用熒光稀土納米顆粒作為標記物的免疫層析方法及其檢測試紙條的制作方法

專利名稱：用熒光稀土納米顆粒作為標記物的免疫層析方法及其檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫層析檢測方法，特別是一種以熒光稀土絡合物納米顆粒為標記物的快速免疫層析檢測方法及其檢測試紙條。所說的熒光稀土絡合物納米顆粒是攙雜或者鍵合熒光稀土絡合物的硅納米顆粒。
背景技術：
免疫分析是用于抗體、抗原和半抗原檢測的通用方法。免疫分析的檢測模式有多種，其中，固相免疫分析法和免疫層析法均為臨床常規方法。固相免疫分析法包括樣品溫育和沖洗步驟，該法具有靈敏度高、可進行半定量乃至定量檢測的優點，尤其是96微孔板的檢測模式便于大量樣品的檢測，是目前臨床免疫診斷的主流檢測方法。該方法的缺點是操作較為復雜，涉及加樣、溫浴、洗滌、顯色、終止、檢測等多個步驟，耗時1～2小時，對操作人員和環境也有一定的要求。雖然目前已經出現全自動儀器，但價格昂貴，普遍應用受限。
在固相免疫檢測中，為進一步提高靈敏度，已有將稀土熒光納米顆粒用作標記物的報道，如Lvgren等(Clin.Chem.2001，47(3)561-568；Anal.Chem.2001，732254-2260；Clin.Chem.2001，47(7)1269-1278)就描述了一種采用包裹β-二酮體-Eu3+絡合物的聚苯乙烯微粒作為標記物的高靈敏度的固相時間分辨熒光免疫分析(TrFIA)技術。Tan等(Chem.Mater.2004，162494-2498)描述了一種以二氧化硅包裹Eu3+絡合物的納米顆粒作為標記物的固相TrFIA技術。公開號CN1515909A的專利申請公開了一種量子點納米粒子標記的夾心免疫檢測法及診斷試劑盒。這些報道或專利申請所采用的檢測方法能夠達到較高的靈敏度，可以實現定量或半定量檢測。
免疫膠體金技術屬徑向層流技術(又稱免疫層析檢測技術)，人們熟知的床邊檢測試紙條(如早孕自檢試紙條)就是其代表。免疫層析技術由于廣泛使用膠體金作為指示劑，所以又被稱為膠體金檢測法。該技術在操作時僅需要試紙條與樣品接觸，靜待數分鐘后即可肉眼判讀結果，因此具有操作簡便、快速的優點，一般病人自行在家中即可操作。目前，該法廣泛應用于樣品初篩。膠體金技術的缺點是檢測靈敏度較低，難以進行定量檢測，而且目視檢測使檢測結果不易記錄和保存。
在免疫層析檢測技術中，除了采用膠體金作為標記物外，已有采用其它標記物作為指示劑的報道。CN1156699C號專利公開了一種免疫膠體金和免疫磁性粒子雙標記技術，將目的蛋白的抗體或抗原標記于磁珠，再以此磁珠去標記膠體金，使該抗體或抗原上同時帶有兩個標記物。然后以此雙標記了的抗體或抗原去結合目的抗原或抗體，最終被固定在膜上的相應抗體或抗原捕獲，形成一檢測帶。然后在肉眼對檢測帶進行初步定性或半定量檢測的基礎上，以磁性測定儀對該檢測帶進行定量檢測。Bruning等(J.Clin.Microbiol.1999，81(1-2)143-154)描述了一種以藍色乳膠顆粒作為標記物的免疫層析試紙條快速檢測牛瘟病毒的方法。公開號CN1480391A的專利申請公開了一種在常溫下制備膠體納米硒顆粒的方法，并將該方法制得的標記物用于免疫層析檢測，獲得了高于膠體金方法的靈敏度。Ahn等(Clinica Chimica Acta，2003，33251-59)報道了使用熒光染料熒光素作為指示劑用于免疫層析，可以獲得較高的靈敏度，而且可以實現定量檢測；專利號為US5753517的專利公開了一種使用乳膠顆粒作為標記物的定量免疫層析方法和儀器。

