專利名稱：一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于對動物源食品中金霉素進行殘留分析的酶聯免疫檢測技術領域。具體地說，屬于一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
金霉素是四環素類藥物主要成員之一，為多環并四苯羧基酰胺母核的衍生物，具有抗菌作用，其同類藥物主要有四環素、土霉素和去甲基金霉素、強力霉素等。
由于金霉素對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、螺旋體、立克次氏體、支原體、衣原體、原蟲等具有抑制作用，因此其應用極為廣泛。但是，不合理用藥可導致金霉素在動物可食性組織中蓄積殘留，繼而危害人體健康。鑒于此，對肉、蛋、奶等動物源食品中金霉素藥物殘留量的監測勢在必行。
現有的檢測動物源食品中獸藥殘留鑒別和判定方法主要包括微生物方法、高效液相色譜法和酶聯免疫分析法等。
應用微生物方法的主要缺點是檢測時間長(2～3天)，缺乏專一性，甚至無法對某一類藥物定性(NikolaosA.Botsoglou，Dimitrios J.Fletouris.Drug residues in foods pharmacology，food safety andanalysis[M].New York，2001)。
應用高效液相色譜法(HPLC)法的主要缺點是檢測時間較長、靈敏度較低、設備昂貴、難以在基層推廣應用。
目前，國內外專門針對動物源食品中金霉素殘留量分析的酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法尚未見報道和推廣應用。
酶聯免疫分析方法所用的核心試劑主要是生物試劑，例如抗體、酶標記抗體，檢測原理是生物化學反應，其檢測結果極易受到各種因素的干擾，因此，排除干擾是關鍵。
現有的檢測某種獸藥殘留的ELISA方法，由于所制備的抗體的特異性存在差異，在處理組織樣品時，都要求過柱凈化以排除干擾，這樣勢必增加操作步驟，加大檢測成本，延長檢測時間(一般延長2小時左右)，不利于提高工作效率。
本發明的試劑盒用于對金霉素殘留的檢測具有良好的應用前景，可以在較短時間內檢測大量樣品，排除大量陰性樣品，同時樣品處理既簡單、省時、省力，又無需昂貴的儀器設備，所以比較適合在基層檢驗檢疫單位推廣使用。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，研制一種對金霉素有特異性的殘留分析檢測試劑盒并建立一種基于金霉素殘留檢測的ELISA方法。本發明是通過對金霉素的分子改造，制備出可以固定到酶標板上的包被抗原和能夠免疫動物的人工免疫原，進一步制備金霉素抗體，適用于對動物源食品中金霉素殘留的測定。
本發明是這樣實現的一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫吸附檢測試劑盒，它包括盒體、設在盒體內的96或48酶標板、設在盒體內的試劑，其中的試劑包含洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標記羊抗兔抗體、底物液、顯色液和終止液，在所述的酶標板的每孔內有包被液包被的能與金霉素抗體特異性反應的包被抗原、金霉素標準溶液和金霉素抗體，所說的金霉素抗體是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
所說的包被抗原為金霉素乙酸和卵清白蛋白的復合物(CTC-OVA)。
所說的人工免疫原是由金霉素乙酸與牛血清白蛋白的復合物(CTC-BSA)。
