專利名稱：生物樣本成分檢測法以及其裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種正確檢測熒光標記生物樣本的的方法，特別是不會出現因意外雜質等引起的錯誤結果的方法，此外，涉及一種正確地測量擴增DNA等時的樣本溶液的熒光的方法以及用于此方法的裝置。
背景技術：
DNA、蛋白質等的分析技術在包括基因分析、基因診斷等醫學、生物學領域十分重要。特別是最近，使用DNA微陣(或者稱為DNA芯片等)、蛋白芯片等，進行檢查分析的方法以及裝置十分引人注目。微陣使用玻璃等基板，將其劃分成多個(數百～數千萬個)區域，在各個區域固定目標(通常，種類不同)DNA等的探針，使各個區域成為微小的反應區域。通過使檢測體與其反應，檢測體中的目標DNA、蛋白等與上述固定的探針結合并被捕捉，被定量測量。對于該DNA微陣的各個反應區域內所捕捉的目標DNA的熒光標識所發出的熒光強度的讀取，使用通常被稱為掃描器的顯微鏡(共聚焦熒光顯微鏡)這樣的裝置(例如，參照特開2002-310886號公報)。該裝置將激光等激發光照射在陣列上，使用干涉濾光器等分光元件將產生的熒光與激發光分離，并由光檢測器檢測熒光強度，定量·定性比較捕捉的DNA、蛋白等。
就DNA等靶標核酸的檢測·定量而言，已知除微陣之外，也使用微板、微管等，在擴增同時進行實時熒光檢測(參照特開2002-189860號公報)。
在使用微陣進行熒光檢測中，雜質的附著成為大問題。因為附著有雜質的部分的熒光強度不是正確的值，所以需要將其從測定值中刪除。通常，微陣的點的大小為直徑100微米左右，因為雜質的大小多小于等于數微米，所以通過在點內即使存在1個雜質也只將此部分的信號刪除，能夠根據剩余區域的熒光強度進行該點的熒光檢測。微陣向更高密度化的方向發展，正在變得比點的直徑還小。但是，當點變小時，其與雜質的大小的差異消失，以上述手段進行測定變得困難。關于基板的瑕疵也相同。
特開2002-310886號公報公開了并用來自樣本的熒光和激發光的反射光測定樣本性狀的方法。
一般也采取使用容器一邊進行擴增，一邊進行熒光檢測的方法。通常，將微板、微管等作為反應容器兼檢測容器。此外WO03/059484號公報記述了在能夠旋轉的彈藥筒狀結構體中，具備捕捉血液等樣本液中的DNA、病毒RNA等的捕捉部和將各種試劑分別保存的試劑保存部，以及通過由旋轉產生的離心力進行試劑液輸送的提取檢測模塊(以下，記為離心模塊)。本模塊為如果安置了血液等樣本，能夠在模塊內進行全部反應以及檢測，而對外部污染的可能性非常小的有效的裝置。
但是，無論在上述哪個文獻中都沒有顯示判斷樣本產生的熒光是否是在純粹正常的狀態下檢測的。
發明內容
檢測工序也在與反應相同的容器中進行的方法簡單。很多情況，樣本液中應該檢測的目標成分(DNA、病毒RNA等)是微量的，在從樣本液提取目標成分后，通常，使用PCR法或者恒溫擴增法等方法擴增，通過熒光檢測進行測定。提取后，在進行擴增反應時無論使用哪種方法都需要加熱反應液。此時，因為由反應液的蒸發等引起的反應液的減少、因結露引起的水滴的形成，可能會對熒光測定給予不正確的結果。此外，由于不使用閥門而是通過離心力進行試劑液的輸送，所以也可以想到，因液體的狀態、模塊的狀態而無法將液體保存在規定的位置的情況。該情況需要正確地判定測定樣本液的有無以及量和狀態。
本發明的目的為提供解決上述問題，在雜質等附著，樣本液減少、消失等異常狀態時識別異常，不對目標樣本的定量結果產生影響，且精度高的生物樣本成分檢測方法。
為解決上述課題，本發明提供以下的生物樣本成分檢測方法以及生物樣本檢測裝置。
首先，本發明提供一種生物樣本成分檢測方法，其是在光檢測區域捕捉生物樣本成分，檢測來自該光檢測區域的熒光，定量測定該目標生物樣本成分的生物樣本成分檢測方法，其特征在于，以用熒光體標識該生物樣本成分以及實質上與該生物樣本成分相同的成分，并將用于激發該熒光體的激發光照射在光檢測區域，將從光檢測區域發出的光至少分離為多個波段檢測，該多個波段中的一個波段實質上是與激發光成分相同的波段，將與激發光成分相同的波段與預先確定的規定的強度范圍進行比較，當為超過該強度范圍的強度時，判定該光檢測區域的熒光測定是否恰當。
