專利名稱：一種酶生化反應測定同型半胱氨酸的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物樣本中測定同型半胱氨酸含量的技術方案以及有此方案制造的試劑。特別是涉及一種用酶生化反應測定同型半胱氨酸的方法。
背景技術：
Tan(2000)報導了一種用酶生化反應測定同型半胱氨酸的方法。同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)經同型半胱氨酸α，γ-裂解酶(homocysteine α-γ-lyase，rHCYase)去氨轉化為α-丁酮酸(α-ketobutyrate)、氨(NH4)和硫化氫(H2S)。硫化氫和熒光素N，N-二丁基亞苯基二胺(N，N-Dibutylphenylene diamine，DBPDA)形成色素酚噻嗪氯化物類化合物[3，7-bis(dibutyl amino)phenothiazine-5-ium chloride]，后者可在660nm處定量測定并且其吸光率和樣本中HCY的含量成正比。
Tan Y，Tang L，Sun X，Zhang N，Han Q，Xu M，Baranov E，Tan XZ，Tan XY，Rashidi B，An Z，Perry AW，Hoffman RM.總同型半胱氨酸測定法。臨床化學雜志2000；461686-88。[Tan Y，Tang L，Sun X，Zhang N，Han Q，Xu M，Baranov E，Tan XZ，Tan XY，Rashidi B，An Z，Perry AW，Hoffman RM.Total-homocysteine enzymatic assay.Clinical Chemistry2000；461686-88.]該法已獲美國專利5,985,540、5,998,191、6,066,467、6,140,102、6,448,446、6,468,762，日本專利3,337,693和中國專利98807531.8。但是，不光只有rHCYase才能使HCY去氨產生H2S；此外，測定硫化氫的生化方法也不限于上述一種。
L-蛋氨酸γ-裂解酶(L-Methionine Gamma-Lyase，rMETase)的經典反應
Tanaka(1980)發現當rMETase底物是HCY時，和rHCYase一樣將HCY去氨轉化為α-丁酮酸(α-ketobutyrate)、氨(NH4)和硫化氫(H2S)。并且，rMETase活性是以L-蛋氨酸為底物時的1.75倍。
Tanaka，等，細菌L-蛋氨酸γ-裂解酶選擇性測定L-蛋氨酸和L-半胱氨酸，以及其抗腫瘤特性。應用生化雜志。2，439-444，1980。[Tanaka，H.，et al.，Selective Determination ofL-Methionine and L-Cysteine with Bacterial L-Methionine Gamma-Lyase and AntitumorActivity of the Enzyme.J.Applied Biochem.2，439-444，1980]但是，迄今為至此法還未有人應用于HCY測定。
Chen(1976)使硫化氫和熒光化合物N，N-雙甲基-p-亞苯基二胺雙鹽酸(N，N-Dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride，DMPD 2HCl)在Fe3+和酸性條件下反應形成最高吸光率在670nm處的藍色產物-亞甲藍(Methylene blue)。通過定量測定亞甲藍在670nm處的吸光率可計算硫化氫的含量。