在本發明的試劑盒中還包含下列試劑洗滌液含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀和氯化鈉，pH7.4)；樣品稀釋液磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀和氯化鈉，pH7.4)；底物液含有20％四甲基聯苯胺的無水乙醇溶液；顯色液含有過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH5～5.4；終止液硫酸或鹽酸溶液(2mol/L)。
一種應用酶聯免疫吸附反應(ELISA)檢測樣品中金霉素殘留的分析方法，其步驟包括合成人工免疫抗原、制備抗體和樣品處理，其中的金霉素分子改造是將鹽酸金霉素與氯乙酸鈉反應得到金霉素乙酸，再將金霉素乙酸與卵清白蛋白反應得到包被抗原；將金霉素乙酸與牛血清白蛋白反應得到人工免疫原；在本發明中所說的樣品處理不需要過柱凈化。由于本發明制備的抗體特異性強，能夠有效排除組織樣品中雜蛋白的干擾，因此，處理樣品時，不需要過柱凈化，因而減少了操作步驟，降低了檢測成本，縮短了檢測時間，提高了工作效率。
本發明的試劑盒和建立的檢測方法可以方便快速地應用于判定食品，特別是判定動物源食品中金霉素殘留量是否超標。
本發明的試劑盒及其檢測方法經過靈敏度、精密度、特異性等質控項目測定，表明該試劑盒特異性強、靈敏度高，樣品處理簡單、實用，性能穩定，既適合專業檢測部門應用，也適合于在基層單位推廣應用。
本發明的試劑盒最低檢測限可達0.59μg/kg，樣品處理方法較儀器檢測法簡單，板內變異系數在20％以內，100μg/kg濃度豬肌肉添加回收率在70％～110％，牛奶60％～120％，雞蛋60％～120％。
本發明的試劑盒具有以下特點1、所制備的金霉素抗體對金霉素具有很高的特異性，可對動物源食品中金霉素的殘留量進行專一檢測和判定。2、樣品處理不需要過柱凈化，處理步驟簡單、實用，特別適合基層檢驗檢疫單位使用。3、樣品處理較現有儀器簡單、靈敏、省時。
本發明技術細節將在以下的描述中進一步闡明。
圖1是本發明的金霉素酶聯免疫快速檢測試劑盒和檢測方法技術路線圖。
圖2試劑盒的直觀示意3酶標板的直觀示意4是本發明涉及的金霉素標準品的紫外圖譜，顯示了該金霉素標準品三個吸收峰即218nm、277nm、368nm。
圖5是本發明涉及的氯乙酸鈉標準品的紫外圖譜，顯示了一個吸收峰208nm。
圖6是本發明改造的金霉素乙酸的紫外圖譜，顯示了金霉素乙酸的4個吸收峰217nm、245nm、255nm、287nm。揭示了金霉素乙酸紫外圖譜不同于金霉素和氯乙酸鈉的紫外圖譜。
圖7是本發明涉及的牛血清白蛋白(BSA)標準品的紫外圖譜，顯示了牛血清白蛋白標準品兩個吸收峰279nm、215nm。
圖8是本發明的蛋白金霉素復合物的紫外圖譜，顯示了牛血清白蛋白金霉素復合物的三個吸收峰209nm、291nm、309nm。揭示了牛血清白蛋白金霉素復合物紫外圖譜不同于金霉素乙酸和牛血清白蛋白的紫外圖譜。
圖9是本發明的金霉素抗體與鹽酸金霉素標準品的間接競爭反應曲線，X軸為鹽酸金霉素標準品的濃度對數值，Y軸為鹽酸金霉素對光密度值的抑制百分率。隨著鹽酸金霉素標準品濃度的增高，光密度值抑制百分率迅速下降，形成典型的“S”形曲線，揭示了金霉素抗體與金霉素藥物具有特異、敏感的免疫反應性。
具體實施例方式
實施例1制備金霉素乙酸、人工免疫原、包被抗原、抗金霉素抗體1.1制備金霉素乙酸稱取300mg鹽酸金霉素(在另外的實施例中可以用金霉素、金霉素堿代替，其使用量與鹽酸金霉素相同)，用25mlpH10的磷酸鹽緩沖液溶解，加入58.5mg氯乙酸鈉，室溫下充分反應10小時后過濾、稀鹽酸調pH值至4.0，靜置2小時，抽濾后50℃烘干，得到金霉素乙酸。