而且，提供在上述生物樣本成分檢測方法中，以上述光檢測區域實質上為在平面狀的基板上形成的反應區域為特征的生物樣本成分檢測方法。此外，提供在上述生物樣本成分檢測方法中，以在該光檢測區域內，進行擴增反應后或者在進行擴增反應的同時連續進行光檢測為特征的生物樣本成分檢測方法。而且，提供在上述生物樣本成分檢測方法中，以將生物樣本負載于DNA芯片、DNA微陣以及蛋白芯片的任意一種為特征的生物樣本成分檢測方法。而且，提供在上述生物樣本成分檢測方法中，以將生物樣本負載在微孔板的孔中為特征的生物樣本成分檢測方法。
本發明提供的生物樣本成分檢測裝置，其特征在于，具備配置在旋轉圓盤上的光檢測區域；將多種液體分別保存的多個試劑保存部；具有能夠通過離心力使該液體移動的具有流路的彈藥筒(カ一トリツジ)狀結構體；檢測該液體發出的熒光以及從其周邊發出的散射光的光測定部；和根據該光測定部的信號判定該光檢測區域的熒光測定是否恰當的裝置。
通過熒光檢測測定目標生物樣本成分。在熒光檢測中具備將用于激發熒光體的激發光照射在微陣(DNA，蛋白)或者微板、微管、離心模塊的規定的光檢測部的裝置，和將從光檢測區域發出的光至少分離為多個波段檢測的單元，該多個波段中的一個波段實質上是與激發光成分相同的波段，檢測激發光成分的光強度，與預先確定的規定的強度(閾值)進行比較。預先已確定的規定的強度是以樣本容器以及樣本液正常時的激發光成分的光強度測定的結果為基礎乘以安全系數而設定的值，是通常不超過的值。
測定強度為超過閾值的強度時，則判定該光檢測區域的熒光測定不恰當。此外，在上述光檢測區域，可以在進行擴增反應之后測定，也可以一邊進行擴增反應，一邊進行實時熒光檢測，進行上述判定。擴增反應的各種方式都能夠適用。優選的是在恒溫下進行的方式，其簡單，容易實施。
作為本發明其他實施方式的生物樣本分析裝置，其特征在于，具備能夠控制旋轉的旋轉圓盤；配置在該旋轉圓盤上的光檢測區域；配置在旋轉圓盤上的保存試劑的試劑保存部；配置在該旋轉圓盤上的通過離心力能夠將上述試劑向上述光檢測區域移動的流路；檢測從該光檢測區域發出的光的光測定部；和根據該光測定部的信號顯示該光檢測區域中的上述樣本的狀態的顯示裝置。
此外，上述顯示裝置在上述光檢測裝置中有結露產生時，能夠顯示樣本的測定狀態為異常狀態的意旨。而且，上述顯示裝置在上述光檢測裝置中樣本比規定值減少時，也能夠顯示樣本的測定狀態為異常狀態的意旨。此外，上述顯示裝置在上述光檢測裝置中樣本偏心時，能夠顯示樣本的測定狀態為異常狀態的意旨。
本發明通過在熒光測定側檢測激發波長成分的強度，能夠判定樣本的異常，能夠進行高精度的熒光檢測。
圖1a是表示在本發明使用的分析裝置的離心圓盤的結構的立體圖。
圖1b是表示設置在圖1a圓盤上的離心模塊的結構的平面圖。
圖2a是使用了實施方式1的生物樣本成分檢測法的分析裝置的外觀立體圖。
圖2b是圖2a的分析裝置的側剖圖。
圖3是圖2a，圖2b的分析裝置的控制框圖。
圖4表示光學檢測系統的例子的部分剖面概略圖。
圖5是實施方式1的向離心模塊的光照射狀態的放大圖。
圖6是表示實施方式1的熒光測定的切換濾光器的特性的圖。
圖7是實施方式1的分析裝置的分析操作順序圖。
圖8是實施方式1的熒光檢測工序順序圖。
圖9是說明實施方式1的使用離心模塊的試劑液等的移動工序的流程圖。
圖10a是表示實施方式1的正常情況的光檢測結果的圖。
圖10b是表示實施方式1的測定值異常時的光檢測結果的示例圖。
圖10c是表示實施方式1的測定值為其他異常時的光檢測結果的示例圖。
圖11是實施方式2的光學檢測部的結構圖。
圖12是實施方式2的檢測工序流程圖。
圖13是實施方式3的光學檢測部的結構圖。
圖14是實施方式3的光檢測部件的構成圖。
圖15是實施方式3的另外一個例子使用的光檢測部件的圖。
圖16是實施方式4的光學測部的構成圖。
圖17是實施方式4的光檢測部件的構成圖。
圖18是表示實施方式4的光檢測結果的示例圖。
圖19是實施方式5的熒光測定裝置的結構圖。
圖20是實施方式5的熒光測定裝置的其他的主要部位的結構圖。
圖21是實施方式1的測定顯示畫面的例子。
圖22是實施方式6的光學檢測部的概略結構圖。
圖23是實施方式6的光學部件以及檢測部件的結構圖。
具體實施例方式
實施例1首先，對在本發明中使用的離心模塊的操作進行說明。在圖1a以及圖1b中表示在本發明中使用的離心型化學分析模塊的重點結構。圖1b表示具有規定的分析流路結構的組合模中的一個組合模或者離心模塊13中的一個離心模塊，在實際分析時，將多個圖1所示的模塊13例如4至12個通過嵌合設置在圖1a所示的托盤12上。離心模塊13，例如為PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)制。離心模塊13可以是一次性的。
