H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接elisa檢測試劑盒的制作方法

專利名稱：H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接elisa檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及水禽的一種病毒抗體的快速診斷方法和器具，具體是H5亞型水禽流感病毒(AIV)血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
禽流感(avian influenza)，全稱禽類流行性感冒病毒感染，是由正粘病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒引起禽類的一種從呼吸系統(tǒng)感染到敗血癥等多種癥狀的傳染病，禽類感染后病死率很高。1878年，Perroncito在意大利首次發(fā)現(xiàn)禽流感。1900年其病原體首次被人發(fā)現(xiàn)，1955年才經(jīng)血清學(xué)證實屬A(甲)型流感病毒。此后禽流感病毒一直在世界各地家禽中普遍存在，并造成了程度不同的影響。特別是1997年香港爆發(fā)的禽流感已經(jīng)對人類健康構(gòu)成威脅。至此，禽流感問題引起了世界各地的廣泛關(guān)注。目前已證明，只有H5和H7亞型可引起HPAl。禽流感在全球廣泛分布，其主要的儲存宿主是水禽和遷徙的鳥類。
由于A型流感病毒引起的禽流感，其病理變化因感染病毒毒株毒力的強(qiáng)弱、病程長短和禽種的不同而不同。其臨床癥狀因感染禽的種類、年齡、性別、并發(fā)感染情況及所感染毒株的毒力和其他環(huán)境等不同而表現(xiàn)出的癥狀很不一致。雞的流感病毒的抗體檢測相繼建立了雞流感瓊脂擴(kuò)散(AGP)、血球凝集抑制試驗(HI)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等血清學(xué)檢測技術(shù)。然而，由于水禽的品種特殊性，其流感抗體的檢測方法一直是困惑水禽疫苗免疫效果評估和水禽流感診斷的難題。因此，研制開發(fā)適用于水禽流感抗體檢測的特異的、敏感的、生物安全度高的、適合于基層使用的診斷檢測的器具，對水禽免疫水平進(jìn)行實時監(jiān)控和建立科學(xué)、靈活的水禽流感的免疫程序，以及對疫病的預(yù)防和控制有重要意義發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種H5亞型水禽流感病毒(AIV)血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的采用原核表達(dá)的水禽流感病毒血凝素蛋白(HA)作為抗原包被可拆96孔酶標(biāo)板，以辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗水禽IgG制備酶結(jié)合物工作液，以間接ELISA法直接檢測標(biāo)本中的AIV血凝素抗體。具體如下本發(fā)明的H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒內(nèi)設(shè)有抗體檢測板，酶結(jié)合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，抗體檢測板為包被水禽流感H5亞型血凝素蛋白(HA)的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗水禽IgG多克隆抗體，陽性對照為H5亞型水禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，陰性對照為水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。
水禽流感H5亞型血凝素蛋白(HA)為利用原核高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化的基因工程重組蛋白，可與水禽流感H5亞型血凝素抗體特異結(jié)合。它的制備為利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增水禽流感血凝素蛋白基因序列，將其亞克隆于pET28a原核表達(dá)載體構(gòu)建pET/HA(H5)重組表達(dá)載體，pET/HA(H5)用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)的水禽流感病毒血凝素蛋白經(jīng)商用Ni-NTA親和層析柱獲得純化，純化的蛋白用于H5亞型水禽流感病毒陽性血清檢測。
抗體檢測板的最佳制備條件為用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩沖液作包被液，將水禽流感病毒血凝素蛋白稀釋為8μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，37℃2小時，再4℃包被過夜，甩干，按100μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸鹽緩沖液37℃封閉2小時，洗滌甩干，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。
酶結(jié)合物工作液的制備過程為(1)用超純水配制辣根過氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M過碘酸鈉溶液4℃避光1小時，加入160mM乙二醇，室溫反應(yīng)30分鐘，加入PH4.4的醋酸緩沖液2-8℃透析過夜，換液兩次；(2)將純化的兔抗水禽IgG加入上述活化的酶中，轉(zhuǎn)移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸緩沖液中透析，4℃攪拌過夜，換液兩次；(3)透析液吸至離心管中，加現(xiàn)配的0.05M硼氫化鈉溶液，4℃反應(yīng)2小時，加入等量的飽和硫酸銨溶液4℃放置30分鐘，4℃4000rpm離心20分鐘，棄上清，瀝干，將瀝干的沉淀溶于少量PBS，裝入透析袋中，對0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃過夜；(4)收集透析袋中液體，4000rpm離心20分鐘，上清液即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗水禽IgG多克隆抗體，將其與等量甘油混和，-20℃凍存，以含0.1％BSA，0.05％吐溫-20，0.01％硫柳汞鈉，pH7.4的磷酸緩沖液按1∶200-5000稀釋凍存的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗水禽IgG多克隆抗體作為酶結(jié)合物工作液。