發明內容
本發明的目的是提供一種與常規固相免疫分析法相比，更簡便、更快速；與常規膠體金免疫層析檢測方法相比，更靈敏，適于定量的新型免疫層析檢測方法。
本發明的另一目的是提供了一種用熒光稀土絡合物納米顆粒標記物制作的免疫層析檢測試紙條。
本發明采用的技術方案是以申請人已經發明的熒光稀土絡合物納米顆粒(CN 1400467A號專利申請)作為標記物，將高靈敏度的熒光稀土絡合物納米顆粒標記物與免疫層析技術相結合，利用抗原抗體的特異反應，應用于免疫層析檢測。
本發明所說的用熒光稀土絡合物納米顆粒制作的快速檢測試紙條方法的實施步驟如下1)將捕捉抗體或抗原直接或間接固定在層析膜上將捕捉抗原或抗體通過物理吸附方式直接固定在層析膜上，對不能直接固定在層析膜上的分子量較小的抗原，通過預先將小分子抗原與載體蛋白交聯，再通過物理吸附的方式固定于層析膜上；2)免疫層析在層析膜一側的樣品墊上加入樣品液和標記抗體，發生的免疫反應經過層析形成免疫復合物帶，所說的標記抗體指的是用熒光稀土絡合物納米顆粒標記的與待測抗原特異結合的單克隆或多克隆抗體，所說的免疫復合物帶包括檢測帶和控制帶；3)結果檢測對形成的檢測帶和控制帶進行檢測。
所說的熒光稀土絡合物納米顆粒指的是以二氧化硅納米顆粒為載體的，通過共價或物理的方法摻雜有稀土絡合物的熒光納米粒子，其熒光波長可根據所摻雜的稀土絡合物的不同而改變(參見CN 1400467A號專利申請)。
熒光稀土絡合物納米顆粒的標記方法，是一種將抗體固定于納米顆粒表面的方法。以表面帶有氨基的熒光納米顆粒為例，當標記抗體時，可以將抗體的Fc端氧化產生醛基，再與顆粒表面已經修飾的氨基交聯。這樣可以把抗體定向標記到顆粒表面，使其抗原結合端(N端)朝向外側。當然也可以通過其它雙功能試劑進行交聯。當標記抗原時，根據抗原所能提供的標記基團不同，可以采用戊二醛、碳二亞胺或其它雙功能試劑進行交聯。標記小分子物質時，可以在顆粒表面先交聯一層鋪墊蛋白(如牛血清白蛋白BSA)。
所說的標記抗體或抗原是事先被滴加或浸泡到玻璃纖維膜上，經過冷凍干燥后，再裝配到試紙條底襯上的；或者以溶液形式保存，在檢測前滴加到樣品墊靠近層析膜一端。
所說的抗體固定是指按照制作膠體金免疫檢測試紙條的常規方法，通過點膜器將捕捉抗體或抗原呈線狀劃到層析膜上(一般通過機器自動完成)。某些小分子半抗原的固定，需要與預先載體蛋白(如BSA)共價交聯，然后再按與蛋白抗原的相同的方式固定到層析膜上。本發明還在檢測帶的下游，通過點膜器將與標記抗體或抗原對應的抗體(如兔抗鼠IgG)呈線狀或帶狀劃到層析膜上，其作用是在檢測時作為控制帶。所說的載體蛋白優選牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白等。
所說的層析膜為尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜或硝酸纖維素與醋酸纖維素的混合膜等中的一種。
所說的免疫反應包括夾心式和競爭式兩種模式。在夾心模式中，待測抗原在點樣區與熒光稀土絡合物納米顆粒標記抗體形成免疫復合物，該復合物在膜上移動與固定在膜另一端的特異抗體發生特異結合，形成固定化的免疫復合物，由于該免疫復合物攜帶由標記的熒光稀土絡合物納米顆粒，因此成為檢測帶。與此同時，部分游離的熒光稀土絡合物納米顆粒標記的抗體可以越過固定化抗體帶，結合到遠端的包被抗體，形成新的熒光稀土絡合物納米顆粒結合區，此為控制帶，可以指示標記抗體的活性。在競爭模式中，待測抗原首先與加入的熒光稀土絡合物納米顆粒標記的抗體反應，游離的標記抗體則與檢測帶處的固定的抗原結合，部分游離的抗體可以越過固定化抗體帶，結合到遠端的所謂控制線(固定有抗抗體試劑)，形成新的熒光稀土絡合物納米顆粒結合區，此為控制帶。