圖1b中，將各種試劑保存在微型容器207、208、209、210、211中，其上面用樹脂薄膜封閉。操作人員將全血分注在全血容器200中，在使圓盤旋轉時由于離心力全血移動到外周側，根據密度差分離為血球成分201和血漿成分202。
毛細管203從保存血漿成分的容器202分支出來，暫時形成返回內周側的結構。因此，血漿無法超過毛細管。
停止旋轉時，由于毛細流動血漿完全注滿毛細管203。再次使圓盤轉動時，血漿從毛細管流出。因為毛細管的出口較之入口(從血漿容器分支的部分)位于外周，所以通過虹吸效果毛細管的血漿全部流出。此時，當在第1試劑容器207的封閉薄膜上開通氣孔時，試劑從容器207流出與血漿混合。可以在打算供給試劑的時刻，在使圓盤旋轉之前的即刻開通氣孔。
第1試劑與血漿充分反應后停止圓盤旋轉，并在第2試劑容器208的薄膜上開孔。再次使圓盤旋轉，試劑流入反應容器將反應容器內的液體趕出，經由結合過濾器204流入回收容器205。結合過濾器204由玻璃纖維構成，核酸被捕捉在玻璃表面。進而，使第3、第4試劑從容器208、209流出，洗凈附著在玻璃纖維上的核酸。通過結合過濾器204的液體流入回收容器205，從回收容器下游的虹吸管流出。將包含核酸的洗提液保存在回收容器205中。將使用過的試劑、洗凈液從回收容器送入廢棄液容器206中。
圖2a中表示使用本發明的生物樣本成分檢測法的分析裝置的整體圖。圖2a為外觀立體圖，圖2b為其側剖圖，圖3為其控制方框圖。分析裝置10具備離心用發動機11；托盤12，其通過發動機11維持在可旋轉狀態；和離心模塊13，其被定位于托盤12內部并被保持，通過離心發動機11的旋轉能夠在托盤12的內部進行提取·反應。此外，具有圓盤壓蓋14，旋轉時其用于穩定地保持離心模塊13；圓盤定位用檢測器15，用于正確地控制離心模塊13的位置，即托盤12的旋轉位置；和穿孔部件16，配置了用于控制離心模塊13內的液體輸送的穿孔針。而且，具備用于光檢測的光學檢測光照射·受光部17和光學檢測部件18，以及進行數據的分析顯示等的控制器PC19。此外，還需要托盤內的位置確定用指示器、用于托盤12溫度調節的加熱器等溫調部件、控制電路和電源電路等，但在圖2a，圖2b內省略。
根據圖3中表示的控制方框圖，圖2a、圖2b的裝置。首先，通過在控制器PC301中輸入測定條件，分析開始，根據分析裝置10內的控制CPU302進行各種控制。在控制部中有發動機控制部303、光檢測控制部306、穿孔控制部305和溫度控制部304。發動機控制部303控制發動機、轉速傳感器、定位傳感器和異常檢測傳感器(發動機溫度、轉速異常等)，根據CPU302的指示使發動機以指定的轉速、加速·減速時間旋轉，通過離心力進行離心模塊13內液體的輸送。
圖3中的穿孔控制部305控制用于推出收納在穿孔部件16內的多個穿孔針的發動機。通過推出指定位置的針，在離心模塊13內指定的試劑口的樹脂薄膜上開孔，通過離心力輸送該試劑液。此外，在該動作之前需要通過發動機控制部確定托盤12、離心模塊13的位置，在該位置確定后進行上述操作。
溫度控制部304調節離心模塊13或者托盤12的溫度，通過眾所周知的方法控制緊貼離心模塊的加熱器4和溫度傳感器(沒有圖示)、設置在收納托盤12的旋轉槽內的加熱器以及冷卻器和溫度傳感器。光檢測控制部控制光源、光檢測器、濾光器切換用發動機、濾光器識別傳感器、遮蔽用光閥和異常檢測用傳感器(光源燈關閉等)數據輸送部，測定發光強度。
圖4是光學檢測部的整體結構圖。圖5是向離心模塊進行照射的光照射部的放大圖。在圖4中表示了離心模塊的光檢測區域3(提取/測定瓶)、光學檢測光照射接收光部17和光學檢測部件18的一部分(離心模塊參照WO03/059484號公報)。在圖5中，離心模塊13的光檢測區域3(提取/測定瓶)下部用透明的凹狀材料覆蓋，上部用透明薄膜2覆蓋，形成適當容量空間，而成為光測定用小室的結構。在該空間中保存測定試劑液5進行光檢測。在測定試劑液5中，例如混合有提取的RNA與用于擴增檢測的試劑。
用于擴增的試劑，使用眾所周知的NASBA法的全套試劑。用于檢測的探針，使用眾所周知的在寡聚核苷酸上結合熒光報告色素與熒光淬滅色素，被調整為通過雜交產生熒光發光的探針。在此狀態，通過外部加熱器4調節，使反應液為41℃，進行熒光測定。即使不同的擴增法也能夠同樣地執行。此時，試劑的種類、溫度等依據各種擴增法設定。