1.2制備人工免疫原用2ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解118.8mg金霉素乙酸，攪拌中加入N，N二環己基碳酰亞胺(DCC)55mg，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)28.8mg，4℃攪拌反應10小時以上，4℃離心(10000r/min)，將上清液加入680mgBSA溶液中(pH8.0PBS10ml，DMF1ml)，4℃攪拌過夜，4℃離心(10000r/min)，透析72小時，得到牛血清白蛋白金霉素復合物即人工免疫原(CTC-BSA)。
1.3制備包被抗原用2ml DMF溶解118.8mg金霉素乙酸，攪拌中加入DCC 55mg，NHS 28.8mg，4℃攪拌反應10小時以上，4℃離心(10000r/min)，將上清液加入125mgOVA溶液中(pH8.0 PBS10ml，DMF1ml)，4℃攪拌過夜，4℃離心(10000r/min)，透析72小時，得到卵清白蛋白金霉素復合物即包被抗原(CTC-OVA)。
1.4制備金霉素抗體選健康雄性體重1.5kg的家兔4只，按2只一組分為兩組，其中一組按0.8mg/只的免疫劑量實施免疫，另一組按1.6mg/只的免疫劑量實施免疫。方法是首次用弗氏完全佐劑(購自Sigma公司)、第二次以后用弗氏不完全佐劑(購自Sigma公司)，按1∶1比例乳化后皮下多點注射，每間隔4周免疫一次。四免后雙擴檢測血清抗體效價達1∶64。
1.5金霉素抗體穩定性考核設計溫度-20℃、4℃、20℃設計時間10天、20天、30天、2個月、4個月、6個月、1年保存方法按1∶1的比例添加甘油考核指標光密度值OD450nm操作步驟同實施例6.2。結果見表1。
表1 本發明制備的金霉素抗體穩定性測試
結果表明，金霉素抗體在-20℃和4℃低溫條件下較穩定。
1.6金霉素抗體特異性考核取包被、封閉好的96孔酶標板，其中12孔每兩孔分別加入0、0.1、1、10、100、1000μg/kg金霉素標準溶液，每孔50μl。另取12孔，每兩孔分別加入0、0.1、1、10、100、1000μg/kg去甲基金霉素標準溶液，每孔50μl。再取12孔，每兩孔分別加入0、0.1、1、10、100、1000μg/kg四環素標準溶液，每孔50μl。各孔加入金霉素抗體50μl，以下操作同2.7中的測定程序。從標準曲線中查出各標準溶液的50％百分抑制率所分別對應的各標準品的濃度值并計算交叉反應率(金霉素對某藥物的交叉反應率＝金霉素標準溶液50％百分抑制率所對應的濃度÷某藥物標準溶液50％百分抑制率所對應的濃度×100％)。同法測定強力霉素、土霉素、咪諾四環素、吡咯烷甲四環素的交叉反應率。其結果見表2。
表2 本發明金霉素抗體的交叉反應測定結果
結果表明，金霉素與去甲基金霉素、四環素、強力霉素、土霉素、咪諾四環素、吡咯烷甲四環素的交叉反應率均小于1％。
實施例2建立金霉素酶聯免疫間接競爭檢測方法(ELISA)2.1包被原包被濃度和金霉素抗體工作濃度(稀釋倍數)的確定通過方陣滴定試驗確定高、中、低三個參照點以吸光度值約1.0且左右相鄰吸光度差值最大的點為參照點。操作步驟在96孔酶標板上的第一行包被8μg/kg的包被原，第二至第七行依次包被4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/kg的包被原。4℃過夜，1％卵清白蛋白37℃封閉1小時，洗滌2次，拍干，在酶標板的第一列至第七列依次加入100μl稀釋倍數為1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000的金霉素抗體，37℃孵育30分鐘，洗滌3次，拍干，各孔加入100μl底物液和顯色液的等比混合液，避光顯色15分鐘，加入50μl終止液，2分鐘后用自動酶標儀在450nm波長處測定光密度值(OD450nm值)。結果見表3。