本發(fā)明H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒中，樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；顯色液A為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，顯色液B為含0.5‰過氧化氫尿素的檸檬酸—磷酸鹽緩沖液；終止液為2M硫酸溶液；陽性對照為經(jīng)H5亞型HA蛋白免疫獲得的H5亞型水禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(OD450nm≥1.00)加入少量紅色顏料并按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾；陰性對照為經(jīng)篩選獲得的水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾。
本發(fā)明H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其檢測程序為(1)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100μl/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)只加100μl樣品稀釋液的空白、水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清作為陰性對照、H5亞型水禽標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為陽性對照，37℃孵育20-45分鐘，甩干；(3)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；(4)每孔加100μl的酶結(jié)合物工作液，空白不加，37℃孵育20-45分鐘，甩干；(5)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；(6)依次加50μl顯色液A和50μl顯色液B，37℃避光孵育5-15分鐘；(7)加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取每孔光吸收值(OD450nm值)。
本發(fā)明H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其檢測樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)為以待檢樣本OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D450nm值的比值(P/N)，大于或等于2.2判為陽性，小于或等于1.7為陰性，介于1.7-2.2之間為可疑，須重檢；重測時P/N值大于或等于2.0判為陽性，小于2.0為陰性。
本發(fā)明有益的積極效果是操作簡單，人人都可操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如疫病監(jiān)測、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會效益。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(1)特異性強(qiáng)，敏感性高，安全性好。H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒以基因工程表達(dá)的重組HA蛋白為基礎(chǔ)制備而成；重組HA蛋白為非全病毒抗原、安全性好，不含無關(guān)雜蛋白，只與相應(yīng)亞型水禽流感病毒陽性血清特異結(jié)合，不與水禽其它疫病陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。具有良好抗原性，因此具有很高的特異性和敏感性。
(2)操作簡便快速。使用H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體檢測試劑盒檢測AIV血凝素抗體時，無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在1-2小時內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。
(3)結(jié)果判定形象、準(zhǔn)確、可靠。H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒以顯色的深淺顯示檢測結(jié)果，即檢測孔出現(xiàn)藍(lán)色顯色為陽性，中止后呈黃色，無色為陰性，結(jié)果判定形象。采用酶標(biāo)儀機(jī)讀數(shù)，減少主觀性，準(zhǔn)確可靠。
(4)成本低，投資少。H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒可批量檢測，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。


圖1是H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒檢測原理示意圖，圖中；1為酶標(biāo)板，2為AIV/H5HA抗原，3為水禽AIV/H5抗體或待檢血清，4為HRP標(biāo)記兔抗水禽IgG多克隆抗體。
圖2是重組AIV/H5HA蛋白的抗原活性鑒定結(jié)果，圖中A為重組蛋白的SDS-PAGE分析，B為重組蛋白的Western Blot鑒定，M.為蛋白質(zhì)Marker，1為大腸桿菌BL21(DE3)菌體蛋白，2為重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)菌體蛋白，3為重組質(zhì)粒誘導(dǎo)4h表達(dá)產(chǎn)物，4為純化的重組H5/HA融合蛋白，5為表達(dá)產(chǎn)物H5/HA蛋白的Westernblot具體實施方式
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，具體制備如下(1)AIV/H5重組HA蛋白的制備利用RT-PCR技術(shù)從H5亞型水禽流感基因組中擴(kuò)增部分血凝素蛋白基因序列(HA基因5’端1020bp的片段)(見圖3)，將其插入到原核表達(dá)載體PET28a的下游構(gòu)建PET-H5/HA表達(dá)載體，并用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用超聲波裂解細(xì)菌，利用商用的Ni-NTA親和層析柱純化表達(dá)的蛋白(HA)，獲得水禽流感病毒部分血凝素蛋白(圖2)，該蛋白保留了絕大部分血凝素蛋白的抗原性，可與水禽流感病毒相應(yīng)亞型血凝素抗體特異結(jié)合(圖2)。測定HA蛋白的蛋白濃度，用于間接ELISA檢測試劑盒抗體檢測板的制備。