(λMax=670nm)Chen JS，Mortenson LE.含硫醇鐵-硫蛋白樣本中測定對酸不穩定的硫化物時亞甲藍形成的抑制因素。分析生化。1977年5月1；79(1-2)157-65。[Chen JS，Mortenson LE.Inhibitionof methylene blue formation during determination of the acid-labile sulfide ofiron-sulfur protein samples containing dithionite.Anal Biochem.1977 May 1；79(1-2)157-65.]但是，迄今為至此法還未有人應用于HCY測定。
HCY測定第一步必須將血清樣本中胱氨酸，蛋白結合的的同型半胱氨酸及混合型二硫化物還原為游離的同型半胱氨酸。以往包括Tan氏法均使用Dithiothreitol(DTT)還原含二硫鍵(-S-S-)的化合物成還原態(-SH)化合物。
*R1為任何含硫醇基團Prot為蛋白質-SS-為二硫鍵Schonberg(1935)報導用氨丁三醇(2-羧基乙基)磷化氫[Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]還原含二硫鍵(-S-S-)的化合物成還原態(-SH)化合物。
Schonberg，A.化學，柏林。1935，68，163-164。[Schonberg，A.Chem，Ber.1935，68，163-164。]TCEP比DTT穩定性強，但卻罕見用于HCY測定。
發明內容
本發明酶生化反應測定同型半胱氨酸的原理和Tan氏法一樣，都是借助HCY裂解產生H2S，通過間接測定H2S的產量來定量生物樣本中的HCY濃度。但是，本發明血清樣本還原反應、所用的HCY裂解酶和測定H2S的方法和Tan氏法不同。用TCEP還原血清樣本中胱氨酸，蛋白結合的的同型半胱氨酸及混合型二硫化物為游離的同型半胱氨酸，HCY經rMETase去氨轉化為α-丁酮酸、氨和硫化氫。硫化氫和熒光化合物DMPD 2HCl在Fe3+和酸性條件下反應形成最高吸光率在670nm處的藍色產物-亞甲藍。通過測定亞甲藍在670nm處的吸光率來定量生物樣本中的HCY濃度。
*R1為任何含硫醇基團
(λMax＝670nm)以本發明的酶生化反應測定同型半胱氨酸的方法配制了測定HCY的試劑盒。
具體實施例方式
1.HCY測定1)還原和酶轉化在0.25ml反應液(50mM Tris-HCl pH 7.5，含20μM磷酸吡哆醛pyridoxal phosphate簡稱PLP，0.05％ Triton X-100，1mM TCEP和0.1U/ml rMETase)中加入0.025ml 0-1000μM L-同型胱氨酸，置于37℃水浴30分鐘。
2)測定硫化氫加入0.025ml顯色液(1N HCl含20mM DMPD 2HCl和30mM FeCl3)，混勻后室溫靜止10分鐘。以蒸餾水作為參比，670nm處讀取吸光度。
3)結果L-同型半胱氨酸線性范圍3-1000μM2.同型半胱氨酸(HCY)生化試劑盒產品名稱同型半胱氨酸(HCY)生化試劑盒型號生化試劑產品代碼DC-HCY規格試劑I 25ml，試劑II 2.5ml，HCY標準品1瓶，HCY正常血清對照1瓶，HCY升高血清對照1瓶。100測試/盒。
檢測介質血清或血漿適用于體外診斷用途同型半胱氨酸(HCY)生化試劑盒用于測定血漿或血清標本中的同型半胱氨酸總量(tHCY)用來判斷動脈粥樣硬化所致心血管疾病危險性。
概述同型半胱氨酸(高半胱氨酸)是含硫氨基酸，在細胞內蛋氨酸脫甲基化生成，同型半胱氨酸經甲基化生成蛋氨酸，此過程需活性維生素B12及四氫葉酸作為輔助因子參與。同型半胱氨酸也可以經轉硫通路生成半胱氨酸，此過程需胱硫酶合成酶參與，磷酸吡哆醛(活性維生素B6)為其輔助因子。當同型半胱氨酸代謝受阻，同型半胱氨酸就在細胞內積聚，并進入血液循環。還原形同型半胱氨酸在血中僅占1％，大部分以氧化型存在，其中80-90％與蛋白結合，5-10％與同型半胱氨酸自身結合(HCY-SS-HCY)，另外5-10％與半胱氨酸等結合形成混合型同型半胱氨酸二硫化物(CY-SS-HCY)。通常測定血中總同型半胱氨酸含量(tHCY)。