所說的結果檢測，是指對形成的檢測帶和控制帶進行檢測，檢測方式可以是在紫外光下進行肉眼觀察，也可用數碼相機進行輔助觀察并記錄結果，也可以通過專用的熒光測量儀進行檢測。檢測帶的熒光強度與待測樣品存在定量關系，如果是夾心法檢測模式中，檢測帶處的熒光強度與待測樣品含量成正比。如果是競爭法模式，檢測帶處的熒光強度與待測樣品含量成反比。
本發明所說的免疫層析檢測試紙條由底襯、加樣墊、標記物墊、層析膜和吸水墊組成，在底襯上依次貼上層析膜、加樣墊、標記墊和吸水墊，層析膜設于底襯上的中部，加樣墊和吸水墊分別設于底襯上的兩邊，標記物設于加樣墊與層析膜之間，層析膜的另一端接吸水墊。底襯可采用聚氯乙稀材料底襯。
本發明所說的免疫層析檢測試紙條的制備步驟如下1)制備熒光稀土絡合物納米顆粒。
2)標記抗體或抗原的交聯及固相化。
3)在層析膜上固定捕捉抗體或抗原或控制線抗體。
4)組裝試紙條。
本發明與現有技術相比具有以下優點1)將高靈敏的熒光稀土絡合物納米顆粒與免疫層析技術相結合，制備了檢測試紙條，既能進行定性檢測又能進行定量檢測。
2)使用該技術制備的試紙條操作簡便，省時省力，一步法完成，5-30分鐘給出結果。
3)靈敏度高。以檢測乙肝表面抗原(HBsAg)為例，在紫外光(310-360nm)激發下熒光成像的檢測限為0.2ng/mL。如果配合時間分辨檢測儀器，可望進一步提高靈敏度。
4)既適合于單個樣品的檢測，又適用于大量樣品的篩查。
5)還能用于制備一項多檢的快速檢測試劑盒。
6)能夠檢測全血、血清、血漿、唾液、尿液等樣品。
7)能夠應用于疾病診斷、毒品檢測、細菌檢測和環境檢測等領域。
本發明所采用的熒光稀土絡合物納米顆粒還具有熒光壽命長的特點，允許使用時間分辨檢測儀器，獲得比普通熒光檢測更高的靈敏度。
由于稀土絡合物具有Stokes位移大，激發光譜帶較寬，發射光譜帶窄的特點，選用不同的熒光稀土絡合物納米顆粒針對不同的待檢抗原或抗體就可以同時檢測同一樣品中的不同待檢目標。
本發明提供了一種新的指示劑用于免疫層析檢測，建立在新指示劑基礎上的免疫層析檢測技術既保持了傳統膠體金的簡便快速優點，同時又克服了后者靈敏度低，無法定量的缺點，同時，與上述免疫層析檢測中的膠體金替代指示劑相比，也具有獨特的優點，包括了檢測靈敏度更高，可以多色檢測，穩定，檢測方式靈活等。


圖1為標記顆粒示意圖，分別表示了不同的標記策略。在此，以表面帶有氨基的，直徑為50nm的熒光稀土絡合物納米顆粒(FNP)為例。圖1a為定向標記抗體的示意圖。抗體的Fc端被氧化產生醛基，能夠與顆粒表面的氨基交聯，從而被定向固定到顆粒表面。定向標記的抗體的Fab端朝向顆粒外端，最大限度地減小了顆粒帶來的空間位阻。圖1b為顆粒標記大分子抗原示意圖。根據抗原所能提供的標記用基團，選擇戊二醛、碳二亞胺或其它雙功能試劑。此標記策略適用于那些分子量較大，受空間位阻影響較小的抗原。圖1c為顆粒標記小分子抗原示意圖。因為小分子抗原受空間位阻影響較大，所有需要在顆粒表面先交聯一層鋪墊蛋白(如BSA)，以降低顆粒帶來的空間位阻。在實際應用當中，可根據不同的標記對象選擇不同的標記策略。