(2)AIV/H5抗體檢測板的制備用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩沖液作包被液，將水禽流感病毒H5/HA蛋白稀釋為8μg/ml，按100μl/孔加入可拆96孔酶標(biāo)板，37℃2小時，再4℃包被過夜，用1％BSA 37℃封閉2小時，以含0.05％吐溫-20的PBS(pH7.4)洗滌液充分洗滌，甩干。再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時，置干燥室干燥后，用于H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒裝配。
(3)兔抗水禽IgG多克隆抗體的制備采取水禽全血，分離血清，以辛酸-硫酸銨沉淀法粗提水禽IgG。再經(jīng)Sephadex G200凝膠層析和DEAE纖維素離子交換層析進(jìn)一步純化，獲得IgG純品。將純化的水禽IgG蛋白按600～1000μg/kg體重皮下和肌肉注射免疫健康兔4～5次，末次免疫一周后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1∶2000以上時，心臟采血或頸動脈放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸銨沉淀法純化兔抗水禽IgG抗體，不重述，再經(jīng)DEAE纖維素離子交換層析純化，收集濃縮兔抗水禽IgG多克隆抗體，用于制備H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體檢測試劑盒酶結(jié)合物工作液。
(4)酶結(jié)合物工作液的制備用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物(HRP)酶偶聯(lián)于兔抗水禽IgG多克隆抗體。用超純水1ml溶解辣根過氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)5mg溶液，加入1ml 0.0GM過碘酸鈉溶液4℃避光1小時，加入1ml 160mM乙二醇，室溫反應(yīng)30分鐘，加入PH4.4的醋酸緩沖液2-8℃透析過夜，換液兩次。將10mg純化的兔抗水禽IgG加入上述活化的酶中，轉(zhuǎn)移至透析袋，于0.05mMPH9.6的碳酸緩沖液中透析，4℃攪拌過夜(換液兩次)。透析液吸至離心管中，加入5mg/ml的0.05M硼氫化鈉溶液0.4ml，4℃反應(yīng)2小時。加入等量的飽和硫酸銨溶液，4℃30分鐘，4℃4000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄上清，瀝干。將沉淀溶于少量PBS，裝入透析袋中，對0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃過夜。將透析液中液體吸至離心管中，離心，將上清液吸出，加等量甘油，混勻，-20℃保存。再以含0.1％BSA，0.05％吐溫-20，0.01％硫柳汞鈉的磷酸緩沖液(pH7.4)按1∶200-5000稀釋凍存的標(biāo)記酶作為酶結(jié)合物工作液。
(5)樣品稀釋液、洗滌液、終止液的配制樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐溫-20)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液(KH2PO42g，Na2HPO4·12H2O 29g，NaCl 80g，定容至1000ml，pH7.4，再加5ml吐溫-20)；終止液為2M硫酸溶液，即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。
(6)陽性對照和陰性對照的制備將用H5/HA蛋白免疫獲得的H5亞型水禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用樣品稀釋液1∶100稀釋(OD450nm≥1.00)加入少量紅色顏料并按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾，作為H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒陽性對照；將篩選獲得的水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清用樣品稀釋液1∶100稀釋(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾，作為H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒陰性對照。
(7)顯色液的配制稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，用100ml無水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液A；稱取21g一水檸檬酸，28.2g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，6.4ml 0.75％過氧化氫尿素，雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH值到4.5-5.0，配制顯色液B。
(8)試劑盒檢測操作程序其檢測程序為1)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100μl/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)空白(只加100μl樣品稀釋液)、陰性對照(水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清)、陽性對照(H5亞型水禽標(biāo)準(zhǔn)陽性血清)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；3)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；4)每孔加100μl酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37℃孵育20-45分鐘，甩干；5)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；6)依次加50μl顯色液A和50μl顯色液B，混勻，37℃避光孵育5-15分鐘；7)加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取每孔光吸收值(OD450nm值)。