McCully于1969年最先將極度同型半胱氨酸血癥(tHCY濃度100-450umol/L)動脈粥樣硬化疾病相聯系，極度同型半胱氨酸是由于參與同型半胱氨酸代謝的轉甲基或轉硫作用的酶缺陷所致，常見的有胱硫酶合成酶及亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷，極度同型半胱氨酸血癥病人有早發性動脈粥樣硬化，動靜脈栓塞及智力障礙。
近年來，人們開始注意同型半胱氨酸與心血管疾病的聯系。大量的事實表明輕微到中度同型半胱氨酸血癥(tHCY濃度≥12umol/L，但≤100umol/L)是動脈粥樣硬化所致心血管疾病最廣泛、最強的獨立的致病因素。1997年人群調查表明，人群tHCY濃度偏高的地區，心血管疾病所致的死亡率增加。1998年對血漿tHCY濃度不同的人研究發現tHCY≥15umol/L較之于tHCY≤10umol/L人群危險系數增加到1.4。1998年對21520位年齡在35-64之間沒有缺血性心肌病(IHD)的人群研究，IHD死亡率差異比(odds ratio)由1(tHCY＜10.25umol/L)增致1.43(tHCY介于10.25與12.32umol/L)、1.46(tHCY介于12.33與15.16umol/L)及2.90(tHCY濃度＞15.16umol/L)每增加5umol/L tHCY，缺血性心肌病危險性增加33％，且與血中膽固醇增加0.5nmol/L危險性相當。同時發現冠狀動脈粥樣硬化心臟病人同時伴有tHCY升高，死亡率增加。慢性腎病病人，排泄HCY功能障礙，血中tHCY增加，引起動脈粥樣硬化，心血管疾病死亡率增加。
同型半胱氨酸通過產生超氧化物及過氧化物損傷血管內皮細胞，改變凝血因子功能，增加血栓形成傾向。同型半胱氨酸可使小動脈血管易于栓塞及促進血管平滑肌細胞增殖參與粥樣硬化形成。同型半胱氨酸活化形式(Homocystein thiolactone)可促使血小板聚集，并可與載脂蛋白B形成致密的復合物易于被血管壁巨噬細胞吞噬，引起血管壁脂肪堆積。同型半胱氨酸能增強其它心血管疾病危險因素如膽固醇、高血壓及吸煙對心血管的損害。通過上述機制，同型半胱氨酸促進動脈粥樣硬化及血栓形成，使心血管疾病發病率及死亡率增加，血中同型半胱氨酸濃度升高(tHCY濃度≥12umol/L)是冠心病、中風、外周血管粥樣硬化及動靜脈栓塞的危險因子，血中同型半胱氨酸升高使心血管疾病發病率及死亡率增加，因此測定血中tHCY濃度在臨床意義上十分重要。
原理還原標本中胱氨酸，蛋白結合的的同型半胱氨酸及混合型二硫化物在加入氨丁三醇(2-羧基乙基)磷化氫[Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]后，還原為游離的同型半胱氨酸。
*R1為任何含硫醇基團酶轉化經基因重組蛋白rMETase去氨作用，同型半胱氨酸轉化為α-丁酮酸(α-ketobutyrate)、氨(NH4)和硫化氫(H2S)
測定硫化氫硫化氫和合成的熒光化合物N，N-雙甲基-p-亞苯基二胺雙鹽酸(N，N-Dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride，DMPD 2HCl)反應形成最高吸光率在670nm的藍色產物-亞甲藍(Methylene blue)。其吸光值與總HCY濃度成正比。
(λMax＝670nm)試劑盒組成每個同型半胱氨酸(HCY)生化試劑盒(100測試)含有1.試劑I 反應液1瓶25ml2.試劑II顯色劑1瓶2.5ml3.HCY標準品 1瓶凍干品4.HCY正常血清對照 1瓶凍干品5.HCY升高血清對照 1瓶凍干品6.檢驗證明7.1份使用說明。