圖2為用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析檢測試紙條結構示意圖。該試紙條結構與常規膠體金試紙條相似。分別由聚氯乙稀底襯1、加樣墊2、標記物墊3、層析膜4和吸水墊5組成。裝配時，與膠體金試紙條相似，在底襯1上依次貼上層析膜4、加樣墊2、標記物墊3和吸水墊5，再由切割機切割成為適當寬度的試紙條。
圖3為用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析檢測試紙條檢測結果示意圖。該試紙條的檢測結果須在紫外光激發下觀察。當采用夾心法或間接法檢測時，陽性結果呈現兩條帶，即檢測帶6和控制線7，陰性結果只呈現一條控制線。當采用競爭法檢測時，陰性結果呈現兩條帶，而陽性結果只呈現一條帶。
圖4為用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析檢測試紙條一步多檢示意圖。在此，我們以HBsAg檢測系統和生物素-親核素系統模擬一步多檢項目。第一檢測帶8的HBsAg檢測系統以一對不同位點的單抗作為捕獲抗體和標記抗體，其中將標記抗體與Eu3+絡合物納米顆粒交聯，以夾心法進行檢測。第二檢測帶9的生物素-親核素系統，則是將親核素模擬捕獲抗體，以生物素化的Tb3+絡合物納米顆粒作為標記物，采用競爭法模擬檢測生物素。以兔抗鼠IgG作為檢測帶捕獲抗體。標記物墊中同時含有抗-HBsAg單抗標記的Eu3+絡合物納米顆粒和生物素標記的Tb3+絡合物納米顆粒。當檢測樣品中同時含有HBsAg和生物素時，呈現兩條紅色的帶；當檢測樣品中只含有HBsAg時，呈現兩條紅色以及一條綠色的帶；當檢測樣品中只含有生物素時，只呈現一條紅色的控制線帶10；當樣品中不含有HBsAg和生物素時，呈現一條綠色和一條紅色的控制線帶。
圖5為膠體金試紙條檢測結果。此處以商品化膠體金HBsAg檢測試紙條作為對照，檢測時間為30分鐘。從結果可見，其靈敏度在1ng/mL左右(由于掃描的緣故，圖中的檢測帶看的不是很清楚)。
圖6為稀土絡合物熒光納米顆粒試紙條檢測結果。在圖6中，以HBsAg為檢測對象，考察其檢測靈敏度。檢測時間為30分鐘，檢測結果以數碼相機(Canon Powershot A80型)在熒光成像條件下輔助觀察并記錄結果。為了便于觀察，照相結果進行了反相處理。從結果可見，該試紙條的檢測靈敏度可達0.2ng/mL。
具體實施例方式
以下實施例描述了本發明的特殊實施例子，以便對本發明作進一步的說明，這些實施例只是說明而不表示本發明所有的可能性。本發明并不局限于這些實施例中提到的材料、反應條件或參數，任何在相關領域具備經驗的人，都可以按照本專利的原理，利用其它類似材料或反應條件實現本發明所描述的免疫層析技術或制備出檢測試劑盒。這些并不脫離本發明描述的基本概念。因此，這些修改或者不同的應用都在本發明的覆蓋范圍之內。
實施例一HBsAg快速檢測試紙條的制備該實施例以HBsAg為檢測對象，以表面帶有氨基的直徑50nm左右的鍵合型熒光稀土絡合物納米顆粒，硝酸纖維素層析膜為例，通過標記、包被以及各組成部分組裝，制備出用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析檢測試紙條成品。