光學檢測光照射接收光部17設置在離心模塊的近旁，接收向離心模塊的照射的光與熒光等，光學部件18包含除此之外的光源、分光、光檢測等，進行目標光強度的測定，兩者由光纖連接。將激光源或者水銀燈等激發光源20的光通過透鏡21、激發光照明用單色化濾光器22、分色鏡部件23和物鏡25導入光纖26(NA＝0.22，芯徑400μm)。光纖26的另一端設置在光學檢測光照射接收光部17上，通過透鏡28將光聚集在光檢測區域(提取/測定瓶)3。將透鏡28、光纖26位置可調地固定在托架27上，此外，托架整體具有XYZ移動功能，使其能夠向光檢測區域(提取/測定瓶)3的位置正確地進行光照射。
由光檢測區域(提取/測定瓶)3內的測定樣本液5產生的熒光(包含散射光、反射光等)通過透鏡28進行聚光，并經由光纖26導入光學檢測部件18。
熒光等再次由物鏡25進行分光，由分色鏡模塊23、熒光測定用切換濾光器24篩選需要的光成分，通過透鏡29進行聚光，由檢測器進行檢測。此次，作為檢測器使用分光器30和CCD線形傳感器(line sensor)31。計量每個波長分割的光強度，將該數據經由控制部件32發送給控制器PC19進行處理。
圖6是熒光測定用切換濾光器6的一個例子。通常，一般使熒光測定用切換濾光器為具有盡可能不透過激發光那樣特性的濾光器，(例如激發波長透過率小于等于0.0001％，熒光波段透過率大于等于80％)。在圖4、圖5中，通過線形傳感器同時進行分光，檢測激發波長成分與熒光波長成分。因此，如圖6，為透過一部分激發光成分，使激發波長透過率為0.1％左右，熒光波段透過率為大于等于80％的特性。一般從熒光體發出的熒光強度(因為熒光體濃度低于1nM左右)非常弱，散射光強度與其相比十分大，所以在此種狀態下強度比大無法由同一檢測器進行測定。此外，現有的濾光器將散射光成分濾掉，無法監視散射光強度。因此，希望使用如同現有濾光器6那樣的濾光器進行設定，以使應該觀測的熒光的強度與標準的散射光強度為大體相同的強度等級。
圖7為分析裝置的操作順序的流程圖。基本上通過與專利文獻1相同的方法進行。首先，在離心模塊的規定位置注入檢測體，安裝在托盤上。以規定的轉速、旋轉時間旋轉·停止圓盤，分離血漿。其后，通過按規定的順序分別導入需要的試劑(包含洗凈液)，提取病毒RNA等目標成分。為了將1號試劑導入1號模塊，通過發動機使托盤旋轉，調整1號模塊的位置，在1號試劑的位置將封裝薄膜穿孔。將該操作分模塊進行。
其后，以規定的轉速、旋轉時間旋轉·停止圓盤，使1號試劑移動并混合。通過進行與需要的試劑數相等次數的此操作，在光檢測區域(提取/測定瓶)提取目標成分。其后，以同樣的操作注入并混合擴增用試劑1(初始劑)，轉移到擴增檢測工序。首先，將光檢測區域(提取/測定瓶)部加熱到65℃，然后進行冷卻降到小于等于40℃。定位，并將擴增用試劑2(酶液)儲藏部的薄膜穿孔，該操作分模塊進行。以規定的轉速、旋轉時間旋轉·停止圓盤，混合酶液等，通過加熱到41℃并維持此溫度，引起擴增反應。在熒光檢測工序中測定此擴增狀態。
圖8為分析裝置的檢測工序順序的流程圖。按指定的光計量時間間隔t1反復進行測定，測定經過的時間。設總的測定時間為t0。通常t0設定為60分至90分左右，t1設定為0.5分左右。調整1號模塊的位置，測定熒光。在本實施方式中，假設2種作為熒光檢測對象的熒光體(例如FAM、ROX)，表示激發波長分別為2種(例如，480nm和590nm)的情況。通過濾光器BOX切換器33切換為BOX-A34a和BOX-B34b。
BOX-A34a和BOX-B34b各自具備激發光照明用單色光化濾光器22a以及22b，分色鏡模塊23a以及23b，和熒光測定用切換濾光器24a以及24b，能夠以不同的激發波長進行熒光測定。因此，通過濾光器BOX切換器33切換為BOX-A34a進行光檢測，然后切換為BOX-B34b進行光檢測。這些操作分模塊進行。以t1時間間隔，總共持續t0時間的該動作。
圖9是使用圖1b中表示的一個離心模塊，說明試劑液的移動狀態的圖。說明擴增工序中的液體移動·反映狀態。該圖只圖示了說明部分，其他的部分則被省略。在光檢測區域(提取/測定瓶)部，通過提取工序正在提取目標成分。此外，試劑A，試劑B瓶中分別封裝有擴增反應檢測用試劑(圖9(a))。使用穿孔部件在試劑A的封裝薄膜上開孔(圖9(b))。通過旋轉，由于離心力試劑A內的試劑移動到光檢測區域(提取/測定瓶)部，并被混合(圖9(d))。將光檢測區域(提取/測定瓶)部加熱到65℃，保持5分鐘然后冷卻到小于等于40℃。