試劑配制本試劑盒為液體雙試劑，可直接上機使用。HCY標準品、HCY正常或升高血清對照需要溶于1ml蒸餾水中方可使用。如果受限于分析儀比色杯容積限制，可以依比例(詳見試驗參數)調整試劑I、樣本/標準品/血清對照及試劑II使用量。
試劑的穩定與貯存期試劑I和試劑II避光保存2-8℃一年。凍干的HCY標準品、HCY正常或升高血清對照2-8℃或冷凍保存一年。溶化后的HCY標準品、HCY正常或升高血清對照-20℃保存半年。
樣本處理a.因紅細胞可合成同型半胱氨酸，所以標本需在半小時內離心使血漿或血清與紅細胞分離.在離心分離前，標本應置于冰上。加NaF于血液樣品中也可阻止Hcy在采樣后2小時內的顯著升高。
b.用于科研，建議使用EDTA處理血漿，血清標本通常正常范圍比血漿標本高5-10％。EDTA處理血漿需立刻離心或立即置于冰中。離心前EDTA處理血漿可在冰中保持6小時。
c.食物的攝入可影響同型半胱氨酸的檢測水平，蛋白含量豐富的食物可導致測定值的升高，因此采樣前應注意不要攝入太多蛋白。
d.常規血樣應特別注意上述事項。
e.融化的標本使用前需充分混勻。反復的凍溶并不影響血漿Hcy的濃度。
f.血漿樣品中的Hcy在室溫可穩定4天，在2-8℃可保存幾周，在-20℃可保存數月。
試驗參數與操作步驟溫度37℃測試方法終點法啟動反應0.025ml樣本/標準品/血清對照+0.25ml試劑I(或依比例混勻)孵育時間30分鐘終止反應加0.025ml試劑II(或依比例混勻)延遲時間10分鐘空白參照水測試讀吸光值A670測試儀 Shimadzu UV-160計算HCY(μmol/L)＝(Ax/Ac)×Ec其中Ax＝樣本吸光值A670Ac＝標準品吸光值A670Ec＝HCY標準品濃度(μmol/L)注意事項1.試劑和樣品用量可因儀器不同，按比例增減。
2.測試中HCY正常或升高血清對照應作為陰性和陽性參照。
參考值正常參考范圍5-15μmol/L tHCY。但切記各實驗室需要根據自身實驗條件自行訂定正常人血清tHCY范圍。
試劑性能線性范圍-3-1000μmol/L L-HCY精密度-CV12％特異性-血清、0.075mmol/L L-蛋氨酸、150mmol/L L-半胱氨酸、0.75mmol/L L-胱硫醚、5.0mmol/L腺苷、50mmol/L谷胱甘肽、200mg/dL血紅蛋白、400mg/dL甘油三酯對本法無干擾。
儀器全自動、半自動生化分析儀或可見光分光光度計參考文獻參閱實申參考資料。
權利要求
1.一種用酶生化反應測定生物樣本中同型半胱氨酸的方法，其特征是同型半胱氨酸經L-蛋氨酸γ-裂解酶去氨轉化為α-丁酮酸、氨和硫化氫，硫化氫和熒光化合物DMPD 2HCl在Fe3+和酸性條件下反應形成最高吸光率在670nm處的藍色產物-亞甲藍，通過測定亞甲藍在670nm處的吸光率來定量生物樣本中的同型半胱氨酸濃度。
2.一種按權利要求1制造的測定生物樣本中同型半胱氨酸含量的產品，其特征是同型半胱氨酸經L-蛋氨酸γ-裂解酶去氨轉化為α-丁酮酸、氨和硫化氫，硫化氫和熒光化合物DMPD2HCl在Fe3+和酸性條件下反應形成最高吸光率在670nm處的藍色產物-亞甲藍，通過測定亞甲藍在670nm處的吸光率來定量生物樣本中的同型半胱氨酸濃度(3-1000μM)。
全文摘要
本發明一種酶生化反應測定生物樣本中同型半胱氨酸的方法。同型半胱氨酸經L－蛋氨酸γ－裂解酶去氨轉化為α－丁酮酸、氨和硫化氫。硫化氫和熒光化合物DMPD 2HCl在Fe
文檔編號G01N21/31GK1693879SQ200510053210
公開日2005年11月9日 申請日期2005年2月6日 優先權日2005年2月6日
發明者蔡楓 申請人:浙江亞克藥業有限公司, 蔡楓