(1)抗-HBsAg單克隆抗體的標記方法一定向標記取親和純的抗-HBsAg單克隆抗體500μL(3.6mg/mL)，對0.01M醋酸鈉緩沖液(pH5.2)4℃透析6h；然后加入NaIO4，對抗體進行氧化。20min后，再次對0.01M pH5.2醋酸鈉緩沖液透析；然后加入表面帶有氨基的BHHCT-Eu顆粒500μL(18mg/mL)，混勻，4℃過夜；加入NaBH4，終濃度為5mM，反應2h；再加入等體積的封閉液(50mM Ttris 7.8，含2％BSA、4％蔗糖)，封閉12h或4℃過夜；最后用50mM tris 7.8洗滌標記好的抗體3遍，然后用500μL 50mM tris 7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN3)懸浮備用。
方法二戊二醛交聯向500μL懸浮于超純水中的表面帶有氨基的BHHCT-Eu顆粒(18mg/mL)中加入125μL戊二醛(25％)，室溫攪拌2h；以超純水洗滌顆粒3次；加入500μL抗-HBsAg單克隆抗體(3.6mg/mL)，4℃過夜；加入NaBH4，終濃度為5mM，反應2h；再加入等體積的封閉液(50mM tris 7.8，含2％BSA、4％蔗糖)，封閉12h或4℃過夜；最后用50mM tris 7.8洗滌標記好的抗體3遍，然后用500μL 50mM tris 7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN3)懸浮備用。
(2)標記抗體的固相化方法一凍干法將制備好的標記顆粒用以10mM Tris 7.8緩沖液配制的2％的酪蛋白稀釋液按1∶1000稀釋；然后將作為標記物墊的玻璃纖維浸入其中，以浸濕為準，然后凍干備用。
方法二懸浮態保存法將制備好的標記顆粒用以10mM Tris 7.8緩沖液配制的2％的酪蛋白稀釋液按1∶100稀釋，并于容器中保存于4℃。在檢測前以1μL的量滴加到樣品墊靠近層析膜一端。
(3)捕獲抗體的包被在硝酸纖維素薄膜上，用點膜器將2mg/mL單克隆抗-HBs點成線狀或帶狀，其包被體積為1.2μL/cm作為檢測帶；在距檢測帶0.5cm的膜上，用2mg/mL的兔抗鼠IgG再劃一條對照線.用PBS漂洗2次，再用50mg/mL BSA封閉2h。取出后再加蛋白穩定劑處理3min涼干。
(4)試紙條的裝配在一長方形聚氯乙稀底襯的中部貼上已包被單克隆抗-HBs的硝酸纖維素薄膜，在膜的一側貼上玻璃纖維，并在于膜交接的一端鋪上標記物墊，在層析膜的另一端貼上吸水紙。然后切成75mm×3mm條形的HBsAg檢測試紙條。
(5)樣品檢測在試紙條的樣品墊上加60μL的待測樣品(如果標記顆粒以懸浮態保存，則在加樣品前，在樣品墊靠近層析膜一端滴加1μL標記顆粒懸浮液)，20min后，在紫外光下觀察結果或通過時間分辨熒光檢測儀測量度數。如果樣品中HBsAg含量較低，則需適當延長時間。陽性結果呈現兩條紅色的帶，而陰性結果只呈現一條紅色的帶。層析反應30min，在紫外光激發熒光成像的檢測靈敏度為0.2ng/mL。在本實施例中，我們以Canon Powershot A-80進行輔助觀察并記錄結果。該方法檢測的結果還可以通過時間分辨熒光檢測儀進行讀數。
實施例二以生物素-親核素系統模擬競爭法檢測生物素該實施例將鏈霉親核素模擬捕獲抗體，以生物素化的Tb3+絡合物納米顆粒作為標記物，采用競爭法模擬檢測生物素。例中所用的顆粒直徑在50nm左右。
(1)Tb3+絡合物納米顆粒的生物素化方法一取待標記的表面帶有氨基的BPTA-Tb顆粒500μL(懸浮于無水乙醇)，加入少許biotin-mPEG-SPA，溶解，混勻，室溫反應3h；然后，分別以無水乙醇和50mM tris 7.8緩沖液洗滌顆粒3遍，然后用500μL 50mM tris 7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN3)懸浮備用。