通過穿孔部件在試劑B的薄膜上開孔。通過旋轉，由于離心力試劑B內的試劑移動到光檢測區域(提取/測定瓶)部，并被混合(圖9(i))。通過將光檢測區域(提取/測定瓶)部加熱到41℃并維持在該溫度，能夠引起擴增反應。
圖10a，圖10b以及圖10c是通過以上的操作得到的光檢測結果的例子。熒光報告色素使用FAM寡聚核苷酸。使用通透470～490nm的濾光器作為激發光的單色化濾光器，使用特別定制的濾光器(也可以由GG495色玻璃濾光器代替)作為熒光測定用切換濾光器。利用CCD線形傳感器31能夠檢測350～700nm的光，但是在本實施方式中取用470～490nm帶(激發光波長成分)的強度以及530～540nm帶(熒光體熒光波長成分)的強度作為數據。
圖10a(a)表示維持在41℃之后，每0.5分鐘得到的信號強度的測定結果的圖。按經過時間的順序，依(離心模塊號，檢測波長，經過時間(每0.5分鐘的次數))＝(1，1，0)，(1，2，0)，(2，1，0)，(2，2，0)，…，(5，1，1)，(5，2，1)，(6，1，1)，(6，2，1)，….的序號得到檢測信號強度。
圖10a(b)是只提取任意離心模塊的信號的圖，表示時間變化。I(λ11，λ12，t)表示熒光波長成分的強度，I(λ11，λ11，t)表示激發光波長成分的強度。圖10b(a)是正常檢測時的變化，隨著時間的推移擴增反應開始，熒光增大。此時，激發光波長成分的強度幾乎沒有變化，也無超過閾值的情況。大約進行10次正常狀態下的激發光波長成分的強度檢測，將它們的平均值±6σ作為閾值。因為該值根據測定系統會有所變動，所以在改變條件時需要預先確定該值。
圖10b(a)，(b)，(c)表示測定值異常時的光檢測結果的經時變化。圖10b(a)與通過加熱試劑液而產生如同在圖10b(b)的右側表示的現象，并在容器內部或者容器壁產生氣泡時的效果相當，或者與成為散射體的灰塵進入容器時的效果相當。熒光波長成分沒有什么變化，但是激發光波長成分的強度處于波動，處于超過閾值的狀態。圖10b(b)是氣泡等散射體變得極多的情況，熒光波長成分也異常地變化。圖10b(c)為另外一個異常例。如同在圖10b(c)右側所示，為光檢測區域(提取/測定瓶)部內的測定溶液的局部存在狀態已經變化時的1個變化例。
如此，能夠根據激發光波長成分的強度探測測定溶液中的散射體的形成。這些反應，反應本身無論哪個都相同，為原有的結果相同的反應，但是像以前那樣，在只測定目標熒光體的波長成分時，如圖10b(a)、(b)、(c)的I(λ11，λ12，t)圖所示，有時得到強度即核酸濃度不相同的結果。通過同時監視激發光波長成分的強度，能夠探測反應液的異常，防止出現錯誤的結果，和提高檢測精度。
此外，形成水滴時，反應液體量減少，而引起反應試劑濃度上升。此時，這有可能成為阻礙擴增反應的重要因素。在本例中，也可以探測這樣的異常。此外，即使在離心模塊裝置中存在變形，瑕疵等不好的狀況時，由于因瑕疵而激發光波長成分的強度變大，因而能夠同樣地進行探測。
本例使用的探針為1種，但即使是多種探針也能夠同樣地實現。特別在激發波長為1種，目標熒光體為多個時，能夠通過幾乎相同的結構實現。在圖10c(a)中為其他的異常例。散射光強度I(λ11，λ11，t)如圖所示處于波動，其影響熒光強度I(λ11，λ12，t)，隨著I(λ11，λ11，t)變大I(λ11，λ12，t)增大。因為I(λ11，λ11，t)對I(λ11，λ12，t)的影響大體一定，所以通過修正該影響，能夠像圖10c(b)那樣只計算除去I(λ11，λ11，t)的影響后的熒光強度的部分，能夠進行正確的測定。
圖21是測定中的控制器PC19的測定畫面的概略圖。是設置6個離心模塊測定后的一個例子。對每個離心模塊劃分窗口，將關于熒光強度變化的光檢測結果的時間波形(與圖10a(b)，圖10b，圖10c(a)相同的波形)以及每個離心模塊的溫度控制狀態等測定結果實時地顯示在(A)區域。(顯示波形的種類由用戶選擇)在各個顯示窗口的下部(B)具有各種信息顯示窗口，顯示模塊號碼、控制溫度和實際溫度等。此外，關于裝置整體的狀態，在其他的窗口顯示經過時間、樣本信息、轉速和步驟數等信息。顯示窗口內的顯示數據除了顯示如圖中的熒光強度結果之外，還能夠切換顯示模塊的溫度經過(控制結果)的歷史等。在如圖10b(a)-(c)所示的結果的情況下，在相應的模塊顯示窗口內顯示表示異常狀態的「測定異常」「試劑液異常」等警告消息。此外，在全部模塊異常時，顯示是中斷測定還是繼續測定的消息窗口，具有由用戶進行判斷的功能。此外，在與圖10c(a)相當的情況下，「執行補正？」的消息盒閃動，催促用戶進行判斷。此外，也將關于裝置全體的信息在(C)區域顯示。