(9)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn)以待檢樣本OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D450nm值比值(P/N)，大于或等于2.2判為陽性，小于或等于1.7為陰性。介于1.7-2.2之間為可疑，須重檢，重測時P/N值大于或等于2.0判為陽性，小于2.0為陰性。如果陽性對照無明顯顯色反應(yīng)，或陰性對照出現(xiàn)顯色，表明試劑盒失效或檢測操作有誤，需重新檢測。
AIV/H5重組HA蛋白制備的實施實例以下通過AIV/H5重組HA蛋白制備的實施實例進(jìn)一步描述本發(fā)明的H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒。
1.寡核苷酸引物的設(shè)計與合成根據(jù)Genebank中AIV/H5亞型的HA基因序列，針對HA基因的ORF兩端設(shè)計了5’端和3’端一對引物。5’端引物和3’端引物分別引入BamHI、Hind III酶切位點。合成以下兩條引物5’端引物5’-GCGGATCCGGTTACCATGCAAACAACTC-3’3’端引物5’-GCAAGCTTTTACTGCCATCCTCCCTCTA-3’2.病毒的繁殖、純化病毒經(jīng)尿囊腔接種于9-11日齡SPF雞胚，35℃溫箱孵育，收集24h后雞胚尿囊液，采用差速離心法純化病毒，用TEN緩沖液重懸病毒，-40℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.RT-PCR擴(kuò)增目的基因片斷采用Trizol reagent(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)提取病毒RNA，以此RNA為模板，5’端和3’端合成引物，用Reverse Transcription System kit反轉(zhuǎn)錄合成AIV/HA(H5)cDNA第一鏈；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在95℃1min、50℃45s、72℃1.5min環(huán)境下30個循環(huán)進(jìn)行PCR，最后延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析。
4.測序載體的構(gòu)建和序列測定用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接連接于PMD18-T vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選。挑取陽性克隆，分別進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。DNA自動測序儀測定AIV/HA(H5)基因核苷酸序列。AIV/HA(H5)核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列見表1。
表1AIV/HA(H5)核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.1)(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)1 GGT TAC CAT GCA AAC AAC TCA ACA GAG CAG GTT GAC ACA ATA ATG GAA AAG AAC 542 G Y H A N N S T E Q V D T I M E K N 541 GTT ACT GTT ACA CAT GCC CAA GAC ATA CTG GAA AAG ACA CAC AAC GGG AAG CTC 1082 V T V T H A Q D I L E K T H N G K L 1081 TGC GAT CTA GAT GGA GTG AAG CCT CTA ATT TTG AGA GAT TGT AGT GTA GCT GGA 1622 C D L D G V K P L I L R D C S V A G 1621 TCA CTC CTC GGA AAT CCT ATG TGT GAC GAA TTC ATC AAT GTG CCG GAA TGG TCT 2162 S L L G N P M C D E F I N V P E W S 2161 TAC ATA GTG GAG AAG GCC AAT CCA GCC AAT GAC CTC TGT TAC CCA GGG GAT TTC 2702 Y I V E K A N P A N D L C Y P G D F 2701 AAC GAC TAT GAA GAA CTG AAA CAC CTA CTG AGC AGA ATA AAC CAT TTT GAG AAA 3242 N D Y E E L K H L L S R I N H F E K 3241 ATT CAG ATC ATC CCC AAA AGT TCT TGG TCC AAT CAT GAA GCC TCA TCA GGG GTG 3782 I Q I I P K S S W S N H E A S S G V 3781 AGC TCA GCA TGT CCA TAC AAT GGG AAG TCC TCC TTT TTC AGA AAT GTG GTA TGG 4322 S S A C P Y N G K S S F F R N V V W 4321 CTT ATC AAA AAG AAC AGT GCA TAC CCA ACA ATA AAG AGG AGC TAC AAT AAT ACC 4862 L I K K N S A Y P T I K R S Y N N T 4861 AAC CAA GAA GAT CTT TTG ATA CTG TGG GGG ATT CAC CAT CCT AAT GAT GCG GCA 5402 N Q E D L L I L W G I H H P N D A A 5401 GAA CAA ACA AAG CTC TAT CAA AAC CCA ACC ACC TAT ATT TCC GTT GGA ACA TCA 5942 E Q T K L Y Q N P T T Y I S V G T S 5941 ACA CTG AAC CAG AGA TTG GTC CCA AAA ATA GCT ACT AGA TCC AAA GTA AAC GGG 6482 T L N Q R L V P K I A T R S K V N G 6481 CAA AGT GGA AGA ATG GAG TTC TTC TGG ACA ATT TTA AAG CCG AAT GAT ACC ATC 7022 Q S G R M E F F W T I L K P N D T I 7021 AAT TTC GAG AGT AAT GGA AAT TTC