表3 本發明試劑盒的包被抗原濃度和金霉素抗體工作濃度的測定
結果表明，三個參照點為4μg/kg、8000倍，2μg/kg、8000倍，1μg/kg、4000倍。
2.2HRP標記羊抗兔抗體工作濃度的確定(間接競爭法，三因素三水平)以實施例2的步驟2.1確定的包被原濃度和金霉素抗體濃度做為參照，并以商品HRP標記羊抗兔抗體(購自Sigma公司)推薦的工作濃度為參照，設計稀釋倍數為15000、10000、5000三個水平進行試驗。操作步驟查正交設計表，安排9次平行試驗，每次試驗設重復孔10個，另設空白對照孔(只用卵清白蛋白包被)10個。操作步驟根據正交試驗表的試驗組合，從96孔酶標板第1行到第7行依次進行試驗1至試驗7，第8行作為空白對照，另兩排進行試驗8和9。4℃過夜，1％卵清白蛋白37℃封閉1小時，洗滌2次，拍干，加金霉素標準液，濃度分別為0、0.1、1、10、100、1000μg/kg，每孔50μl，按設計表加入不同稀釋倍數的金霉素抗體，37℃孵育1小時。洗滌3次，每次2分鐘，拍干，按設計表加入不同稀釋倍數的HRP標記羊抗兔抗體，每孔100μl，37℃孵育30min。洗滌5次，每次2分鐘，拍干，各孔加入109μl底物液和顯色液的等比混合液，避光顯色15分鐘，加入50μl終止液，2分鐘后用自動酶標儀在450nm波長處測定光密度值(OD450nm值)。結果見表4。
表4 本發明試劑盒的HRP標記羊抗兔抗體工作濃度正交試驗測定
結果表明，試驗7號和8號的檢測限最低且OD450nm值適中，由此可確定HRP標記羊抗兔抗體最佳工作濃度為10000～15000倍稀釋，最佳包被濃度為1μg/kg，金霉素抗體最佳工作濃度為8000～10000倍稀釋。
2.3最佳競爭反應時間的確定以2.2試驗結果做參考。以1μg/kg濃度的包被原包被酶標板三塊，4℃過夜，1％卵清白蛋白37℃封閉1小時，洗滌2次，拍干，第1至6行加金霉素標準液，濃度分別為0、0.1、1、10、100、1000μg/kg，每個濃度重復10次，每孔50μl，各孔加入稀釋10000倍的金霉素抗體，孵育時間分別為30、60、90分鐘。洗滌3次，每次2分鐘，拍干，加入稀釋10000倍的HRP羊抗兔抗體，每孔100μl，37℃孵育30min。洗滌5次，每次2分鐘，拍干，各孔加入100μl底物液和顯色液的等比混合液，避光顯色15分鐘，加入50μl終止液，2分鐘后測OD450nm。結果見表5。
表5 本發明試劑盒的競爭反應時間試驗
結果表明最佳競爭反應時間為60分鐘。
2.4金霉素競爭反應體積的確定以2.3試驗結果作為參照，設金霉素標準品與金霉素抗體的比例為20∶80，40∶60，50∶50。操作步驟同2.3。結果見表6。
表6 本發明試劑盒金霉素競爭反應體積測定(金霉素∶金霉素抗體)
結果表明金霉素最佳競爭反應體積比為50μl∶50μl。
2.5HRP羊抗兔抗體反應時間的確定參考2.2、2.3、2.4步驟的結果，設HRP羊抗兔抗體孵育時間為15、30、60分鐘。其他操作步驟同2.3，結果見表7。
表7 本發明試劑盒HRP標記羊抗兔抗體反應時間試驗
結果表明HRP羊抗兔抗體最佳反應時間為30分鐘。
2.6顯色時間的確定參考步驟2.2、2.3、2.4、2.5的結果，考察5、10、15分鐘三個顯色時間。其他操作步驟同2.3，結果見表8。
表8 本發明試劑盒底物反應時間測定
結果表明底物系統的最佳反應時間為10～15分鐘。