另外，除了畫面顯示之外在用打印機打印結果時，在測定清單的相應試劑行中，追加輸出「試劑液異常」等注釋。在與圖10c(a)相當的情況下，在附加「強度補正完成」的注釋后，輸出基于補正后的強度的結果。
實施例2圖11為使用生物樣本成分檢測法的分析裝置的另外的光學檢測部39的結構圖。熒光檢測的方法與圖4基本相同。作為光檢測器使用光電倍增管40代替分光器和線形傳感器來檢測光強度，用AD轉換器41放大光電倍增管的信號并進行AD轉換，發送給控制部件32。為了用熒光測定用切換濾光器24a以及24b進行熒光分光，該濾光器使用具有通常用于熒光檢測的特性的，具有盡可能不通透激發光之類特性的濾光器。在實施例1中表示的散射光等的檢測，由另外的光學系統進行。如圖所示，其方式為在離心模塊的上部設置發光二級管(LED)42作為光源，用透鏡43聚集該光，用透鏡44聚集散射光等，用光電二極管進行檢測發送給控制部件23。
因為未必需要散射光監測器嚴密地進行位置調整，所以通過從上面直接檢測，能夠得到大范圍的觀測區域，能夠探測大范圍的異常。此外，因為未必需要與激發波長相同，所以能夠容易地設定為容易測定的波長。因為也不需要分光，所以調整簡單，能夠像上述那樣簡便地進行構筑。此外，如果形成通過另外的光學系統進行散射光測定和目標成分的光檢測的結構，不僅僅是熒光，例如也可轉為用光學發光進行測定，應用范圍擴大。
圖12是本實施例中的檢測工序過程的流程圖。相對于實施例1的過程，追加了與LED的光照射相關聯的部分。因為存在2種光學系統，為了各自的光不相互影響，在用光電倍增管進行測定之前追加截斷LED光的工序，在LED測定之前追加截斷來自光源20的光的工序。
實施例3圖13是與使用生物樣本成分檢測法的分析裝置相關的另外的光學檢測部的結構圖。在使用2種熒光體時，設置獨立檢測各自熒光體的光檢測部件。光檢測部件46經由光纖47、透鏡48，照射·檢測某個離心模塊內的光檢測區域(提取/測定瓶)部。另外的光檢測部件49經由光纖50、透鏡51，照射·檢測另外的離心模塊內的光檢測區域(提取/測定瓶)部。圖14、圖15表示光檢測部件46、49的結構圖。光檢測部件46對應熒光體FAM，使用中心波長475nm的藍色LED作為激發光源60。
將LED光經由透鏡61、激發光照明用單色化濾光器62、分色鏡模塊63、和物鏡65導入光纖47(NA＝0.22，芯徑400um)中。由光纖接收到的熒光等再次由物鏡65進行分光，由分色鏡模塊63、熒光測定用切換濾光器64篩選需要的光成分，由透鏡66進行聚光，使用分光器67和CCD線形傳感器68。計量每個波長分割的光強度，將該數據發送給控制部件32。
在光檢測部件49，對應熒光體ROX，使用中心波長550nm的綠色LED作為激發光源70。將LED光經由透鏡71、激發光照明用單色化濾光器72、分色鏡模塊73、和物鏡75導入光纖50(NA＝0.22，芯徑400um)中。由光纖接收到的熒光等再次由物鏡75進行分光，由分色鏡模塊73、熒光測定用切換濾光器74篩選需要的光成分，由透鏡76進行聚光，使用分光器77和CCD線形傳感器78。計量每個波長分割的光強度，將該數據發送給控制部件32。
與實施例1相同地進行散射光的測定。在本例的情況下，在檢測多個熒光體時，能夠減少因切換濾光器而產生的時間損失，能夠進行S/N好的測定。此外，因為不需要切換濾光器，所以能夠進行一邊使離心模塊的托盤12以一定的速度旋轉，一邊在返回到規定的位置時進行光檢測的連續測定，與反復進行旋轉和停止的方式相比，操作容易，能夠進行機械性穩定的測定。
實施例4對不通過光的散射，而是通過光的吸收測定溶液狀態的方式進行說明。在擴增反應檢測用的試劑中添加與熒光標識不同的，對熒光檢測沒有影響的色素溶液，與上述相同地執行擴增反應并進行測定。圖16為使用生物樣本成分檢測法的分析裝置的另外的光學檢測部的結構圖。是使用1種熒光體時的結構圖。光檢測部件39使用與實施例2相同結構的光檢測部件。