ATT GCT CCA GAA TAT GCA TAC AAA ATT GTC 7562 N F E S N G N F I A P E Y A Y K I V 7561 AAG AAA GGG GAC TCA GCA ATT ATG AAA AGT GAA TTG GAA TAT GGT AAC TGC AAC 8102 K K G D S A I M K S E L E Y G N C N 8101 ACC AAG TGT CAA ACT CCA ATG GGG GCG ATA AAC TCT AGC ATG CCA TTC CAC AAC 8642 T K C Q T P M G A I N S S M P F H N 8641 ATA CAC CCT CTC ACC ATC GGG GAG TGC CCC AAA TAT GTG AAA TCA AAC AGA TTA 9182 I H P L T I G E C P K Y V K S N R L 9181 GTC CTT GCG ACT GGA CTC AGA AAC ACC CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG 9722 V L A T G L R N T P Q R E R R R K K 9721 AGA GGA CTA TTT GGA GCT ATA GCA GGT TTT ATA GAG GGA GGA TGG CAG 10202 R G L F G A I A G F I E G G W Q 10205.PET/HA(H5)表達(dá)載體構(gòu)建、篩選及鑒定以PMD18/HA(H5)為模板在95℃1min、50℃45s、72℃1.5min環(huán)境下30個循環(huán)進(jìn)行PCR，最后延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳回收后，經(jīng)BamH I、Hind III雙酶切后，回收目的片段并克隆于表達(dá)質(zhì)粒PET28a的BamH I+Hind III酶切窗口中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET/HA(H5)，轉(zhuǎn)化宿主菌TOP10，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定和序列測定。
6.重組PET/HA(H5)的表達(dá)經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)宿主菌，挑取單克隆接種到含有卡鈉霉素LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例將培養(yǎng)物接種于LB培養(yǎng)基中，250rpm震蕩培養(yǎng)2小時左右，使OD600≈0.5，按1∶100的比例加入100mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時，離心收集菌體。將菌體加入適量的1×SDS上樣緩沖液，采用12％的SDS-PAGE鑒定，產(chǎn)物表達(dá)量可達(dá)10～15％。
7.重組血凝素蛋白的制備、分離純化及鑒定經(jīng)大腸桿菌菌株BL21(DE3)表達(dá)的血凝素主要以融合蛋白的形式存在，菌體經(jīng)超聲波破碎后，可以得到血凝素蛋白粗制品，進(jìn)一步用QIAGEN公司的Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)可以較快的得到血凝素蛋白純品。并以AIV/H5亞型陽性血清為一抗做Western blot，結(jié)果可檢測到表達(dá)的融合蛋白(如圖2)。
按實施例中(2)方法步驟制備H5亞型AIV血凝素抗體檢測板，按實施例中(3)(4)方法步驟制備抗體檢測試劑盒酶結(jié)合物工作液，按實施例中(5)方法步驟制備樣品稀釋液、洗滌液、終止液，按實施例中(6)方法步驟制備抗體檢測試劑盒陽性對照和陰性對照，按實施例中(7)方法步驟制備顯色液A、顯色液B，最后，將各種組成成份裝配成H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體檢測試劑盒。
使用H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒檢測水禽AIV血凝素抗體或抗體水平時，將采集分離的水禽血清，用樣品稀釋液作1∶100或梯度稀釋，制備待檢樣品溶液或梯度稀釋樣品溶液，將待檢樣品、陽性和陰性對照分別加入抗原檢測板，按實施例中(8)中操作程序，室溫作用30分鐘，洗滌液洗滌，加酶結(jié)合物工作液，室溫作用30分鐘，同上洗滌，加入顯色液A，顯色液B各50μl，室溫避光顯色5min，滴加終止液50μl終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測OD450nm值。按實施例中(9)中的判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。檢測孔OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性對照OD450nm值比值(P/N)大于或等于2.2判為陽性。對于梯度稀釋樣品則檢測孔為陽性的樣品最高稀釋度為該待檢血清的血凝素抗體滴度。如果AIV陽性對照無明顯顯色反應(yīng)，或陰性對照出現(xiàn)顯色，表明試劑盒失效或檢測操作有誤，需重新檢測。
權(quán)利要求
1.一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，試劑盒內(nèi)設(shè)有抗體檢測板，酶結(jié)合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，其特征在于抗體檢測板為包被水禽流感H5亞型血凝素蛋白(HA)的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗水禽IgG多克隆抗體，陽性對照為H5亞型水禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，陰性對照為水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所說水禽流感H5亞型血凝素蛋白(HA)為利用原核高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化的基因工程重組蛋白，可與水禽流感H5亞型血凝素抗體特異結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所說的水禽流感H5亞型血凝素蛋白的制備為利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增水禽流感血凝素蛋白基因序列，將其亞克隆于pET28a原核表達(dá)載體構(gòu)建pET/HA(H5)重組表達(dá)載體，pET/HA(H5)用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)的水禽流感病毒血凝素蛋白經(jīng)商用Ni-NTA親和層析柱獲得純化，純化的蛋白用于H5亞型水禽流感病毒陽性血清檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所說的抗體檢測板的最佳制備條件為，用pH8.5的0.05M