2.7最低檢測限測定及線性范圍本發明用不含金霉素標準品的孔即“零”標準孔的(96孔酶標板或48孔酶標板)光密度值來確定最低檢測限。測定10個“零”標準孔，求出光密度值的平均數，再減去三倍標準差，從標準曲線上查出對應的濃度，即最低檢測限。標準曲線繪制方法另取10個孔每兩孔分別加入濃度為0.1、1、10、100、1000μg/kg的金霉素標準品，每孔50μl。每個孔另加金霉素抗體工作液50μl，溫育1h，洗滌三次，加HRP標記的羊抗兔抗抗體工作液，以下步驟同實施例2.3的檢測程序。抑制率按實施例6.2的公式計算。以金霉素濃度(μg/kg)的對數值為X軸，抑制率為Y軸，在坐標紙上繪制標準曲線圖。結果見表9和表10。
表9 不含金霉素標準品的酶標孔光密度值測定結果
X-3SD＝1.22，標準曲線相應吸光度值的濃度為0.59μg/kg。見表10。
表10 本發明試劑盒的最低檢測限測定結果
結果表明最低檢測濃度為0.59μg/kg。線性范圍0.6～1000μg/kg。
實施例3本發明準確度和精密度試驗3.1現以豬肌肉為例說明肉組織樣品處理方法和結果(同樣的試驗可采用雞或鴨或牛、或羊等動物肌肉組織)。
將濃度為100μg/kg的金霉素標準品添加入待測的豬肌肉組織中，另設不含金霉素的豬肌肉組織作為空白作對照，每個濃度各重復5次。操作步驟每個試樣稱取5克經過勻漿的豬肌肉組織，按照前述方法和劑量制備待測樣品和空白樣品，然后加5毫升pH4.0 Mcllvain緩沖液，震搖均勻，4℃、4000轉/分鐘離心，取上清，加入20％三氯乙酸0.3ml，搖勻后再離心，4℃、8000轉/分鐘，取上清，10倍稀釋后調pH值至7.4(加1N NaOH約100微升即可)，取50微升檢測、步驟同實施例6.2，結果見表11。
表11 本發明試劑盒對豬肌肉回收率測定結果
肌肉空白樣品測定值應在0.59μg/kg以下，100μg/kg組織樣品的測定值應在9.4μg/kg左右。乘以稀釋系數10，其測定值應分別為5.9μg/kg以下和94μg/kg左右。
3.2以雞蛋為例說明蛋樣品處理的方法和結果。
將濃度為200μg/kg的金霉素標準品添加入待測的蛋清中，另設不含金霉素的蛋清作為空白作對照，每個濃度各重復5次。操作步驟每個試樣吸取5ml蛋清，按照前述方法和劑量制備待測樣品和空白樣品，然后4℃、4000轉/分鐘離心，取上清，加入0.3毫升20％三氯乙酸，搖勻后再離心，4℃、8000轉/分鐘，取上清，10倍稀釋后調pH值至7.4，取50微升檢測、步驟同實施例6.2。結果見表12。
表12 本發明試劑盒對雞蛋回收率測定結果
結果表明空白樣品測定值為0μg/kg，100μg/kg組織樣品的測定值為9.0μg/kg。乘以稀釋系數10，其測定值分別為0和90μg/kg。
3.3以牛奶為例說明奶組織樣品預處理的方法和結果。
將濃度為100μg/kg的金霉素標準品添加入待測的牛奶中，空白作對照，每個濃度各重復5次。操作步驟每個試樣吸取5ml牛奶，按照前述方法和劑量制備待測樣品和空白樣品，然后4℃、4000轉/分鐘離心，取上清，加入0.3毫升20％三氯乙酸，搖勻后再離心，4℃、8000轉/分鐘，取上清，10倍稀釋后調pH值至7.4，取50微升檢測、步驟同實施例6.2。結果見表13。
表13 本發明試劑盒對牛奶回收率測定結果
結果表明空白樣品測定值為0μg/kg，100μg/kg組織樣品的測定值為9.4μg/kg左右。乘以稀釋系數10，其測定值分別為0μg/kg和94μg/kg。
實施例4穩定性考核4.1方法穩定性考核每批5塊酶標板，三天一批，共進行5批試驗。方法取包被、封閉好的96孔酶標板，其中12孔每兩孔分別加入0、0.1、1、10、100、1000μg/kg金霉素標準溶液，每孔50μl。另取10孔加入100μg/kg的標準溶液50μl。各孔加入金霉素抗體50μl/孔，以下步驟同實施例6.2。從標準曲線中查出空白組織樣品和100μg/kg組織樣品的測定濃度，計算其平均值、標準差和變異系數。結果見表14、15、16。