方法二取待標記的表面帶有氨基的BPTA-Tb顆粒500μL(懸浮于超純水)，用5％的戊二醛處理2h，洗滌后，重懸浮于1mL 10mM PBS 7.4緩沖液中，然后加入10mg BSA，室溫反應2h后，以上述PBS緩沖液進行洗滌，然后加入1mg NHS-LC-biotin，室溫反應3h；以50mM tris 7.8緩沖液洗滌顆粒3遍，然后用500μL 50mM tris 7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN3)懸浮備用。
(2)標記的顆粒的固相化同實施例一。
(3)捕獲抗體的包被在硝酸纖維素薄膜上，用點膜器將1mg/mL鏈霉親核素點成線狀或帶狀，其包被體積為1.2μL/cm作為檢測帶。因為是模擬實驗，暫不設控制線。用PBS漂洗2次，再用50mg/mLBSA封閉2h。取出后再加蛋白穩定劑處理3min涼干。
(4)試紙條的裝配同實施例一。
(5)樣品檢測在試紙條的樣品墊上加60μL的待測樣品(如果標記顆粒以懸浮態保存，則在加樣品前，在樣品墊靠近層析膜一端滴加1μL標記顆粒懸浮液)，20min后，在紫外光下觀察結果或通過時間分辨熒光檢測儀測量度數。本實施例以50ng/mL作為陽性對照，0ng/mL作為陰性對照。陽性對照不呈現檢測帶，而陰性對照呈現一條綠色的檢測帶。
實施例三一步多檢檢測以HBsAg檢測系統和生物素-親核素系統模擬一步多檢項目。第一檢測帶的HBsAg檢測系統以一對不同位點的單抗作為捕獲抗體和標記抗體，其中將標記抗體與Eu3+絡合物納米顆粒交聯，以夾心法進行檢測。第二檢測帶的生物素-親核素系統，則是將親核素模擬捕獲抗體，以生物素化的Tb3+絡合物納米顆粒作為標記物，采用競爭法模擬檢測生物素。以兔抗鼠IgG作為檢測帶捕獲抗體。標記物墊中同時含有抗-HBsAg單抗標記的Eu3+絡合物納米顆粒和生物素標記的Tb3+絡合物納米顆粒。
(1)抗-HBsAg單克隆抗體的標記同實施例一。
(2)Tb3+絡合物納米顆粒的生物素化同實施例二。
(3)標記顆粒的固相化同實施例一，所不同的是，標記顆粒為Eu顆粒標記物和Tb顆粒標記物的混合物。
(4)捕獲抗體的包被在硝酸纖維素薄膜上，用點膜器將2mg/mL單克隆抗-HBs點成線狀或帶狀，其包被體積為1.2μL/cm作為檢測帶1；在檢測帶1下游0.4cm的膜上，用1mg/mL的鏈霉親核素再劃一條檢測帶2；在檢測帶2下游0.4cm的膜上，用2mg/mL的兔抗鼠IgG再劃一條對照線.用PBS漂洗2次，再用50mg/mL BSA封閉2h.取出后再加蛋白穩定劑處理3min涼干。
(5)試紙條的裝配同實施例一。
(6)樣品檢測在試紙條的樣品墊上加60μL的待測樣品(如果標記顆粒以懸浮態保存，則在加樣品前，在樣品墊靠近層析膜一端滴加1μL標記顆粒懸浮液)，20min后，在紫外光下觀察結果或通過時間分辨熒光檢測儀測量度數。當檢測樣品中同時為HBsAg和生物素陽性時，呈現兩條紅色的帶；當檢測樣品中只有HBsAg陽性時，呈現兩條紅色以及一條綠色的帶；當檢測樣品中只有生物素陽性時，只呈現一條紅色的控制線帶；當樣品中的HBsAg和生物素均為陰性時，呈現一條綠色和一條紅色的控制線帶。
權利要求