經由光纖26、透鏡28，照射某個離心模塊13內的光檢測區域(提取/測定瓶)部，與實施例2相同地進行熒光檢測。而且，準備另外的光源部件80，透鏡82、光纖83和光檢測部件84，獲得在另外的位置的離心模塊內的光檢測區域(提取/測定瓶)部的信息。圖17為光檢測部件的結構圖。光源部件80通過透鏡86和單色濾光器87以及微縫88對燈85的光進行分光，形成細光束，照射在離心模塊內的光檢測區域(提取/測定瓶)部內的測定溶液中，用透鏡82將該透過光進行聚光，經由光纖導入光檢測區域84。進而，經由透鏡89、ND濾光器90由光檢測器檢測透過光強度，進行AD轉化發送給控制部件。
單色濾光器的波長希望是顯示添加的色素吸收極大的波長，但只要是有吸收的波長就不特別地限定。因此，如果由于蒸發等原因液量減少或是液體移動，透過光強度增大。此外，如果出現氣泡，因散射透過光強度減弱。如此，通過監視透過光強度的變化能夠把握液體的狀態，探測異常。
表示通過上面的操作得到光檢測結果的例子。圖18為提取任意離心模塊的信號的圖，表示時間變化。I(λ11，λ12，t)表示目標熒光波長成分，I(λ31，λ31，t)表示測定溶液的透過光強度。圖18(b)為正常檢測時的變化，隨著時間的推移發生擴增反應，熒光增大。此時，透過光強度幾乎沒有發生變化。與此相反，圖18(a)表示測定值異常時的光檢測結果的時間經過。
表示在擴增反應期間透過光強度增大，測定溶液移動，液體的厚度發生變化的情況。其結果是，熒光強度可看到，并且趨于減小。如此，通過同時監視透過光強度，能夠探測反應液的異常，防止出現錯誤的結果，提高檢測精度。特別是能夠直接監視·定量液量，進行正確的判斷。圖18(c)為說明圖18(b)的異常狀態的圖，表示由于離心力，瓶內的液體為像左圖那樣偏移的狀態，但在測定期間落到了瓶的底部，使得測定條件改變的情況。
實施例5對測定DNA微陣的熒光的情況進行說明。圖19表示本實施例的熒光測定裝置的結構圖。與第1實施例相同，將激光光源或水銀燈等激發光源11的光經由透鏡112，激發光照明用單色化濾光器113，分色鏡模塊114和物鏡115，照射保持在XYZ載物臺上的DNA微陣114。產生的熒光再次由物鏡115進行聚光，經由分色鏡模塊114和熒光測定用切換濾光器116射入分光器117。
進入分光器117的光發生分光，由CCD線形傳感器118進行檢測，將該強度發送給數據處理部件119進行處理。DNA微陣141的掃描在XYZ載物臺進行。也可不掃描激發光。此外，也能夠通過二維照相機進行檢測。此時，熒光測定用切換濾光器116、分光器117、CCD線形傳感器118部分如圖20那樣進行變更。變更為激發波長成分檢測用濾光器142、保持熒光體波長成分測定用濾光器143的濾光器轉換器144和二維冷CCD相機145，用2種濾光器交互檢測被均一照亮(未圖示)的DNA微陣141的圖像，可對每個像素判定激發光波長成分的強度。
在本實施例中，例如在微陣的基板上存在瑕疵時，得到和實施例1相同的效果。此外，在使用微陣的熒光測定中存在雜質附著成為大問題的情況。由于附著了雜質的部分的熒光強度不是正確的值，因此一般將該部分的信號從測定值中刪除。由于附著了雜質的部分的信號強度的分布和無雜質的部分的信號強度的分布存在統計意義上的區別，所以能夠刪除。
但是，當微陣的點小到10微米左右時，點內的像素數量減少以至無法區別信號。即使在這時，本實施例也能夠根據激發光波長成分的強度判斷異常像素，提高測定精度。
實施例6對在多個位置檢測判定測定溶液的狀態的方式進行說明。與實施例4同樣地在擴增反應檢測用試劑中添加與熒光標識不同的、對熒光測定沒有影響的色素溶液。散射的檢測也能夠同樣地執行。
圖22為分析裝置的另外的光學檢測部的結構圖。用于熒光檢測的光檢測部件39使用與實施例4相同結構的光檢測部件。經由光纖26、透鏡28照射在某個離心模塊13內的光檢測區域(提取/測定瓶)部，與實施例4同樣地進行熒光檢測。
而且，為了探測離心模塊的光檢測區域部3內的試劑液5的狀態，設置光源部件150以及光檢測部件151。圖中為光學部件的配置關系，使得在熒光檢測時的離心模塊的附近的離心模塊的位置進行探測。由于旋轉托盤12按順序測定全部的離心模塊，因此無論在哪個位置進行測定都沒有問題。由于可以使離心模塊的號碼與熒光強度的測定結果、試劑液的狀態探測結果相對應，因此無論在哪個位置進行測定都沒有關系。
在圖23中表示光源部件150和探測部件151的結構圖。光源部件150由燈152、針孔153，透鏡154、單色濾光器155和節流156構成，形成分光為離心模塊的光檢測區域部3的大小的或者比該大小稍寬的單色光，照射在光檢測區域部3。