Tris-HCl緩沖液作包被液，將水禽流感病毒血凝素蛋白稀釋為8μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，37℃2小時，再4℃包被過夜，甩干，按100μl/孔加入含1％牛血清白蛋白(BSA)，PH7.4的磷酸鹽緩沖液37℃封閉2小時，洗滌甩干，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所說的酶結(jié)合物工作液的制備過程為(1)用超純水配制辣根過氧化物酶(HRP，RZ≥3.0)溶液，加入0.06M過碘酸鈉溶液4℃避光1小時，加入160mM乙二醇，室溫反應(yīng)30分鐘，加入PH4.4的醋酸緩沖液2-8℃透析過夜，換液兩次；(2)將純化的兔抗水禽IgG加入上述活化的酶中，轉(zhuǎn)移至透析袋，于0.05mM PH9.6的碳酸緩沖液中透析，4℃攪拌過夜，換液兩次；(3)透析液吸至離心管中，加現(xiàn)配的0.05M硼氫化鈉溶液，4℃反應(yīng)2小時，加入等量的飽和硫酸銨溶液4℃放置30分鐘，4℃4000rpm離心20分鐘，棄上清，瀝干，將瀝干的沉淀溶于少量PBS，裝入透析袋中，對0.02M PBS(PH7.4)透析，4℃過夜；(4)收集透析袋中液體，4000rpm離心20分鐘，上清液即為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗水禽IgG多克隆抗體，將其與等量甘油混和，-20℃凍存，以含0.1％BSA，0.05％吐溫-20，0.01％硫柳汞鈉，pH7.4的磷酸緩沖液按1∶200-5000稀釋凍存的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所說的樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)；顯色液A為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，顯色液B為含0.5‰過氧化氫尿素的檸檬酸—磷酸鹽緩沖液；終止液為2M硫酸溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于所說的陽性對照為經(jīng)H5亞型HA蛋白免疫獲得的H5亞型水禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(OD450nm≥1.00)加入少量紅色顏料并按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾；陰性對照為經(jīng)篩選獲得的水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(OD450nm≤0.150)，按1000U/ml加入青霉素和鏈霉素，無菌過濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其檢測程序為(1)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100μl/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)只加100μl樣品稀釋液的空白、水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清作為陰性對照、H5亞型水禽標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為陽性對照，37℃孵育20-45分鐘，甩干；(3)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；(4)每孔加100μl的酶結(jié)合物工作液，空白不加，37℃孵育20-45分鐘，甩干；(5)每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍干；(6)依次加50μl顯色液A和50μl顯色液B，37℃避光孵育5-15分鐘；(7)加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取每孔光吸收值(OD450nm值)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒，其檢測樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)為以待檢樣本OD450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性O(shè)D450nm值的比值(P/N)，大于或等于2.2判為陽性，小于或等于1.7為陰性，介于1.7-2.2之間為可疑，須重檢；重測時P/N值大于或等于2.0判為陽性，小于2.0為陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種H5亞型水禽流感病毒血凝素抗體間接ELISA檢測試劑盒。試劑盒內(nèi)設(shè)有抗體檢測板，酶結(jié)合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，該試劑盒的檢測板為包被水禽流感H5亞型血凝素蛋白(HA)的可拆96孔酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為HRP標(biāo)記兔抗水禽IgG多克隆抗體，陽性對照為H5亞型水禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，陰性對照為水禽標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。本發(fā)明有益的積極效果是檢測試劑盒對水禽的特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡單，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景。
文檔編號G01N33/531GK1743848SQ20051004976
公開日2006年3月8日 申請日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
發(fā)明者周繼勇, 陳洪勛, 申會剛 申請人:浙江大學(xué)