表14 本發明試劑盒酶標板內變異系數測定結果
表15 本發明試劑盒酶標板間(批內)變異系數測定結果
表16 本發明試劑盒不同批次之間的變異系數測定結果
結果表明板內變異系數不大于10％(n＝10)。板間(批內)變異系數不大于15％(n＝5)，批間變異系數不大于20％(n＝5)。
4.2發明試劑盒穩定性考核4.2.1條件化酶標板(包被金霉素卵清白蛋白復合物的酶標板)的穩定性試驗設計溫度20℃、4℃設計時間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月保存方法真空干燥(在凍干機中凍干，并貯存在4℃的冰箱內或20℃室溫中)考核指標光密度值OD操作步驟同實施例6.2。結果見表17。
表17 本發明試劑盒酶標板穩定性測試結果
結果表明，條件化酶標板可以在4℃條件下較長時間貯藏。
4.2.2底物顯色系統(底物液和顯色液的等比混合液)穩定性試驗設計溫度4℃、20℃設計時間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月考核指標光密度值OD操作步驟同實施例2.7的檢測程序。結果見表18。
表18 本發明試劑盒中底物顯色系統穩定性測定
結果表明，底物顯色系統在4℃條件下較穩定。
實施例5發明試劑盒的實用性和定量檢測效果考核5.1實際樣品的制備15千克左右的仔豬12頭，隨機分為4組，每組3頭。第一、二、三組飼喂含金霉素的飼料，連續飼喂7天，其中第一組停藥后0天宰殺，第二組停藥后2天宰殺，第三組停藥后4天宰殺。第四組飼喂不含金霉素的飼料，分別于停藥后0、2、4天各宰殺一頭，做為空白對照。飼料中金霉素濃度為100毫克/千克。檢測組織為肌肉、肝臟和腎臟。
5.2實際樣品的檢測檢測步驟同2.7和4.1所述方法。其結果見表19～22。
表19 本發明試劑盒與HPLC方法的比較(第一組試驗單位ppb)
表20 本發明試劑盒與HPLC方法的比較(第二組試驗單位ppb)
表21 本發明試劑盒與HPLC方法的比較(第三組試驗 單位ppb)
表22 本發明試劑盒與HPLC方法的比較(空白對照組單位ppb)
由以上結果可見，發明試劑盒可檢出實際樣品中高、中、低各種濃度的金霉素殘留量，檢測結果與金霉素的代謝規律一致，且與高效液相色譜儀(HPLC)檢測結果相符合，表明發明試劑盒具有實用性并能夠定量檢測。
實施例6試劑盒的組裝及檢測方法的應用6.1試劑盒子的組裝本發明試劑盒主要構造(1)盒體、(2)酶標板、(3)6瓶金霉素系列濃度標準品、(4)辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔抗體、(5)金霉素抗體溶液、(6)底物顯色A液、(7)底物顯色B液、(8)終止液、(9)濃縮洗滌液、(10)樣品稀釋液、(11)泡沫托架。泡沫托架上制有凹孔，試劑瓶(3)～(10)安放在泡沫托架的凹孔內，泡沫托架和酶標板安放在盒體內。
其中所述酶標板由96孔或48孔聚苯乙烯塑料支架和可拆分的塑料條組成，，包被原為金霉素與卵清蛋白偶聯物。所述金霉素系列濃度標準品為鹽酸金霉素溶液。所述金霉素抗體濃縮液為金霉素特異性多克隆抗體。所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲。所述顯色液B液為四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)。所述終止液為硫酸溶液或鹽酸溶液。所述濃縮洗滌液為含有0.1％吐溫-20磷酸鹽緩沖液；所述樣品稀釋溶液為pH7.4磷酸鹽緩沖液。