由探測部件151接收通過光檢測區域部的測定溶液5等液體的光。即，由節流157、單色濾光器158、平面傳感器159檢測該透過光，進行AD轉換發送給控制部件。
單色濾光器的波長希望是添加的色素吸收極大時的波長，但只要是存在吸收的波長就無特別地限定。如果蒸發等原因致使液量減少或是液體移動，則透過光強度增大。此外，如果出現氣泡，則散射致使透過光強度減弱。如此，通過監視透過光的強度變化能夠把握液體的狀態，探測異常。
通過本結構，可以檢測光檢測區域部3內任意位置的光強度，了解該位置的透過率，推斷液量。因此，能夠判定光檢測區域部3內的液體的分布，判定液體的偏移，以及由液體的蒸發引起的液量減少。液量減少時，如同在實施例1中記述的那樣，通過在控制器PC的測定畫面上顯示『「液量異常」等』警告消息，能夠探測反應液的異常，防止出現錯誤的結果，提高檢測精度。特別是能夠直接監視·定量液量。
此外，關于液體的偏移也進行同樣的顯示，由此能夠防止出現錯誤結果。
此外，光源部件150和探測部件151的結構除了上述的結構之外，進行如下配置也能夠實現用濾光器將面發光光線單色化，照射在離心模塊的光檢測區域部進行成像，將光檢測區域部的像通過濾光器在平面傳感器上成像并進行檢測。而且，取代平面傳感器，在成像位置配置線形傳感器或者多個光檢測器也能夠實現。
此外，通過在多個位置檢測散射光以及散射光的角度依存，來取代在多個位置接收透過光，能夠判斷液體的減少、結露的狀態，防止出現錯誤結果。
權利要求
1.生物樣本成分檢測法，其是在光檢測區域捕捉生物樣本成分，檢測來自該光檢測區域的熒光，定量該目標生物樣本成分的生物樣本成分檢測法，其特征在于，用熒光體標識該生物樣本成分或者實質上與該生物樣本成分相同的成分，將用于激發該熒光體的激發光照射在光檢測區域，將從光檢測區域發出的光至少分離為多個波段進行檢測，該多個波段中的一個波段實際上是與激發光成分相同的波段，將與激發光成分相同的波段的光強度與預先確定的規定的強度范圍進行比較，當為超過該強度范圍的強度時，判定該光檢測區域的熒光測定是否恰當。
2.根據權利要求1所述的生物樣本成分檢測法，其特征在于，上述光檢測區域實質上為在平面狀的基板面上形成的反應區域。
3.根據權利要求1所述的生物樣本成分檢測法，其特征在于，在該光檢測區域內，在進行擴增反應之后或者在進行擴增反應的同時進行光檢測。
4.根據權利要求1所述的生物樣本成分檢測法，其特征在于，將生物樣本負載于DNA芯片、DNA微陣以及蛋白芯片中的任意種上。
5.根據權利要求1所述的生物樣本成分檢測法，其特征在于，將生物樣本負載于微孔板的孔中。
6.生物樣本成分檢測裝置，其特征在于，具備配置在旋轉圓盤上的光檢測區域；將多種液體分別保存的多個試劑保存部；具有通過離心力能夠使該液體移動的流路的彈藥筒狀結構體；檢測該液體發出的熒光以及從其周邊發出的散射光的光測定部；以及根據該光測定部的信號判定該光檢測區域的熒光測定是否恰當的裝置。
7.根據權利要求6所述的生物樣本成分檢測裝置，其特征在于，所述光檢測區域是微孔板的孔。
8.生物樣本分析裝置，其特征在于，具備能夠控制旋轉的旋轉圓盤；配置在該旋轉圓盤上的光檢測區域；配置在旋轉圓盤上的保存試劑的試劑保存部；配置在該旋轉圓盤上的通過離心力能夠將上述試劑向上述光檢測區域移動的流路；檢測從該光檢測區域發出的光的光測定部；以及根據該光測定部的信號顯示該光檢測區域中的上述樣本的狀態的顯示裝置。
9.根據權利要求8所述的生物樣本分析裝置，其特征在于，所述顯示裝置，當在上述光檢測區域產生有結露時，顯示試劑的測定狀態為異常狀態的意旨。
10.根據權利要求8所述的生物樣本分析裝置，其特征在于，所述顯示裝置，當在上述光檢測區域試劑比規定值減少時，顯示試劑的測定狀態為異常狀態的意旨。
11.根據權利要求8所述的生物樣本分析裝置，其特征在于，所述顯示裝置，當在上述光檢測區域試劑偏移時，顯示試劑的測定狀態為異常狀態的意旨。
全文摘要
在生物樣本成分檢測中，判定雜質的附著、試劑液的減少等異常狀態，提供高精度的檢測法。具有將從光檢測區域發出的光至少分離為多個波段進行檢測的單元，該多個波段中的一個波段實質上是與激發光成分相同的波段，檢測激發光成分的光強度，與預先確定的規定的強度(閾值)進行比較。能夠判定試劑的異常，實現高精度的熒光測定。
文檔編號G01N37/00GK1680802SQ200510063538
公開日2005年10月12日 申請日期2005年4月8日 優先權日2004年4月9日
發明者高橋智 申請人:株式會社日立高新技術