1.用熒光稀土納米顆粒作為標記物的免疫層析方法，其特征在于其步驟為1)將捕捉抗原或抗體通過物理吸附方式直接固定在層析膜上；對不能直接固定在層析膜上的分子量較小的抗原，先將小分子抗原與載體蛋白交聯，再通過物理吸附的方式固定于層析膜上；2)在層析膜的樣品墊一側加入樣品液和標記抗體，經免疫反應形成免疫復合物，所說的標記抗體指的是用熒光稀土絡合物納米顆粒標記的與待測抗原結合的單克隆或多克隆抗體，所說的免疫復合物經免疫層析形成檢測帶和控制帶；3)對形成的檢測帶和控制帶進行檢測。
2.如權利要求1所述的用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析方法，其特征在于熒光稀土絡合物納米顆粒指的是以二氧化硅納米顆粒為載體的，通過共價或物理的方法摻雜有稀土絡合物的熒光納米粒子。
3.如權利要求1所述的用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析方法，其特征在于所說的載體蛋白優選牛血清白蛋白或酪蛋白。
4.如權利要求1所述的用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析方法，其特征在于所說的標記抗體或抗原是事先被滴加或浸泡到玻璃纖維膜上，經過冷凍干燥后，再裝配到試紙條底襯上的；或者以溶液形式保存，在檢測前滴加到樣品墊靠近層析膜一端。
5.如權利要求1所述的用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析方法，其特征在于所說的層析膜為尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜或硝酸纖維素與醋酸纖維素的混合膜中的一種。
6.如權利要求1所述的用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析方法，其特征在于所說的形成的檢測帶和控制帶檢測是指在紫外光下肉眼觀察，或用數碼相機進行輔助觀察并記錄結果，或通過專用的熒光測量儀進行檢測。
7.如權利要求1所述的用熒光稀土絡合物納米顆粒作為標記物的免疫層析方法，其特征在于其檢測模式包括夾心模式和競爭模式，檢測對象為單個組分或多個組分。
8.免疫層析檢測試紙條，其特征在于在底襯上依次貼上層析膜、加樣墊、標記墊和吸水墊，層析膜設于底襯上的中部，加樣墊和吸水墊分別設于底襯上的兩邊，標記物設于加樣墊與層析膜之間，層析膜的另一端接吸水墊。
9.如權利要求8所述的免疫層析檢測試紙條，其特征在于在層析膜上劃有呈線狀的與標記抗體或抗原對應的抗體。
全文摘要
用熒光稀土納米顆粒作為標記物的免疫層析方法及其檢測試紙條，涉及一種以熒光稀土絡合物納米顆粒為標記物的快速免疫層析檢測方法及其檢測試紙條。提供一種與常規固相免疫分析法相比，更簡便、更快速；與常規膠體金免疫層析檢測方法相比，更靈敏，適于定量的新型免疫層析檢測方法及其檢測試紙條。其步驟為將捕捉抗原或抗體通過物理吸附方式直接固定在層析膜上；在層析膜的樣品墊一側加入樣品液和標記抗體，經免疫反應形成免疫復合物，對形成的檢測帶和控制帶進行檢測。在底襯上依次貼上層析膜、加樣墊、標記墊和吸水墊，層析膜設于底襯上的中部，加樣墊和吸水墊設于底襯兩邊，標記物設于加樣墊與層析膜之間，層析膜的另一端接吸水墊。
文檔編號G01N33/52GK1645146SQ20051005229
公開日2005年7月27日 申請日期2005年2月3日 優先權日2005年2月3日
發明者李慶閣, 許曄 申請人:廈門大學