6.2試劑盒及其檢測方法的應用根據2.1～2.6的測定結果，試劑盒應用方法如下(1)選12個孔分別按0、0.1、1、10、100、1000μg/kg的濃度加入金霉素標準液，每孔50μl；另選適當數目的孔加待檢樣品，每孔50μl；另加金霉素抗體50μl；37℃孵育1小時；(2)洗滌3次，每次2分鐘；(3)加HRP羊抗兔抗體，每孔100μl，37℃孵育30min；(4)洗滌5次，每次2分鐘；(5)將底物等量混合后加入酶標板，每孔100μl，顯色15min；(6)加終止液50μl/孔；(7)測光密度值(OD450nm)；(8)結果判定定性檢測時，用樣品的光密度值和金霉素標準品的光密度值相比較，如果樣品的光密度值高于金霉素標準品的光密度值時為陰性，反之為陽性。定量檢測時，以金霉素標準品濃度的對數值為橫坐標、以金霉素標準品光密度值(OD450nm)百分抑制率為縱坐標作圖得到標準曲線。根據標準曲線即可查出待檢樣品中金霉素的對應濃度。
計算公式
權利要求
1一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫吸附檢測試劑盒，它包括盒體、設在盒體內的酶標板、設在盒體內的試劑，其中的試劑包含洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標記羊抗兔抗體、底物液、顯色液和終止液，其特征在于，在酶標板的每孔內有包被液包被的能與金霉素抗體特異性反應的包被抗原、金霉素標準溶液和金霉素抗體，所說的金霉素抗體是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
2.根據權利要求1所述的一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫吸附檢測試劑盒，其特征在于，所說的包被抗原為金霉素乙酸和卵清白蛋白的復合物。
3.根據權利要求1所述的一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫吸附檢測試劑盒，其特征在于，所說的人工免疫原是由金霉素乙酸與牛血清白蛋白的復合物。
4.應用權利要求1-3所述的一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫吸附檢測試劑盒的方法，其中的樣品處理步驟包括勻漿、提取、離心、去蛋白、再離心、檢測，其特征在于，樣品處理步驟中減少了過柱凈化步驟。
5.權利要求1所述的試劑盒在金霉素殘留分析中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種適用于金霉素殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒及其應用。本發明所提供的試劑盒包括盒體，設在盒體內的酶標板和試劑，其中的試劑包含洗滌液、樣品稀釋液、辣根過氧化酶標記羊抗兔抗體、底物液、顯色液和終止液。本發明的核心在于有包被液包被的能與金霉素抗體特異性反應的包被抗原，金霉素標準溶液和金霉素抗體，該抗體是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。包被抗原為金霉素乙酸和卵清白蛋白的復合物。人工免疫原是由金霉素乙酸與牛血清白蛋白的復合物。本發明的試劑盒特異性強、靈敏度高。
文檔編號G01N33/531GK1811435SQ20051008634
公開日2006年8月2日 申請日期2005年9月2日 優先權日2005年9月2日
發明者袁宗輝, 趙春保, 王玉蓮, 常超, 陳冬梅, 陶燕飛, 彭大鵬, 王帥兵 申請人:華中農業大學