蕩10min。取上清液4ml，氮氣流下吹干。加入1ml正己烷振蕩溶解，再加入用1ml已稀釋了的復溶液混合振蕩1min，3000g以上離心5min，去掉上層有機相。取樣本提取液100μl+100μl復溶稀釋液后，取50μl進行分析。
c、飼料樣本準確稱取2.0±0.1g飼料于40ml離心管中。加入10ml甲醇∶乙醇(V/V＝1∶1)，充分振蕩10min，4000rpm離心10min。取上清2ml，氮氣吹干。加入1ml二氯甲烷，溶解殘留物，再加入1ml復溶液，充分混合5min，10000rpm離心10min，取上層液，用復溶液稀釋后取50μl進行分析。
2、用試劑盒進行檢測向萊克多巴胺與甲狀腺蛋白偶聯物包被的酶標板微孔中加系列標準品或樣品溶液50μl，再加入抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應30min。倒出孔中液體，每孔加入250μl稀釋了的洗滌液(pH7.4、0.01M、含0.8％吐溫的磷酸鹽緩沖液)，30秒后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入酶標記抗抗體100μl用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應30min。底物顯色液A液(過氧化氫)50μl，再加B液(鄰苯二胺)50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15～30min。每孔加入終止液(2mol/L硫酸)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值)。
結果分析計算百分吸光度值并繪制標準曲線，相對應每一個樣品中萊克多巴胺的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出在樣本中萊克多巴胺的殘留量。利用計算機專業軟件，更便于大量樣品的快速分析。
根據酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標準溶液顏色的比較可判斷樣品中萊克多巴胺的濃度范圍。
實驗例1試劑盒精密度試驗1、標準可重復性試驗從每批按照實施例2(3)中的方法制備的酶聯板中，各抽出10個微孔，測定4.5μg/L標準溶液的吸光度值(OD值)，重復3次，計算變異系數CV％，結果見表1。
表1標準可重復性試驗
結果表明變異系數范圍在4.6～8.1％之間，符合了變異系數小于20％的規定，說明本試劑盒標準品精密度達到了《農業部文件》農醫發 17號附件2試劑盒備案參考評判標準中第4點精密度和準確度的精密度標準。
2、樣本可重復性試驗以2.5μg/kg濃度的萊克多巴胺對尿液和豬肉進行添加，以100μg/kg濃度的萊克多巴胺對飼料進行添加，添加到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各五個，每個濃度重復5次，分別計算變異系數，結果見表2～4。
表2尿液樣品可重復性試驗
表3豬肉樣品可重復性試驗
表4飼料樣品可重復性試驗
結果表明尿樣本變異系數均低于15％，豬肉樣本的變異系數均低于10％，飼料樣本的變異系數均小于20％，符合了變異系數小于20％的《農業部文件》農醫發 17號附件2試劑盒備案參考評判標準中第4點精密度和準確度的精密度規定。
實驗例2試劑盒的準確度試驗取兩個濃度的萊克多巴胺標樣，對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分別計算回收率，結果見表5。
表5準確度測定試驗
結果表明豬肉，豬肝添加的回收率在62.4～89.8％之間，尿液添加回收率在72.4～90.6％之間，飼料中添加回收率在69.8～86.1％之間。
實驗例3試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2～8℃，經過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、萊克多巴胺添加實際測定值均在正常范圍之內。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2～8℃保存6個月以上。
權利要求
1.一種用于檢測動物源性食品中萊克多巴胺的試劑盒，其特征在于它包含下列成分(1)包被了萊克多巴胺抗原或抗抗體的酶標板；(2)萊克多巴胺抗體；(3)酶標記物；(4)萊克多巴胺標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復溶液；(8)終止液。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于萊克多巴胺抗原是使用活性酯法將萊克多巴胺半抗原與載體蛋白進行偶聯得到的；抗抗體是以羊為免疫動物，以鼠源性抗體或兔源性抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫得到的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于菜克多巴胺抗體為鼠單克隆抗體或兔多克隆抗體。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標記物是酶標記的羊抗鼠抗抗體、羊抗兔抗抗體或酶標記的萊克多巴胺抗原，酶標記抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶與抗抗體進行偶聯得到的，酶標記抗原是采用混合酸酐法將辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶與萊克多巴胺半抗原進行偶聯得到。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液為含有0.8～1.2％吐溫20的磷酸鹽緩沖液；濃縮復溶液為pH8.0～8.6、0.1～0.2mol/L、含50％甲醇的的磷酸鹽緩沖液；當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于萊克多巴胺抗體的蛋白濃度為0.5～5.0μg/L。
7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于萊克多巴胺標準品溶液的濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。
8.一種檢測樣品中萊克多巴胺殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權利要求1～7任一所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結果。
9.如權利要求8所述的方法，其中試劑盒檢測為向包被有萊克多巴胺抗原的酶標板微孔中加入標準品或樣品溶液，再加入萊克多巴胺抗體，溫育后洗滌拍干，加入酶標記抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。
10.如權利要求8所述的方法，其中試劑盒檢測為向包被有抗抗體的酶標板微孔中加入萊克多巴胺抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標記萊克多巴胺抗原和標準品或樣品溶液，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。
全文摘要
本發明公開了一種檢測動物源性食品中萊克多巴胺的酶聯免疫試劑盒，還提供了使用該試劑盒對預處理的動物源性食品進行萊克多巴胺殘留檢測的方法。該試劑盒組成為包被了萊克多巴胺抗原或抗抗體的酶標板、萊克多巴胺鼠單克隆抗體或多克隆抗體工作液、酶標記的抗抗體或酶標記的萊克多巴胺抗原、萊克多巴胺標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮復溶液。本發明還公開了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測萊克多巴胺藥物的方法，它包括以下步驟首先進行樣品前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結果。本發明提供的檢測動物組織中萊克多巴胺殘留的酶聯免疫試劑盒及檢測方法操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現場監控且適合大量樣本篩查。
文檔編號G01N33/535GK1766630SQ20051008677
公開日2006年5月3日 申請日期2005年11月3日 優先權日2005年11月3日
發明者沈建忠, 何方洋, 萬宇平, 馮才偉, 吳小平, 馮才茂, 汪善良, 李軍, 趙正苗, 張照亮, 張素霞, 史為民, 丁雙陽, 羅曉琴, 孫倩 申請人:北京望爾生物技術有限公司